Принцип работы светового микроскопа

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова Экз. № __ Кафедра биологической и медицинской физики УТВЕРЖДАЮ Заведующая кафедрой доцент Н. Новикова «____» _____________ 20__ г. Заведующая кафедрой биологической и медицинской физики, кандидат физико-математических наук, доцент, лицо гражданского персонала МО РФ Н. Новикова ЛЕКЦИЯ № 15 по дисциплине «Физика, математика» на тему: «Дифракция электромагнитных волн. Физические основы световой микроскопии» для курсантов/студентов I курса 2, 3, 4, 7 факультетов Обсуждена и одобрена на заседании кафедры Протокол № _____ «____» _____________ 20__ г. Уточнено (дополнено): «____» _____________ 20__ г. СОДЕРЖАНИЕ ПЛАНА ЛЕКЦИИ № Учебные вопросы п/п Время (согласно тематическому плану изучения дисциплины) (мин.) Введение 5 1. Дифракция света. Дифракционная решетка 15 2. Назначение и устройство светового биологического 15 микроскопа 3. Оптическая система биологического микроскопа 10 4. Разрешающая 10 способность и предел разрешения микроскопа. Дифракционные явления в микроскопе, понятие о теории Аббе. 5. Полезное увеличение микроскопа 10 6. Аберрации оптических систем 10 7. Некоторые специальные приемы световой микроскопии 10 Выводы и заключение 5 ЛИТЕРАТУРА а) Использованная при подготовке лекции: Медицинская и биологическая физика: Учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко – М.: Изд-во ГЭОТАР-Медиа, 2013 – 560 c. Антонов В.Ф., Коржуев А.В. Физика и биофизика. Курс лекций для студентов медицинских вузов. М.: Изд-во ГЭОТАР-Медиа, 2010. 240 с. Каганов В.И. Колебания и волны в природе и технике. М.: «Горячая линия-Телеком», 2008. – 336 с. Горелик Г.С. Колебания и волны: Введение в акустику, радиофизику и оптику. Учебное пособие для вузов. №-е изд. М.: Физматлит, 2007. – 656 с. Фейнман Р., Лейтон Р., Сэндс М. Фейнмановские лекции по физике. Т. 6. Электродинамика. М.: Изд-во ЛКИ, 2008. Егорова О.В. С микроскопом на «ты». Шаг в XXI век. Световые микроскопы для биологии и медицины. М.: РепроЦЕНТР М, 2006. 406 с. Егорова О.В. Техническая микроскопия. С микроскопом на «ты». М.: Техносфера, 2007. 357 с. Пантелеев В., Егорова О., Клыкова Е. Компьютерная микроскопия. М.: Техносфера, 2005. 300 с. Кларк Э.Р., Эберхардт К.Н. Микроскопические методы исследования материалов. М.: Техносфера, 2007. 376 с. б) Рекомендуемая обучаемым для самостоятельной работы: Медицинская и биологическая физика: учебник / А.Н. Ремизов – 4-е изд., испр. и перераб. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 648 c. Новикова Н.Г. Курс лекций по дисциплине «Физика, математика». В 2х частях. Часть 1. Медицинская физика. Электронное учебное пособие. – СПб.: ВМедА, 2016. Лекция 7. НАГЛЯДНЫЕ ПОСОБИЯ 1. Видеопрезентация ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА ОБУЧЕНИЯ 1. Компьютер 2. Мультимедийный проектор 3. Экран 4. Интерактивная доска Текст лекции Введение Невозможно точно определить, кто изобрёл микроскоп. Считается, что голландский мастер очков Ханс Янсен и его сын Захарий Янсен изобрели первый микроскоп в 1590, но это было заявление самого Захария Янсена в середине XVII века. Дата, конечно, не точна, так как оказалось, что Захария родился около 1590 г. Другим претендентом на звание изобретателя микроскопа был Галилео Галилей. Он разработал «occhiolino» («оккиолино»), или составной микроскоп с выпуклой и вогнутой линзами, в 1609 г. Галилей представил свой микроскоп публике в Академии деи Линчеи, основанной Федерико Чези в 1603 г. Изображение трёх пчел Франческо Стеллути было частью печати Папы Урбана VIII и считается первым опубликованным микроскопическим символом (см. «Stephen Jay Gould, The Lying stones of Marrakech, 2000»). Десятью годами позже Галилея Корнелиус Дреббель изобретает новый тип микроскопа, с двумя выпуклыми линзами. Кристиан Гюйгенс, другой голландец, изобрел простую двулинзовую систему окуляров в конце 1600-х, которая ахроматически регулировалась и, следовательно, стала огромным шагом вперед в истории развития микроскопов. Окуляры Гюйгенса производятся и по сей день, но им не хватает широты поля обзора, а расположение окуляров неудобно для глаз по сравнению с современными широкообзорными окулярами. В 1665 году англичанин Роберт Гук сконструировал собственный микроскоп и опробовал его на пробке. В результате этого исследования появилось название «клетки». Антон Ван Левенгук (1632—1723) считается первым, кто сумел привлечь к микроскопу внимание биологов, несмотря на то, что простые увеличительные линзы уже производились с 1500-х годов, а увеличительные свойства наполненных водой стеклянных сосудов упоминались ещё древними римлянами (Сенека). Изготовленные вручную, микроскопы Ван Левенгука представляли собой очень небольшие изделия с одной очень сильной линзой. Они были неудобны в использовании, однако позволяли очень детально рассматривать изображения лишь из-за того, что не перенимали недостатков составного микроскопа (несколько линз такого микроскопа удваивали дефекты изображения). Понадобилось около 150 лет развития оптики, чтобы составной микроскоп смог давать такое же качество изображения, как простые микроскопы Левенгука. Так что, хотя Антон Ван Левенгук был великим мастером микроскопа, он не был его изобретателем вопреки широко распространённому мнению. Понимание принципа работы светового микроскопа невозможно без знания такого явления волновой оптики, как дифракция. Именно дифракция световых волн ограничивает разрешающую способность микроскопа. Поэтому начнем мы сегодняшнюю лекцию с изучения дифракции. 1. Дифракция света. Дифракционная решетка. Дифракция света – явление отклонения света от прямолинейного распространения при встрече с препятствием, когда свет, огибая препятствие, заходит в область его геометрической тени. Опыт Юнга: В непрозрачном экране на небольшом расстоянии друг от друга имеются два маленьких отверстия S1 и S2. Эти отверстия освещаются узким световым пучком, прошедшим в свою очередь через малое отверстие S в другом экране. Если бы не было явления дифракции, то мы должны были бы увидеть только светлое пятно от отверстия S на втором экране. На самом деле наблюдается устойчивая интерференционная картина на третьем экране (чередующиеся светлые и темные полосы). Явление дифракции можно объяснить на основе принципа ГюйгенсаФренеля. Согласно Гюйгенсу, все точки поверхности, которой достигла в данный момент волна, являются центрами вторичных сферических волн. При этом в однородной среде вторичные волны излучаются только вперед. Согласно Френелю, волновая поверхность в любой момент времени представляет собой результат интерференции когерентных вторичных волн. Объяснение опыта Юнга Возникшая в соответствии с принципом Гюйгенса-Френеля сферическая волна от отверстия S возбуждает в отверстиях S1 и S2 когерентные колебания. Вследствие дифракции из отверстий S1 и S2 выходят два световых конуса, которые частично перекрываются и интерферируют. В результате интерференции световых волн на экране появляются чередующиеся светлые и темные полосы. При закрывании одного из отверстий интерференционные полосы исчезают. Дифракция обнаруживается в непосредственной близости от препятствия только в том случае, когда размеры препятствия соизмеримы с длиной волны (для видимого света λ ~ 100 нм). Дифракция света на одномерной дифракционной решетке. Дифракционная решетка – оптическое устройство, представляющее собой совокупность большого числа параллельных, равноотстоящих друг от друга щелей одинаковой ширины. Число штрихов может доходить до 2000-3000 тысяч на 1 мм. Прозрачные дифракционные решетки изготавливают из прозрачного твердого вещества, например, плоскопараллельных стеклянных или кварцевых пластинок. Алмазным резцом наносят штрихи. Там, где прошелся резец, образуется непрозрачная поверхность, рассеивающая свет. Промежутки между штрихами играют роль щелей. Отражательные дифракционные решетки представляют собой зеркальную (металлическую) поверхность, на которую нанесены параллельные штрихи. Световая волна рассеивается штрихами на отдельные когерентные пучки, которые, претерпев дифракцию, на штрихах, интерферируют. Результирующая интерференционная картина образуется в отраженном свете. Если ширина прозрачных щелей (или отражательных полос) равна а, а ширина непрозрачных промежутков (или рассеивающих свет полос) b, то величина d  ab называется периодом или постоянной дифракционной решетки. Рассмотрим дифракцию на прозрачной дифракционной решетке. Пусть на решетку падает плоская монохроматическая волна длиной . Для наблюдения дифракции на близком расстоянии за решеткой помещают собирающую линзу и за ней экран на фокусном расстоянии от линзы. В каждой точке фокальной плоскости линзы происходит