Основы биофизики

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова Экз. № __ Кафедра биологической и медицинской физики УТВЕРЖДАЮ Заведующая кафедрой доцент Н. Новикова «____» _____________ 20__ г. Заведующая кафедрой биологической и медицинской физики, кандидат физико-математических наук, доцент, лицо гражданского персонала МО РФ Н. Новикова ЛЕКЦИЯ № 11 по дисциплине «Физика, математика» на тему: «Механизмы биоэлектрогенеза» для курсантов/студентов I курса 2, 3, 4, 7 факультетов Обсуждена и одобрена на заседании кафедры Протокол № _____ «____» _____________ 20__ г. Уточнено (дополнено): «____» _____________ 20__ г. 2 СОДЕРЖАНИЕ ПЛАНА ЛЕКЦИИ № Учебные вопросы Время п/п (согласно тематическому плану изучения дисциплины) (мин.) Введение 1. Механизм 5 возникновения потенциала покоя на 20 биологических мембранах. Формула Нернста, формула Гольдмана. 2. Механизм возникновения потенциала действия на 20 возбудимых мембранах 3. Ионные каналы клеточных мембран 20 4. Пороговые раздражители. Критический мембранный 20 потенциал. Явление рефрактерности. Выводы и заключение 5 ЛИТЕРАТУРА а) Использованная при подготовке лекции: А.Н. Ремизов. Медицинская и биологическая физика. М.: «ГЭОТАРМедиа», 2013. – 648 c. Самойлов В.О. Медицинская биофизика. СПб: Спецлит, 2013.–496 с. Антонов В.Ф., Коржуев А.В. Физика и биофизика. Курс лекций для студентов медицинских вузов. М.: Изд-во ГЭОТАР-Медиа, 2010. 240 с. Биофизика. Учебник для вузов. Под ред. Антонова В.Ф. ВЛАДОС, М.: 2006. – 288 с. Рубин А.Б. Биофизика. В 2 т. Изд-во МГУ: НАУКА, М.:2004. Физиология человека. Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса. М., Мир, 2004. Пер. с англ. В 3 т. Том 1, гл. 2, с. 26-48; гл. 3, с. 51-66. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д. и др. Молекулярная биология клетки. М., Мир, 1994. Пер. с англ. В 3-х томах. Т. 1, гл. 6, с. 396-406. 3 Камкин А.Г., Киселева И.С. Физиология и молекулярная биология мембран клеток. М.: Академия, 2008. – 592 с. б) Рекомендуемая обучаемым для самостоятельной работы: Новикова Н.Г. Курс лекций по дисциплине «Физика, математика». В 2х частях. Часть 2. Основы биофизики. Электронное учебное пособие. – СПб.: ВМедА, 2016. Лекция № 3. Самойлов В.О. Медицинская биофизика. СПб: Спецлит, 2013.–496 с. НАГЛЯДНЫЕ ПОСОБИЯ 1. Видеопрезентация ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА ОБУЧЕНИЯ 1. Компьютер 2. Мультимедийный проектор 3. Экран 4. Интерактивная доска 4 Текст лекции Введение Живые ткани обладают не только пассивными, но и активными электрическими свойствами. Генерация и распространение биопотенциалов (биоэлектрогенез) является одной из важнейших функций биологических мембран. Это явление лежит в основе возбудимости клеток, регуляции внутриклеточных мышечного процессов, сокращения, работы рецепции. нервной В системы, медицине на регуляции исследовании электрических полей, созданных за счет биопотенциалов органов и тканей, основаны диагностические методы: электрокардиография, электроэнцефалография, электромиография и другие. Предположения о существовании "животного электричества", то есть о способности живых тканей генерировать электромагнитную энергию, возникли еще в 17 веке. Однако в течение длительного времени считалось, что такой способностью наделены только специальные электрические органы некоторых представителей животного мира (электрических рыб). Экспериментальное доказательство того, что биоэлектрогенез присущ нервам и мышцам лягушки и имеет, таким образом, универсальный характер принадлежит Л. Гальвани (цикл работ 1786-1794 гг.). В ХIX веке биоэлектрические явления во многих тканях различных животных подвергались систематическим исследованиям в лабораториях Э. ДюбуаРеймона, Л. Германа, И.М. Сеченова, Н.Е. Введенского, В.