Понятие нормы. достоверность биохимических исследований. чтение результатов

Лекция 2. ПОНЯТИЕ НОРМЫ. ДОСТОВЕРНОСТЬ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. ЧТЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Главная задача лаборатории клинической биохи­мии состоит в том, чтобы обеспечивать врача био­химической информацией, необходимой для лече­ния больного животного. Такая информация представляет ценность, только если она точна, соответствует клинической ситуации и правильно используется врачом в процессе принятия решений. Неотъемлемой частью клинической лабораторной диагностики является система контроля качества. Основу системы составляет ежедневное использование одной и той же контрольной пробы в течение длительного времени. Статистическая обработка результатов подобных исследований позволяет построить интервал, в пределах которого только и возможны колебания результатов исследования контрольной пробы для каждого из исследуемых параметров, часто этот интервал называют «нормой».. Однако употребление слова “нормальный” сопряжено с оп­ределенными трудностями. В статистике оно приме­няется к распределению результатов повторных из­мерений одной и той же величины и описывается колоколоподобной гауссовской кривой (рис. 1). Гауссовское распределение свойственно многим биологическим показателям, и у большинства пред­ставителей определенной популяции их значения близки к среднему, а частота, с которой встречается каждое конкретное значение показателя, снижается с увеличением его отличия от среднего. Рис. 1 Гауссовское распределение Нередко встречаются асимметричные распреде­ления (например, концентрация билирубина в плаз­ме), которые математически трансформируются в нормальное. Если распределение смещено вправо от среднего, его часто можно привести к нормаль­ному, перенеся на полулогарифмическую шкалу. Если измеряемый параметр в популяции имеет нормальное (гауссовское) распределение, то, по теории статистики, примерно 95 % значений пара­метра в популяции должны лежать в области, оп­ределяемой средним значением ± два стандартных отклонения (SD) (рис. 1.2). Из оставшихся 5 % по­ловина будет больше, а половина меньше погра­ничных значений этой области. При определении области значений конкретно­го показателя у здоровых животных принято сначала исследовать репрезентативную группу, числен­ность которой достаточна для того, чтобы выяс­нить, соответствует ли распределение значений данного показателя гауссовскому. После этого можно рассчитать интервал (среднее ± два стан­дартных отклонения), который в статистике име­нуется “нормальной областью”. С этой процедурой связано несколько важных моментов: • Хотя допускается, что популяция здорова, у 5 % ее представителей значения показателей, по оп­ределению, лежат за пределами нормальной об­ласти. Из этого следует, что если измерения проведены в группе сопоставимых индивидов, то у одного из 20 результат окажется за преде­лами нормы. • Специальное статистическое значение слова “нормальный” не совпадает со значением, кото­рое чаще других в него вкладывают — “обыч­ный”, “привычный”. • Статистический смысл слова “нормальный” мо­жет не иметь отношения к еще одному распрост­раненному значению этого слова, которое под­разумевает отсутствие риска нежелательных яв­лений. Например, эпидемиологические данные показывают, что у человека существует связь между повы­шенным риском развития ишемической болез­ни сердца и содержанием холестерина в плазме крови даже в пределах области нормальных зна­чений. Таким образом, нормальная область значений анализируемого показателя, установленная и рас­считанная так, как описано выше, имеет строгие ограничения. Она определяет только наиболее час­то встречающиеся индивидуальные значения, ко­торые не обязательно являются нормальными в смысле “идеальные” и не означают отсутствие риска развития заболевания. Кроме того, она, по определению, исключает результаты, получаемые у некоторых здоровых индивидов. В любом случае подобное должно сравниваться с подобным. Если концентрация анализируемого вещества зависит от физиологических факторов (табл. 1-2), оценку ин­дивидуального результата надо проводить, срав­нивая его с ожидаемым значением для сопостави­мой группы здоровых животных. Поэтому может воз­никнуть