интерференцияN волн, приходящих в эту точку от N щелей решетки. Это так называемая многоволновая или многолучевая интерференция. Выберем некоторое направление вторичных волн под углом φ относительно нормали к решетке. Лучи, идущие от крайних точек двух соседних щелей, имеют разность хода   AC  AB sin   d sin  . Такая же разность хода будет для вторичных волн, идущих от других пар точек соседних щелей, отстоящих на расстояние d друг от друга. Если эта разность хода кратна целому числу длин волн, то при интерференции возникнут главные максимумы: d sin   k – основная формула дифракционной решетки, где k = 0, 1, 2… - порядок главных максимумов. На экране наблюдаются узкие одноцветные линии (в зависимости от цвета падающей волны). Линия под углом φ = 0 называется спектральной линией первого порядка (k = 0) по обе стороны от нее симметрично расположены спектральные линии первого порядка (k = 1, k = -1), второго порядка (k = 2, k = -2) и т.д. Интенсивность этих линий в N2 раз больше интенсивности, создаваемой в направлении φ одной щелью. С ростом k спектральные линии становятся менее яркими и перестают наблюдаться вовсе. Максимально наблюдаемое число линий ограничивается по следующим причинам. Во-первых, с ростом угла φ уменьшается интенсивность света, испускаемого отдельной щелью. Вовторых, даже очень узкие щели с шириной близкой к λ, не могут отклонять свет под углом большим, чем π/2. Поэтому, m  d sin    d sin  π 2 d.  Увеличение числа щелей не меняет положения главных максимумов, но делает их более интенсивными. При наклонном падении света под углом , условие главных максимумов имеет вид: d (sin  sin  )  m . Между главными максимумами появляются добавочные минимумы, число которых равно N – 1, где N – общее число щелей решетки. (На рис. слева для N = 8 и N = 16 нарисованы не все добавочные минимумы). Они появляются за счет взаимной компенсации волн от всех N щелей. Чтобы N волн погасили друг друга, разность фаз должна отличаться на 2π/N. А оптическая  разность хода, соответственно, должна быть равна  2    . Направления добавочных минимумов определяются 2 2N N условием dsi n   k  , где k принимает целочисленные значения кроме 0, N N, 2N, 3N,…, то есть тех, при которых данное условие переходит в основную формулу дифракционной решетки. Между добавочными минимумами находится N – 2 добавочных максимумов, интенсивность которых очень слаба. При нормальном освещении решетки белым светом на экране наблюдается белый центральный максимум нулевого порядка, а по обе стороны от него – дифракционные спектры 1-го, 2-го и т.д. порядков. Спектры имеют вид радужных полосок, в которых наблюдается непрерывный переход от фиолетового цвета у внутреннего края спектра к красному цвету у внешнего края. Со спектров 2-го и 3-го порядков начинается их частичное перекрывание (т.к. выполняется условие m   m  ). 11 2 2 Таким образом, решетка является спектральным устройством, который можно использовать в различных оптических приборах, например, в дифракционных спектрофотометрах, в качестве монохроматоров, т.е. устройств, позволяющих освещать объект светом в узком диапазоне длин волн. Дифракционная решетка может быть использована для определения длины волны света (по основной формуле дифракционной решетки). С другой стороны, основная формула дифракционной решетки может быть использована для решения обратной задачи – нахождения постоянной дифракционной решетки по длине волны. Этот способ лег в основу рентгеноструктурного анализа – измерения параметров кристаллической решетки посредством дифракции рентгеновских лучей. В настоящее время широко используют рентгеноструктурный анализ биологических молекул и систем. Именно этим методом Дж. Уотсон и Ф. Крик установили структуру молекулы ДНК (двойная спираль) и были удостоены в 1962 г. Нобелевской премии. 