Я. Данилевского и др. ученых, которые стремились не только наблюдать электрические процессы, протекающие в организме, но и вникнуть в происхождение "животного электричества". Понимание природы биоэлектрогенеза стало понятным только после появления теории электролитической диссоциации (С. Аррениус, 1887). Первая попытка применения теории электролитической диссоциации к объяснению механизмов биоэлектрогенеза принадлежит В.Ю. Чаговцу, который осуществил это в 1896 г., обучаясь на третьем курсе Военно- 5 медицинской академии. Дальнейшее изучение природы "животного электричества" привело к развитию этих представлений (работы Ю. Бернштейна, А. Ходжкина, А. Хаксли и многих других). По современным представлениям, биопотенциалы, регистрируемые в организме, - это в основном мембранные потенциалы. Мембранным потенциалом называют трансмембранную разность потенциалов, то есть разность потенциалов между наружной и внутренней сторонами мембраны. Для возникновения трансмембранной разности потенциалов необходимы два обязательных условия: 1) существование концентрационных градиентов электролитов на клеточной мембране; 2) неодинаковая проницаемость этой мембраны для катионов и анионов, на которые диссоциируют электролиты в живых тканях. 1. Механизм возникновения потенциала покоя на биологических мембранах. Формула Нернста, формула Гольдмана Потенциал покоя – это стационарная разность потенциалов между внешней и внутренней средой клетки, существующая на наружной мембране клетки в невозбужденном состоянии. Зарегистрировать эту трансмембранную разность потенциалов можно при использовании микроэлектродной техники. Стеклянный микроэлектрод представляет собой стеклянную микропипетку с оттянутым очень тонким кончиком (диаметр кончика 0,1-0,5 мкм), заполненную раствором электролита (обычно 3 М раствором KCl). Таким электродом можно проколоть наружную мембрану клетки, не повредив ее. Второй электрод (электрод сравнения) помещают в раствор у наружной поверхности клетки. Регистрирующее устройство, содержащее усилитель постоянного тока, позволяет измерить трансмембранную разность потенциалов. При этом в нервных и мышечных волокнах различных животных регистрируется разность потенциалов, равная примерно 80-90 мВ (за исключением 6 гладкомышечных клеток, потенциал покоя которых ниже (- 30 мВ), причем внутренняя поверхность клеточной мембраны имеет отрицательный потенциал по отношению к внешней. Как же реализуются обязательные условия биоэлектрогенеза на наружной мембране клетки в состоянии покоя? 1) В цитоплазме позвоночных животных преобладают калиевые соли высокомолекулярных соединений (кислот), тогда как в межклеточной среде гораздо выше концентрация натриевых солей неорганических кислот. Например, в гигантском аксоне кальмара (очень удобном для исследований биоэлектрогенеза в связи с большим диаметром) внутриклеточная концентрация К+ равна 410 ммоль/л, во внеклеточной среде – 10 ммоль/л. Соответственно, концентрация натрия составляет 49 и 460 ммоль/л. Сходные соотношения наблюдаются и в других клетках. 2) В покое проницаемость наружной мембраны клетки для ионов калия значительно больше, чем для натрия, и больше, чем для ионов хлора: РК+ >> PNa+ PK+ > PCl- Например, для аксона кальмара: 7 РК : РNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,45 Эта проницаемость обусловлена наличием в наружной мембране так называемых потенциалнезависимых каналов, избирательно пропускающих ионы калия, натрия или хлора. Если концентрация какого-либо иона внутри клетки отлична от концентрации этого иона снаружи и мембрана проницаема для этого иона, возникает поток заряженных частиц через мембрану, вследствие чего электрическая нейтральность системы нарушается, образуется разность потенциалов между наружной и внутренней средой, которая препятствует дальнейшему переносу ионов через мембрану. При установлении равновесия между концентрационным и электрическим градиентом выравниваются значения электрохимических потенциалов по разные стороны мембраны и устанавливается равновесный потенциал для этого иона, который рассчитывается по формуле Нернста. μ = μ0 + RTlnC + zFφ При равновесии: RTlnCi + zFφi = RTlnCe + zFφe Отсюда: φ равн. = φi – φe =  RT Ci ln zF Ce Если принять, что мембранный потенциал обусловлен только переносом ионов калия, то калиевый равновесный потенциал равен: φ равн. =      K RT ln  F K i < 0 (внутренняя среда имеет отрицательный e потенциал) Если рассчитать по этой формуле величину калиевого равновесного потенциала для Т = 300 К и отношения концентраций, равного 100, то она окажется равной 120 мВ, что несколько больше экспериментально измеренных значений потенциала покоя. 