необходимость определения границ нор­мы для разных подгрупп популяции, выделяемых по возрасту, породе или полу. Для того чтобы обойти проблемы, связанные с употреблением слова “нормальный”, сотрудники лабораторий широко пользуются термином “отно­сительный интервал” ОИ (часто используют рав­нозначный термин “относительная область”), опре­деляя числовые значения (относительные преде­лы) на основе среднего значения ± 2SD. Результа­ты можно сравнивать с “относительным интерва­лом” без каких-либо предположений о значении слова “нормальный”. На практике термин “нор­мальная область” по-прежнему широко использу­ется как синоним “относительной области”. Когда при оценке индивидуального результата пользуются понятием “относительный интервал”, то индивидуум сопоставляется с популяцией. Не­которым параметрам свойственна значительная биологическая вариабельность, но сочетанная био­логическая и аналитическая вариабельность у ин­дивида будет меньше, чем в популяции. Например, хотя “относительная область” для содержания креатинина в плазме составляет 60-120 мкмоль/л, индивидуальные значения при ежедневном опре­делении варьируются в меньших пределах. Поэто­му результат теста может быть ненормальным для индивида, но укладываться в принятую “нормаль­ную область’’. Ненормальный результат анализа не всегда ука­зывает на наличие патологии, так же как нормаль­ный результат — на ее отсутствие. Однако чем бо­лее ненормален результат, т. е. чем дальше он выходит за пределы “относительного интервала”, тем больше вероятность того, что это связано с патоло­гическим процессом. На практике редко встречается абсолютное разграничение между нормальными значениями и наблюдаемыми при заболевании. Неоднознач­ные результаты должны уточняться дальнейши­ми исследованиями. Если решение о ведении больного надо принимать на основании един­ственного результата анализа, чрезвычайно важ­но, чтобы “уровень решения” был гарантирован эффективностью метода. Идеальный аналитический метод должен давать правильные и точные результаты (одинаковые при повторных анализах), быть чувствитель­ным (определять низкие концентрации нужного вещества) и специфичным (не взаимодействовать с другими веществами). Кроме того, предпочти­тельно, чтобы он был дешевым, простым и быст­рым в исполнении. На практике ни один метод не является идеаль­ным, но специалист должен быть уверен, что полу­чаемые результаты достаточно надежны, чтобы быть полезными для клиники. Сотрудники лабора­тории прилагают к этому немалые усилия, а анали­тические методы подвергаются строгим проверкам качества и достоверности. Тем не менее в каждом результате содержится возможность некоторой неточности, или аналити­ческой погрешности. Ее степень можно оценить с помощью повторных анализов, использующих один и тот же метод и образец (сравните с биологи­ческой вариабельностью). Результаты при этом бу­дут группироваться вокруг среднего, для которого можно вычислить стандартное отклонение. Неточ­ность анализа может быть выражена через коэффи­циент вариации: КВ = SD х 100/Среднее. Понима­ние сути биологической и аналитической вариа­бельности очень важно для интерпретации данных лабораторных анализов. Важно осознавать и то, что результаты, получа­емые разными методами, нельзя считать в полной мере сравнимыми. Для того чтобы сравнение ре­зультатов было корректно, они должны быть полу­чены одним и тем же аналитическим методом. Часто уместно выполнять несколько связанных между собой анализов на одной пробе. Например, значение концентраций кальция, фосфата и актив­ности щелочной фосфатазы в плазме полезно для диагностики заболеваний костной ткани. Можно сгруппировать несколько анализов для оценки функ­ции печени. Такие группы иногда называют “биохи­мическими профилями”. Экономящие труд лаборан­тов многоканальные автоматические анализаторы и аналогичные приборы могут одновременно выпол­нять более 20 анализов на одном образце сыворотки. Однако, хотя при этом возникает соблазн провести на каждой пробе все возможные анализы, в резуль­тате такого подхода можно получить чрезмерное ко­личество информации, значительная часть которой окажется ненужной, будет игнорироваться или по­лучит неверную интерпретацию. А хуже всего то, что лишние показатели могут отвлечь врача от действи­тельно