2. Назначение и устройство светового биологического микроскопа Микроскоп - это оптический прибор, предназначенный для изучения малых (микроскопических) объектов, путем замены исследуемого предмета его увеличенным изображением. Заменяя предмет увеличенным изображением, мы тем самым увеличиваем угол зрения (зрительный угол) на предмет и изображение предмета на сетчатке глаза. Углом зрения называют угол между лучами, идущими от крайних точек к предмета к оптическому центру глаза. Наименьший угол зрения, при котором человеческий глаз еще различает две точки предмета, примерно равен 1′, что соответствует расстоянию между точками, равному 70 мкм, если эти точки находятся на расстоянии наилучшего зрения (25 см; это минимальное расстояние, при котором аккомодация («наводка глаза на резкость») еще осуществляется без напряжения). Размер изображения на сетчатке в этом случае равен 5 мкм, что соответствует засветке двух фоторецепторов, разделенных одним незасвеченным. Если изображение двух точек на сетчатке будет короче 5 мкм, то эти точки не разрешатся, то есть глаз их не различит. Таким образом, возможность разрешения деталей предмета зависит от размеров его изображения на сетчатке глаза или от угла зрения. Угол зрения можно увеличить, приблизив предмет к глазу, однако это связано с некоторыми ограничениями: 1) в ряде случаев технически невозможно изменить расстояние между предметом и глазом (например, при рассматривании звезд или Солнца); 2) возможности аккомодации глаза ограничены, т.е. предмет невозможно приблизить на расстояние, меньшее расстояния до ближней точки глаза. В связи с этим для увеличения угла зрения используют оптические приборы: телескопы, лупы, микроскопы. Устройство биологического микроскопа. Световой микроскоп состоит из трех частей: оптической, механической и осветительной. 1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 - винт грубой наводки, 5 микрометрический винт, 6 - подставка, 7 - зеркало, 8 - конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр, 9 - предметный столик, 10 - револьверное устройство, 11 – объектив. Соответственно, тубус, тубусодержатель, предметный столик, подставка, винт грубой наводки, микрометрический винт, револьверное устройство относятся к механической части; источник света, зеркало, конденсор, ирисовая диафрагма и светофиьтр – к осветительной части; объектив и окуляр – к оптической части. 3. Оптическая система биологического микроскопа. В простейшем случае оптическая система микроскопа представляет собой комбинацию двух линз: объектива и окуляра. Линза, обращенная к предмету («объекту»), называется объективом. Линза, обращенная к глазу («оку») наблюдателя, называется окуляром. В современных оптических микроскопах объектив и окуляр представляют собой системы линз, образующих центрированную оптическую систему. Это значит, что оптические центры окуляра и объектива лежат на одной прямой, которая называется главной оптической осью. Прежде чем мы перейдем к анализу хода лучей в микроскопе, вспомним некоторые понятия геометрической оптики: 1) Каждой точке или линии пространства предметов соответствует только одна точка или линия пространства изображений. Эти пары точек или линий называют сопряженными. 2) Луч света, входящий в систему (линзу), параллельно главной оптической оси, после преломления проходит через определенную точку на главной оптической оси, которая называется фокусом линзы. Соответственно, каждая линза имеет два фокуса – передний и задний. Плоскости, проведенные через фокусы перпендикулярно главной оптической оси, называются фокальными. Расстояние от оптического центра линзы до фокуса носит название фокусного расстояния. 3) Лучи света, проходящие через оптический центр линзы, не преломляются. Теперь нарисуем ход лучей в световом микроскопе: Ход лучей в световом микроскопе Предмет h помещают несколько дальше переднего фокуса объектива. Объектив дает действительное, обратное, увеличенное изображение H’, находящееся между передним фокусом окуляра и оптическим центром окуляра. Это промежуточное изображение рассматривается в окуляр как в лупу. Окуляр дает мнимое, прямое, увеличенное изображение H, которое расположено на расстоянии наилучшего зрения S ≈ 25 см от оптического центра глаза. Это изображение мы рассматриваем глазом, на его сетчатке формируется действительное, обратное, уменьшенное изображение. Увеличение микроскопа – отношение размеров мнимого изображения к размерам рассматриваемого через микроскоп предмета:   H . Умножим h числитель и знаменатель на размер промежуточного изображения H’:  H H  об ок . h H Таким образом, увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Увеличение объектива можно выразить через характеристики микроскопа, используя подобие прямоугольных треугольников об  H  f L  Fоб L    , где L  h d Fоб Fоб оптическая длина тубуса: расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра (считаем, что L >> Fоб). Увеличение окуляра ок  H S LS  . Следовательно, увеличение микроскопа равно:   . H  Fок Fоб Fок 4. Разрешающая способность и предел разрешения микроскопа. Дифракционные явления в микроскопе, понятие о теории Аббе. Предел разрешения микроскопа z – это наименьшее расстояние между двумя точками рассматриваемого в микроскоп объекта, когда эти точки еще воспринимаются отдельно. Предел разрешения обычного биологического микроскопа лежит в диапазоне 34 мкм. Разрешающей способностью микроскопа называют способность давать раздельное изображение двух близко расположенных точек исследуемого объекта, то есть это величина, обратная пределу разрешения. Дифракция света налагает предел на возможность различения деталей объектов при их наблюдении в микроскоп. Так как свет распространяется не прямолинейно, а огибает препятствия (в данном случае, рассматриваемые объекты), то изображения мелких деталей объектов получаются размытыми. Э. Аббе предложил дифракционную теорию разрешающей способности микроскопа. Пусть предметом, который мы хотим рассмотреть в микроскоп, будет дифракционная решетка с периодом d. Тогда минимальная деталь предмета, которую мы должны различить, как раз и будет периодом решетки. На решетке происходит дифракция света, но диаметр объектива микроскопа ограничен, и при больших углах дифракции не весь свет, прошедший через решетку, попадает в объектив. Реально свет от предмета распространяется к объективу в некотором конусе. Получаемое изображение тем ближе к оригиналу, чем больше максимумов участвует в формировании изображения. Свет от предмета распространяется к объективу от конденсора в виде конуса, который характеризуется угловой апертурой u – угол, под которым виден объектив из центра рассматриваемого предмета, то есть угол между крайними лучами конического светового пучка, входящего в оптическую систему. Согласно Э. Аббе, для получения изображения решетки, даже самого нечеткого, в объектив должны попасть лучи любых двух порядков дифракционной картины, например, лучи, образующие центральный и, по крайней мере, первый дифракционный максимум. Вспомним, что для наклонного падения лучей на дифракционную решетку ее главная формула имеет вид: d (sin   sin )  m . Если свет u падает под углом   , а угол дифракции для первого максимума равен 2 u u    , то формула приобретает вид 2d sin   . За предел разрешения 2 2 микроскопа следует принять постоянную дифракционной решетки, тогда z 0,5 , где  - длина волны света. sin u 2 Как видно из формулы, один из способов уменьшения предела разрешения микроскопа – использование света с меньшей длиной волны. В связи с этим применяют ультрафиолетовый микроскоп, в котором микрообъекты исследуются в ультрафиолетовых лучах. Принципиальная оптическая схема такого микроскопа аналогична схемам обычного микроскопа. Основное отличие заключается в использовании оптических устройств, прозрачных для УФ-света, и в особенностях регистрации изображения. Так как глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение (кроме того, оно обжигает глаза, т.е. является опасным для органа зрения), то употребляются фотопластинки, люминесцентные экраны или электроннооптические преобразователи. Если в пространство между объективом и покровным стеклом препарата поместить специальную жидкую среду, называемую иммерсией, то предел разрешения также уменьшается: z  0,5 0,5  , где n – n sin u 2 A абсолютный показатель преломления иммерсии, A – числовая апертура объектива. В качестве иммерсии используют воду (n = 1,33), кедровое масло (n = 1,515), монобромнафталин (n = 1,66) и др. Для каждого вида иммерсии изготавливают специальный объектив, и его можно применять только с данным видом иммерсии. Еще один способ уменьшения предела разрешения микроскопа – это увеличение апертурного угла. Этот угол зависит от размеров объектива и расстояния от предмета до объектива. Однако расстояние от предмета до линзы нельзя изменять произвольно, оно постоянно для каждого объектива и приближать предмет нельзя. В современных микроскопах апертурный угол достигает 140о (соответственно, u/2 = 70о). С таким углом получают максимальные числовые апертуры и минимальные пределы разрешения. А z, мкм 0,94х1 = 0,94 0,30 Водяная иммерсия 0,94х1,33 = 1,25 0,22 Масляная иммерсия 0,94х1,515 = 1,43 0,19 Сухая система Данные приведены для наклонного падения света на объект и длины волны 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз человека. Обратите внимание на то, что окуляр совершенно не влияет на разрешающую способность микроскопа, он только создает увеличенное изображение объектива. 