8 Расчеты показывают также, что для создания такого равновесного потенциала через мембрану клетки должно пройти всего 10 -4 % ионов калия от общего их содержания внутри клетки (изменение концентрации калия всего на 2.10-3 ммоль/л). Это пренебрежимое малое количество ионов по сравнению с общим их количеством в клетке. Причина расхождения рассчитанного по формуле Нернста и экспериментального значения мембранного потенциала состоит в том, что не учтена проницаемость мембраны для других ионов (натрия и хлора). Более точно с экспериментальными данными совпадает результат расчета по уравнению Гольдмана:             RT PK K  i  PNa Na  i  PCl Cl  e м   ln F PK K  e  PNa Na  e  PCl Cl  i В числителе выражения, представленного под знаком логарифма, представлены концентрации калия и натрия внутри клетки и концентрация хлора снаружи, в знаменателе – наоборот, это связано с тем, что ионы хлора заряжены отрицательно. Мембранный потенциал, рассчитанный по уравнению Гольдмана, по абсолютной величине меньше мембранного потенциала, рассчитанного по уравнению Нернста, и ближе к экспериментальным значениям. И формула Нернста, и формула Гольдмана не учитывают активного транспорта ионов через мембрану – наличия в мембране электрогенного биологического насоса – K+-Na+-АТФазы, перекачивающей калий внутрь клетки, а натрий наружу в неравновесных соотношениях. Чаще всего АТФаза работает в режиме 3Na:2K, то есть за счет работы АТФазы мембранный потенциал больше по абсолютной величине, чем мембранный потенциал, рассчитанный по уравнению Гольдмана. 9 Если прекратить поступление Na+ в клетку, например, путем замещения внеклеточного натрия на такой неспособный к диффузии катион, как холин, то МП будет близок к калиевому равновесному потенциалу. Нарушение работы K+-Na+-АТФазы приводит к уменьшению мембранного потенциала; в этом случае МП лучше описывается уравнением Гольдмана. Повреждение клеточной мембраны приводит к повышению проницаемости мембраны для всех ионов. В этом случае разница в проницаемостях сглаживается, МП уменьшается. Для сильно поврежденных клеток МП еще меньше, но отрицательный мембранный потенциал сохраняется за счет наличия в клетке полианионов – отрицательно заряженных белков, нуклеиновых кислот и других крупных молекул, которые не могут проникнуть через мембрану (доннановский потенциал). 2. Механизм возникновения потенциала действия на возбудимых мембранах Потенциалом действия называется кратковременное изменение трансмембранной разности потенциалов на наружной мембране нервных и мышечных клеток при их возбуждении. В опытах по изучению потенциала действия используют два микроэлектрода, введенных в мышечную или нервную клетку. На первый микроэлектрод подают импульсы от генератора прямоугольных импульсов, изменяющие мембранный потенциал. Мембранный потенциал измеряют при помощи второго микроэлектрода высокоомным регистратором напряжения. Потенциалы действия регистрируются на мембране мышечной или нервной клетки только в том случае, если прямоугольный импульс уменьшает трансмембранную разность потенциалов (является деполяризующим) и имеет достаточную величину (то есть его амплитуда превышает некоторое минимальное (пороговое) значение). При этом на 10 мембране регистрируются следующие изменения трансмембранной разности потенциалов (см. схему). Трансмембранная разность потенциалов вначале падает до нуля, затем на