Методы анализа качества витаминов

Классификация витаминов

Общие свойства витаминов:

• ключевые факторы нормального метаболизма в организме;
• биосинтез витаминов происходит вне человеческого организма, их недостаток в организме восполняется за счет сбалансированного питания;
• нарушение усвоения и/ или поступления витаминов в организм ведет к развитию патологических процессов (гипо- и авитаминозов);
• витамины являются высокоактивными соединениями, активность которых проявляется в микродозах;
• у каждого витамина есть свои особенности участия в метаболизме, между разными витаминами наблюдается взаимное влияние на проявление биологического действия друг друга.

Все витамины делятся на жирорастворимые (ретинол, эргокальциферол, токоферол, филлохинон, фарнохинон) и водорастворимые (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, ниацин, пантотеновая кислота, фолиевая кислота, кобаламин, аскорбиновая кислота, биофлавоноиды, липоевая кислота).

Биохимические группы витаминов:

• энзимовитамины — витамины группы В, РР, пантотеновая кислота, фолиевая кислота и др.;
• витамины-антиоксиданты — А, С, Е, липоевая кислота;
• гормоновитамины — А, D.

Между витаминами существует определенное взаимодействие. В процессе метаболизма отдельно взятый витамин не изолирован от влияния на него других витаминов, что отражается на проявлении конечного эффекта каждого витамина.

Методы количественного определения витаминов

Основные методы определения витаминов в продуктах и лекарственных формах:

• ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматографии);
• спектрофотометряи (в фиолетовой и видимой областях);
• титриметрия.

Определение ретинола, токоферола и каротиноидов основано на экстракции витаминов органическим растворителем после омыления субстрата или непосредственного его упаривания и переносе сухого остатка в другой растворитель, введения экстракта в хроматографическую колонку для разделения с последующим определением с использованием флюоресцентного и спектрофотометрического детекторов. Определение массовой концентрации микронутриентов основано на измерении высоты (или площади) пика при определенной длине волны, соответствующей каждому соединению, с последующим детектированием анализируемых проб и градуировочных растворов, помещенных в хроматографическую систему.

Водорастворимые витамины определяют чувствительным и одновременно селективным методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием при соблюдении режима электрораспылительной ионизации с одновременной регистрацией положительных ионов.

При данном методе достаточно отделить пики витаминов от слабоудерживаемых и неудерживаемых соединений, элюирующихся с небольшими промежутками удерживания. Отсутствие необходимости полностью выделять отдельно витамины позволяет применять в хроматографии колонки небольшого размера, уточнить пределы обнаружения и значительно сократить время исследования.

Эффективное разделение витаминов происходит при увеличении рН ацетатно-аммонийных буферных растворов до 4-7, при этом пики отдельных витаминов раздваиваются (тиамин, пиридоксамин, никотинамид, фолиевая кислота, рибофлавинфосфат).

Наилучшего соотношения сигнал/ шум добиваются в режиме электрораспылительной ионизации с регистрацией положительных ионов. Для достижения лучших пределов обнаружения используют программированное изменение напряжения на фрагменторе. Для предотвращения разрушения витаминов А, Е, каротиноидов анализ проводят в присутствии аскорбиновой кислоты, выполняющей роль антиоксиданта, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света. Количественное определение витаминов проводят методом абсолютной калибровки, для чего проводят определение градуировочного коэффициента.

Для определения качества жирорастворимых витаминов A, D и E приготавливают стандартный и испытуемый растворы, после чего их последовательно хроматографируют. Операцию проводят минимум 2 раза. Условия детектирования определяются составом анализируемого вещества и используемым оборудованием. Определение каждого витамина можно проводить отдельно, детектируя витамин D при 265 нм, витамин E — при 292 нм и витамин A — при 326 нм. Возможно одновременное определение витаминов A и E, проводя детектирование при 300 нм.

Ретинол, фитоменадион, β-каротин определяют с помощью спектрофотометрии. Спектрофотометрия — метод анализа, в основе которого лежит измерение спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения. Проводится сравнение интенсивности света внешнего источника, падающего на образец и прошедшего через него. В основе метода лежит закон Бугера-Ламберта-Бера.

Рибофлавин определяют флуориметрическим методом путем титрования рибофлавинсвязывающим апобелком. Принцип метода основан на способности апобелка при связывании с витамином полностью тушить его флуоресценцию.

Определение витамина С основано на исследовании непосредственно аскорбиновой кислоты без учета окисленной формы витамина С — дегидроаскорбиновой кислоты. Для анализа наиболее доступным является метод титрования с использованием количественного окисления аскорбиновой кислоты раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Данный метод применим только для объектов исследования, дающих светлоокрашенные экстракты. В иных случаях используют спектрофотометрические, флуорометрические методы анализа, метод потенциального титрования, применимые для любых объектов исследования.

Определение витамина С в образцах, дающих слабоокрашенные или неокрашенные экстракты основано на экстрагировании аскорбиновой кислоты (ее солей) раствором одной из кислот (щавелевой, соляной, метафосфорной, трихлоруксусной, смесью метафосфорной и уксусной кислот) с последующим титрованием раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до установления светло-розовой окраски.