нужных. Предпочтение следует отдавать вы­борочным анализам, т. е. таким, в которых выполня­ются только необходимые тесты. Система контроля качества состоит из трех больших этапов: преаналитического, аналитического и постаналитического. Наиболее сложным в организационном плане и наиболее ответственным в плане влияния на полученные показатели в системе контроля качества является преаналитический этап — этап взятия биологического материала на исследование. Клиническому биохимику обычно недоступны для анализа органы и ткани, в которых развивается патологический процесс, — он довольствуется исследованием жидкостей организма и по содержанию или структуре специфических молекул-маркеров, перешедших в эти жидкости, осуществляет диагностику заболевания. Для того чтобы данные биохимического анализа представляли клиническую ценность, при заборе образцов анализируемого материала и их транс­портировке в лабораторию должны выполняться определенные требования. Предоставляемый в лабораторию материал дол­жен соответствовать требованиям, предъявляе­мым к тесту. Многие биохимические анализы мо­гут быть выполнены как с использованием плаз­мы, так и сыворотки, но в некоторых случаях тип материала имеет критическое значение. Напри­мер, для электрофореза белков нужна сыворотка, а для определения активности ренина — плазма. Одним из условий получения правильных результатов является обследование животного в состоянии основного обмена (покоя). Са­мое благоприятное время для исследования — часы после ночного сна. Животным, обследуемым утром, в предшествующий период, пос­ле 20—22 часов, необходимо исключить прием корма и жидкости. Животным, которые обследуются днем, разрешается скармливать небольшое количество корма, не ранее, чем через 4—5 часов после кормления можно проводить взятие крови для опре­деления многих тестов. Липидный обмен можно исследовать только через 12—14 часов после последнего кормления. Это связано с тем, что после приема кормов, богатых жирами в течение нескольких часов в крови по­вышается содержание холестерина и других липидов. Для биохимических исследований, как правило, кровь берут пу­тем венепункции. Связанные с этим эмоциональные влияния следует максимально исключить. Увеличение времени сдавливания сосудов жгутом вызывает локальный стаз и гипоксию, приводящие к измене­нию содержания ряда веществ: уменьшению концентрации сахара, увеличению лактата, аммиака, кальция, общего белка и белковых фракций и др. Продолжительное сдавливание или травма вены мо­жет вызывать повышение фибринолитической активности. Величина многих биохимических показателей зависит от положе­ния тела животного во время взятия крови (стоя, лежа). Так, в зависимо­сти от этого могут изменяться концентрация белка, содержание калия, кальция, альбумина, фосфора, холестерина, активность ферментов: ACT, щелочной и кислой фосфатаз. Концентрация белка, содержание альдостерона в положении лежа ниже, чем в положении стоя. На результаты исследования многих показателей влияет гемолиз, возникающий вследствие неправильного взятия крови. При гемоли­зе в сыворотку (или плазму) крови выделяются различные вещества из разрушенных эритроцитов. При взятии пробы крови, если животному проводится внутривенная те­рапия, то кровь для анализа следует брать дальше от места вливания (например, из другой конечности), чтобы избежать контаминации лекарственным средством. Сбор крови в неподходящий контейнер может привести к неожиданным (но прогнозируемым) результатам: оксалаты и ЭДТА, используемые в качестве антикоагулянтов в некоторых тестах, способны хелатировать кальций, что приводит к более низким цифрам его концентрации в плаз­ме; аналогичным действием обладает цитрат (ан­тикоагулянт, присутствующий в контейнерах для проб крови, в которых будут измерять кон­центрацию глюкозы, в них также содержится нат­рия фторид для ингибирования гликолиза). Оче­видно, что нельзя собирать кровь для измерения концентрации лития в пробирки, обработанные антикоагулянтом — литиевой солью гепарина. Руководства по лабораторной работе должны со­держать четкие указания на тип пробы и, когда необходимо, условия ее взятия для проведения любого из тестов. Все пробы должны быть маркированы и без задержки отправлены в лабораторию, где сыво­ротка или плазма отделяется от