непродолжительное время полярность мембраны изменяется (внутренняя поверхность мембраны приобретает положительный потенциал), после чего восстанавливается исходный уровень потенциала покоя. Соответственно, выделяют две фазы потенциала действия – фазу деполяризации и фазу реполяризации. Положительное значение мембранного потенциала носит название потенциала инверсии (реверсии). В нервных волокнах длительность потенциала действия равна примерно 1 мс; в скелетных мышцах – примерно 10 мс. Характерные свойства потенциала действия: 1) наличие порогового значения деполяризующего стимула; 2) закон "всё или ничего" – если деполяризующий импульс больше порогового, то развивается потенциал действия, амплитуда которого не зависит от амплитуды возбуждающего импульса; если деполяризующий импульс меньше порогового, то потенциала действия нет; 3) во время развития потенциала действия наблюдается явление рефрактерности (невозбудимости) мембраны; 4) в момент возбуждения резко уменьшается сопротивление мембраны. Опыты по изучению механизма возникновения потенциала действия показали, что: 11 а) можно изменять амплитуду потенциала действия, изменяя концентрацию натрия в наружной среде (при уменьшении концентрации натрия амплитуда ПД уменьшается; если из окружающей клетку среды полностью удалить натрий, ПД вообще не возникает); б) при возбуждении резко возрастает проницаемость мембраны для ионов натрия (показано в опытах с радиоактивным изотопом натрия). Если в состоянии покоя соотношение коэффициентов проницаемости мембраны аксона кальмара для разных ионов: РК : РNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,45 то в состоянии возбуждения РК : РNa : PCl = 1 : 20 : 0,45. Таким образом, по сравнению с невозбужденным состоянием, при возбуждении коэффициент проницаемости для натрия возрастает в 500 раз. Это изменение проницаемости связано с тем, что в мембранах мышечных и нервных клеток, способных генерировать ПД (так называемых возбудимых мембранах), имеются особые, так называемые потенциалзависимые натриевые каналы. В экспериментах, проведенных Ходжкином, Хаксли, Бейкером, Шоу, было показано, что первая фаза ПД (фаза деполяризации) связана с потоком ионов натрия из окружающей среды (где их концентрация больше) в клетку (где их концентрация меньше) через потенциалзависимые натриевые каналы. Следует отметить, что на первых порах (пока мембранный потенциал отрицателен) электрический градиент способствует входу натрия в клетку. После достижения нулевого значения трансмембранной разности потенциалов входящий поток ионов натрия не прекращается (так как сохраняется концентрационный градиент ионов натрия на мембране), и он будет продолжаться до достижения натриевого равновесного потенциала (выравнивания значений электрохимического потенциала по обе стороны мембраны). 12 Таким образом, величину потенциала инверсии можно рассчитать по формуле Нернста: ПИ = φ равн. Na =    Na  RT ln F Na    i >0 e Общая же амплитуда ПД будет равна: |ПД| = |ПП| + |ПИ| Итак, первая фаза ПД (фаза деполяризации) связана со входящим током ионов натрия. Почему же мембранный потенциал не фиксируется на уровне ПИ, а возвращается к исходному уровню потенциала покоя? Это связано с двумя причинами: 1) Каждый натриевый потенциалзависимый канал открывается только на определенное время (время открытого состояния канала; это время в среднем равно 0,7 мс); существует также время, в течение которого велика вероятность открывания отдельного канала (время жизни каналов; для натриевых каналов оно равно примерно 2 мс). Таким образом, надпороговый стимул увеличивает вероятность открывания каналов (идет процесс их активации). По прошествии времени жизни каналов вероятность их открывания падает до нуля, и этот процесс называется инактивацией натриевого тока. 2) Наряду с натриевыми потенциалзависимыми каналами, в возбудимых мембранах существуют также калиевые потенциалзависимые каналы. Эти каналы имеют