5. Полезное увеличение микроскопа В световой микроскопии используют понятие «полезное увеличение микроскопа» - отношение предела разрешения для глаза к пределу разрешения для микроскопа: полезн  z гл . Напоминаю, что нормальный глаз z микр в предельном случае различает две точки предмета, угол зрения для которых равен 1′. Считают, что удобная различимость соответствует углу зрения в интервале от 2′ до 4′, при этом размеры объекта на расстоянии наилучшего зрения составляют от 140 до 280 мкм. Подставив эти значения, а также λ = 555 нм, находим интервал значений полезного увеличения микроскопа. 500А < Г < 1000A Это увеличение называют полезным, так как при нем глаз различает все элементы структуры предмета, разрешенные микроскопом. Для микроскопов с масляной иммерсией 700А < Г < 1400A. 6. Аберра́ции оптических систем Аберрации оптических систем - ошибки или погрешности изображения в реальной оптической системе, вызываемые отклонением луча от того направления, по которому он должен был бы идти в идеальной оптической системе. Основные аберрации линз: сферическая аберрация – периферические части линзы сильнее отклоняют лучи, чем центральные. Заметное влияние на сферическую аберрацию оказывает диафрагмирование объектива (или иной оптической системы), так как при этом отсекаются краевые лучи широкого пучка. хроматическая аберрация – связана с тем, что показатель преломления вещества, из которого изготовлена линза, зависит от длины волны падающего света. Поэтому фокус линзы для света разной длины различен. Хроматические аберрации ведут к снижению чёткости изображения, а иногда также и к появлению на нём цветных контуров, полос, пятен, которые у предмета отсутствуют. Хроматизм может быть исправлен путем комбинирования собирательной и рассеивающей линз из стёкол с различной дисперсией. дисто́рсия — аберрация оптических систем, при которой линейное увеличение изменяется по полю зрения. При этом нарушается подобие между объектом и его изображением (подушкообразная дисторсия, бочкообразная дисторсия). Возникает вследствие того, что лучи, посылаемые предметом в систему, составляют большие углы с оптической осью. Подбирая систему из нескольких линз с противоположным характером дисторсии, можно исправить эту аберрацию. астигматизм – аберрация, обусловленная неодинаковым преломлением лучей в различных меридианных плоскостях (меридианной плоскостью называется плоскость, проходящая через главную оптическую ось линзы). Астигматизм может быть обусловлен отклонением поверхности линзы от правильной сферической формы, а также большим углом наклона лучей к главной оптической оси линзы (астигматизм косых пучков). 7. Некоторые специальные приемы оптической микроскопии а) Измерение размеров микрообъектов при помощи окулярного винтового микрометра Для этого применяют окулярный микрометр – круглую стеклянную пластинку, на которой нанесена шкала с делениями. Микрометр устанавливают в плоскости изображения, получаемого от объектива. При рассматривании в окуляр изображения объекта и шкалы сливаются и можно определить, сколько делений шкалы укладывается на измеряемом объекте. Отсчет по шкале еще не дает размера объекта, так как совмещаемое со шкалой изображение не равно размеру предмета. Нужно найти цену деления окулярного микрометра. Для этого применяют объект-микрометр – шкалу с делениями по 0,01 мм. Рассматривая объект-микрометр как предмет, совмещают в одном поле зрения две шкалы – объект-микрометра и окулярного микрометра – и определяют цену деления окулярного микрометра. Вместо объект-микрометра можно использовать любой объект, размер которого известен, или использовать счетную камеру Горяева, употребляемую для подсчета форменных элементов крови. б) Микропроекция и микрофотография Формирование участием микроскопического человека и завершается изображения образованием происходит с действительного изображения в глазу. Обычный микроскоп сам по себе не создает действительного изображения, однако оно необходимо для микрофотографирования или проекции микроскопического изображения на экран (микропроекция). Для этого изображение, даваемое объективом, следует разместить от окуляра, на расстоянии, превышающем его фокусное расстояние. в) Метод фазового контраста Метод фазового контраста и его разновидность — так называемый метод «аноптрального» изображений контраста прозрачных и - предназначены бесцветных объектов, для получения невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазовоконтрастным. Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается, и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - инвертированные микроскопы. микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху У таких г) Ультрамикроскопия Это метод обнаружения частиц, размеры которых лежат за пределом разрешения микроскопа. В ультрамикроскопах осуществляют боковое (косое) освещение, благодаря чему субмикроскопические частицы видны как светлые точки на темном фоне; строение частиц увидеть нельзя. Этот метод позволяет регистрировать частицы размером до 2 мкм, и его используют, в частности, с санитарно-гигиеническими целями для определения чистоты воздуха. д) Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме. е) Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что луч света раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста — они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста – это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров. Ж) Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источникаосветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность. Выводы и заключение На сегодняшней лекции мы познакомились со световым микроскопом – устройством, которое успешно используется в биологии и медицине уже на протяжении более чем 300 лет. Тем не менее, приемы световой микроскопии постоянно совершенствуются и находят все новые и новые применения. Например, всем понятна важность анализов крови при различных заболеваниях, в том числе подсчета числа форменных элементов. Однако не так давно учёные пришли к выводу, что еще более важной может быть не количественная, а качественная оценка форменных элементов крови и плазмы. Для этого используется фазово-контрастная микроскопия - передовой метод диагностики живой капли крови, изображение которой передаётся на экран монитора компьютера с помощью цифровой телевизионной камеры, подключённой к микроскопу, и может быть захвачено и сохранено в стандартном графическом формате (*.jpg) или записано в виде ролика, который сможет просмотреть специалист и обследуемый пациент. Наглядность такого метода намного выше, чем длинные столбцы цифр или абзацы текста. На основании сканирования живой капли крови определяется: 1) состояние эритроцитов, их подвижность в плазме, степень агрегации (склеивание в "монетный столбик") и сладжирование (образование беспорядочной, сплошной агрегации). Анализируя состояние тромбоцитов, лимфоцитов и лейкоцитов, можно определить активность иммунной системы и способность организма к самовосстановлению, а также патологические изменения состава крови, приводящие к развитию многих заболеваний. 2) Наличие кристаллов холестерина, сахара, мочевой кислоты и др., включая дрожжевую и бактериальную инфекцию 3) Состояние жидкой части крови (плазмы), степень её чистоты, наличие или отсутствие микроорганизмов, физиологических (холестерин) и/или патологических включений. Спектр диагностики заболеваний очень широкий и позволяет сделать заключение о состоянии обмена веществ (жирового, белкового, углеводного, фосфорно-кальциевого), который зависит от работы поджелудочной железы, печени; о нарушениях, которые могут привести к анемии, атеросклерозу, подагре, онкологическим заболеваниям; о состоянии иммунитета и дисбактериозе кишечника, наличии в организме паразитов. При недостатке в организме витаминов группы В, фолиевой кислоты и железа на экране монитора можно увидеть отдельно расположенные округлые эритроциты разных размеров. О наличии в организме свободных радикалов, поражающих клетки крови, свидетельствует наличие эритроцитов, имеющих повреждения в виде "обкусанных" краев. В состоянии почти сплошного склеивания (сладжа) эритроциты выполняют свою функцию всего лишь на 10%, т.е. организм не получает в достаточном количестве питательных веществ, витаминов, кислорода, из клеток не выводятся шлаки. Отсюда - плохой сон, усталость, в конечном итоге - синдром хронической усталости, ослабленный иммунитет и ряд сопутствующих заболеваний. Исполнитель Доцент Н. Новикова