форменных эле­ментов крови и исследуется. Если выполнение анализа задерживается, либо пробы отправляют­ся в отдаленную лабораторию, разложение ла­бильных веществ может быть предотвращено ох­лаждением или замораживанием плазмы (сыво­ротки). Не меньше внимания требует сбор и транспор­тировка других материалов для анализа, например мочи или цереброспинальной жидкости. Все про­бы должны рассматриваться как потенциальный источник инфекции. Любой биологический материал для анализа должен быть взят по определенным правилам, с учетом суточных, месячных и других ко­лебаний отдельных показателей. Должны четко соблюдаться условия его хранения и транспортировки. Аналитический этап контроля качества во всех лабораториях является наиболее совершенным. При наличии в лаборатории биохимических автоматизированных систем выполнение его происходит автоматически, включая и статистические параметры оценки внутрилабораторного контроля качества для каждого из исследуемых параметров. Использование при определении каждого из анализируемых образцов трех контрольных проб с низким, нормальным и высоким значением исследуемого параметра позволяет проконтролировать весь интервал (линейность) проводимых измерений. Умение оценивать результаты контроля качества во многом способствует высокому качеству диагностического процесса, поскольку широкие интервалы физиологических значений могут быть результатом суммы случайных ошибок, а динамика биохимических показателей при длительном наблюдении может быть результатом систематических ошибок. Биохимические измерения могут варьировать по двум причинам: аналитическим и биологическим. Аналитические вариации. Достоверность полученных результа­тов определяется соблюдением ряда условий при выполнении био­химических исследований. Ряд понятий описывает результаты био­химических определений: • точность и аккуратность; • чувствительность и специфичность; • референтные уровни. Точность — это воспроизводимость аналитического метода. Ак­куратность определяют как соответствие измеренных уровней ре­альным уровням. Представления об этих понятиях дает аналогия с мишенью (рис. 6). Чувствительность определяется наименьшим количеством вещества, которое может быть идентифицировано. Специфичность отражает способность метода определять исследуемое вещество при наличии потенциально похожих веществ. Референтные уровни. Аналитические причины вариабельности результатов исследований менее существенны, чем причины биологические. Результаты биохимических исследований обычно сравнивают с референтными уровнями показателей, характерными для здоровых животных. Референтные уровни — это пределы значений биохимических показателей, определенные на большой популяции здоровых животных. Исследуемые показатели у 95% животных находятся в пределах М±2о (М — среднее значение, о — среднеквадратичное отклонение), и только у 5% здоровых животных значение показателей может выходить за эти референтные пределы. На практике жесткие разграничения биохимических показателей у здоровых и больных животных отсутствуют. Однако чем больше результат отличается от нижних или верхних пределов референтных уровней, тем больше вероятность наличия патологии. Довольно частой является ситуация «перекрывания» показателей, характерных для состояния болезни и состояния здоровья Животные с ненормальными результатами, не обнаруживающие признаков заболевания, считаются ложнопозитивными. Больные животные, у которых определяются «нормальные» значения показателей, — ложнонегативными. Биологические и другие факторы, влияющие на интерпретацию результатов исследований. Результат лабораторного анализа является итогом ряда процессов, протекающих в организме пациента наряду с патологическим. Этот результат зависит от потребляемого корма, задаваемых лекарственных препаратов, лечебных и диагностических процедур, некоторых физиологических состояний. Каждый из этих факторов, в зависимости от силы его воздействия, способен повлиять на результат исследования вне связи с основным патологическим процессом. Поскольку эти факторы носят внелабораторный характер, учет их влияния на лабораторные результаты должен осуществлять клиницист. Некоторые из этих факторов имеют закономерный характер и влияние их легко обнаруживается и оценивается (суточные изменения содержания железа в крови, изменения содержания эстрогенов у самок в репродуктивном возрасте, изменения содержания глюкозы после кормления и т.