среднее время открытого состояния порядка 5 мс, и, в отличие от натриевых каналов, они не инактивируются, пока мембранный потенциал выше порогового значения. Динамика изменений проводимости мембраны для ионов натрия и калия показана на таблице. Таким образом, к моменту, когда входящий ток натрия прекращается, проницаемость мембраны для ионов калия достигает максимума, и развивается выходящий калиевый ток, возвращающий мембранный потенциал к исходному уровню. Следует отметить, что вначале, когда внутренняя сторона мембраны имеет положительный потенциал, электрический градиент способствует выходящему калиевому току. 13 Итак, первая фаза потенциала действия обусловлена входящим током ионов натрия через натриевые потенциалзависимые каналы, а вторая – выходящим током ионов калия через калиевые теории Ходжкина-Хаксли потенциалзависимые каналы. 3. Ионные каналы клеточных мембран. Модель возбудимой мембраны по предполагает регулируемый перенос ионов через мембрану. Однако непосредственный переход иона через липидный бислой весьма затруднен. Для ионов натрия и калия величина потенциального барьера, который необходимо преодолеть при переходе из цитоплазмы в мембрану составляет 350-400 кДж/моль (для сравнения, энергия теплового движения при температуре 300 К составляет всего 2,4 кДж/моль). Вероятность такого перехода Р ~ е-160. Это и ряд других соображений дали основание считать, что в мембране должны быть специальные структуры, проводящие ионы. Такие структуры были выделены и названы ионными каналами. Основные свойства ионных каналов: 1. Селективность – способность ионных каналов избирательно пропускать ионы какого-либо одного типа. Измерения показали, что ионные каналы обладают абсолютной селективностью по отношению к катионам (катион-селективные каналы) либо анионам (анион-селективные каналы). В то же время через катион-селективные каналы могут проходить разнообразные катионы, но проводимость мембраны для неосновного иона будет существенно ниже (относительная селективность). Например, калиевый ток через натриевый канал будет в 20 раз меньше, чем натриевый (относительная селективность для калия равна 0,05). Селективность канала определяется наличием селективного фильтра, образованного отрицательно заряженными атомами кислорода, жестко расположенными на определенном расстоянии и пропускающими ионы только определенного диаметра. 14 Подходящий по размеру ион проходит через селективный фильтр без гидратной оболочки; слишком крупные ионы не могут пройти через селективный фильтр; мелкие ионы имеют трудности, связанные с потерей гидратной оболочки. 2. Независимость работы отдельных каналов. Прохождение тока через отдельный ионный канал не зависит от того, идет ли то через другие каналы. Например, К+-каналы могут быть включены или выключены, но ток через Na-каналы не изменяется. Влияние каналов друг на друга происходит опосредованно: изменение проницаемостей каких-либо каналов (например, натриевых) изменяет мембранный потенциал, а уже он, в свою очередь, влияет на проводимости прочих ионных каналов. 3. Дискретный характер проводимости отдельных каналов – ионные каналы представляют собой субъединичный комплекс белков, пронизывающий мембрану. При этом проводимость канала дискретна и он может находиться в двух состояниях – открытом или закрытом. Переходы между состояниями происходят в случайные моменты времени и подчиняются статистическим закономерностям. Нельзя сказать, что данный канал откроется именно в данный момент времени. Можно говорить лишь о вероятности открывания канала в определенном интервале времени. 