п.) Наиболее сложным этапом контроля качества является постаналитический. Суть этого этапа составляет диагностическая интерпретация выполненных исследований и порой многочисленных результатов (концентрация метаболитов, ионов, парциальное давление газов, каталитическая активность ферментов, концентрация водородных ионов). Интегральная оценка многочисленных конкретных результатов, формирование при ряде патологических процессов биохимического диагноза, выделение основного патологического процесса, его осложнений, сопутствующих заболеваний зависят от квалификации ветеринарного врача. Правильная интерпретация результатов исследования возможна только при достаточном знании особенностей биохимических сдвигов при разных состояниях организма и механизмов возникающих нарушений. При трактовке полученных результатов необходимо учитывать ряд методологических моментов: 1. Химический состав крови и мочи отражают состояние обмена веществ организма животного. Подавляющее большинство заболеваний сопровождается изменениями в содержании отдельных веществ и ионов в крови и моче, других биологических жидкостях. Многовековой опыт медицины и ветеринарной медицины позволяет рассматривать кровь как зеркало обмена веществ. 2. Содержание каждого отдельного биохимического компонента в крови и моче отражает деятельность многих органов и систем, а также собственную функцию данной жидкости. В силу этого, оценивая полученные результаты, следует их рассматривать в свете одновременного воздействия многих, нередко конкурирующих друг с другом факторов, взвешивать их относительное влияние на определяемый биохимический компонент. 3. Содержание ряда веществ в крови и моче подвержено ритмическим изменениям, отражающим периодические воздействия внешних и внутренних факторов (смена времени года, лунные месяцы, смена времени суток и т.д.). Это нужно учитывать при интерпретации данных. 4. Биохимический состав крови, мочи, других биожидкостей, его изменения под влиянием стандартных нагрузок могут иметь индивидуальные колебания у отдельных животных, отражающие влияние биологических факторов ( гено- и фенотип, возраст, пол, порода, суточные, месячные, сезонные ритмы отдельных показателей), факторов социальных (особенности содержания и использования, кормления) и факторов природных (климатические особенности географических зон — солнечная радиация, колебания температуры, влажность окружающей среды, вода). 5. При принятии решения об отклонении биохимического параметра от нормы следует ориентироваться не на средние показатели, а на справочные величины, получаемые с учетом влияния факторов, указанных в пп. 3 и 4. 6. Для получения достоверных результатов биохимических исследований необходимо обеспечить строгое соблюдение правил взятия образцов крови и мочи, правильного их хранения и транспортировки в лабораторию. Выполнение этих правил полностью зависит от владельца, ухаживающего персонала, персонала ветеринарной клиники и должно находиться под контролем лечащего врача. 7. Диагностическое значение результатов биохимического анализа зависит от степени связи исследуемых параметров с патологическим процессом. Поскольку содержание большинства биохимических компонентов крови, мочи, биожидкостей зависит не от одного, а от нескольких факторов, большая часть установленных в ходе исследований изменений должна рассматриваться с позиций вероятностного, многофакторного подхода. Должны учитываться величины диагностической чувствительности, специфичности, эффективности используемых биохимических тестов. 8. Никогда не следует забывать, что результаты биохимических исследований — это лишь часть сведений об исследуемом организме. Учитывая высокую вариабельность физиологических и патологических процессов в клинической диагностике, никогда нельзя опираться только на данные биохимических параметров. Умение трактовать результаты лабораторных тестов, не назначать ненужные лабораторные исследования, умение вести диагностический процесс на основании лабораторных данных не вширь, а вглубь во многом характеризует профессиональный уровень ветеринарного врача - специалиста клинической лабораторной диагностики.