4. Зависимость параметров канала от мембранного потенциала. Натриевый и калиевый потенциалзависимые каналы имеют сенсоры – некоторый элемент белковой молекулы, чувствительный к действию электрического поля. При изменении мембранного потенциала изменяется величина действующей на сенсор силы, в результате эта часть канала перемещается и меняет вероятность открывания или закрывания ворот – своеобразных заслонок, действующих по закону "всё или ничего". Экспериментально показано, что под действием деполяризации мембраны увеличивается вероятность перехода натриевого канала в проводящее состояние. Скачок напряжения приводит к тому, что большое число каналов 15 открывается, через них проходит большее число зарядов, а значит, протекает и больший ток. Существование ворот было доказано в опытах с регистрацией так называемых "воротных токов" (очень слабых токов, которые в 103 раз слабее натриевого тока через канал). 4. Пороговые раздражители. Критический мембранный потенциал. Явление рефрактерности. Как уже упоминалось выше, возбудимые мембраны генерируют потенциал действия только при действии на них электрических импульсов определенной величины – пороговых и надпороговых раздражителей. Минимальный импульс напряжения, способный вызвать потенциал действия на возбудимой мембране, носит название порогового раздражителя. Этот импульс сдвигает мембранный потенциал до определенного уровня, называемого критическим мембранным потенциалом. Uп = |ПП| - |КМП| Как уже было сказано, под действием деполяризации мембраны увеличивается вероятность перехода натриевого канала в проводящее состояние. Постепенно число открытых каналов растет и входящий натриевый ток увеличивается. Одновременно увеличивается выходящий калиевый ток через калиевые потенциалнезависимые каналы, но натриевый ток все же растет быстрее. 16 Уровень трансмембранной разности потенциалов, при котором входящий натриевый ток начинает превышать выходящий калиевый, носит название критического мембранного потенциала. Начиная с этого уровня, процесс развития потенциала действия становится необратимым (начинается "лавинообразное" открытие натриевых каналов): входящий натриевый ток деполяризует мембрану → деполяризация мембраны повышает вероятность открытия натриевых каналов → открываются каналы → увеличивается входящий натриевый ток. В этот период возбудимая мембрана не чувствительна к воздействию внешних стимулов, наступает фаза абсолютной рефрактерности, примерно соответствующая по длительности фазе деполяризации потенциала действия. После завершения фазы деполяризации вероятность открытия натриевых каналов постепенно повышается. Этот период называется фазой относительной рефрактерности (примерно соответствует по длительности реполяризации до уровня КМП). Далее могут следовать: а) фаза следовой деполяризации (экзальтации) (в этот период вероятность открытия натриевых каналов уже высока, а мембранный потенциал сдвинут по направлению к КМП); б) фаза следовой гиперполяризации (МП сдвинут ниже уровня потенциала покоя). 17 Выводы и заключение Таким образом, в ходе нашей лекции мы познакомились о двумя основными биоэлектрическими феноменами - потенциалом покоя и потенциалом действия – и механизмами их возникновения. Эти феномены лежат в основе деятельности двух важнейших систем организма – нервной и мышечной систем. Мы убедились в том, что эти биопотенциалы неразрывно связаны с мембраной клетки и что в основе их лежит неодинаковая проницаемость мембраны для катионов и анионов, на которые диссоциируют электролиты в живых тканях. Определяющую роль в возникновении потенциала покоя играет пассивный транспорт ионов калия через калиевые потенциалнезависимые каналы, а в возникновении потенциала действия – пассивный транспорт ионов натрия (на стадии деполяризации) и ионов калия (на стадии представления реполяризации) были через потенциалзависимые экспериментально подтверждены каналы. в Эти опытах с использованием микроэлектродной техники и специфических ингибиторов натриевых (тетродотоксин) и калиевых (тетраэтиламмоний) каналов. На следующей лекции вы узнаете, каким образом происходит распространение потенциалов действия по мембранам, т.е. каким образом происходит передача информации в нервной системе и от нервов к мышцам. Исполнитель Доцент Н. Новикова