Хлорамфеникол (левомицетин) и его эфиры

Хлорамфеникол (левомицетин) впервые обнаружен в 1947 г. в культуральной жидкости актиномицета Streptomyces venezuelae. В 1949 г. установлена его химическая структура и осуществлен синтез. Хлорамфеникол был первым антибиотиком, химический синтез которого внедрен в промышленном масштабе, в то время как большинство других антибиотиков получают биосинтезом. 1 Хлорамфеникол (левомицетин) Описание. Белый или белый с сероватым, желтоватым или желтоватозеленоватым оттенком кристаллический порошок, тонкие кристаллы или продолговатые пластины. Растворимость. Легко растворим в спирте 96% , растворим в этилацетате, мало растворим в воде. Получают синтетическим путем, выделяя на определенных этапах синтеза необходимые изомеры. 2 Хлорамфеникола стеарат Описание. Белый с желтоватым оттенком порошок, без запаха. Растворимость. Практически не растворим в воде, легко растворим в хлороформе. Хлорамфеникола сукцинат Описание. Белый или желтовато-белый порошок. Гигроскопичен. Растворимость. Очень легко растворим в воде, легко растворим в спирте 96%. Данные ЛС представляют собой эфиры хлорамфеникола, были получены с целью улучшения физических и потребительских характеристик хлорамфеникола. Хлорамфеникола стеарат отличается от хлорамфеникола отсутствием горького вкуса, хлорамфеникола натрия сукцинат хорошо растворим в воде и может использоваться в виде растворов в т.ч. и для парентерального введения. 3 Температура плавления является важной физической константой ЛС и наряду с другими физическими характеристиками используется при определении подлинности и ориентировочного определения чистоты. Температурой плавления называют температуру, при которой происходит переход вещества из твердого состояния в жидкое. В НД она приводится, как правило, в виде интервала значений. Температуры плавления: хлорамфеникол от 149 до 153 °С хлорамфеникола стеарат от 88 до 90 °С Все рассматриваемые ЛС содержат в структуре асимметрические атомы углерода и являются оптически активными веществами. Для каждого их них в ФС регламентируется «Удельное вращение», для проведения испытания готовят 5% растворы в спирте 96% (хлорамфеникол, хлорамфеникола стеарат) или в воде (хлорамфеникола сукцинат натрия). Удельное вращение [α] – угол поворота плоскости поляризации, вызванный слоем вещества толщиной 1 дм при пересчете на содержание 1 г вещества в 1 мл объема. Это константа оптически активного вещества, рассчитывается по формуле:  – измеренный на приборе – поляриметре угол вращения в угловых градусах; – толщина слоя жидкости в дециметрах; С – концентрация испытуемого раствора в %. 4 Спектрофотометрия основана на поглощении ЛС монохроматического излучения в УФ- области. Как правило, поглощение излучения в УФ- области обусловлено наличием в структуре ЛС системы двойных связей. Графическое изображение зависимости поглощения от длины волны света называется спектром. Поглощение хлорамфениколом излучения в УФ-области обусловлено наличием в структуре замещенного ароматического радикала и нитрогруппы. УФ-спектр 0,002% водного раствора субстанции хлорамфеникола в области от 220 до 400 нм должен иметь максимум поглощения при 278 нм и минимум при 237 нм. ФС рекомендует устанавливать величину удельного показателя поглощения при λ= 278 нм. % А11см  А С  А – оптическая плотность испытуемого раствора субстанции; С – концентрация раствора в %; l – толщина поглощающего слоя в см. Удельный показатель поглощения должен быть от 290 до 305. 5 ФС рекомендует подтверждать подлинность хлорамфеникола по ИК- спектру, снятому в диске с калия бромидом в области 4000 – 400 см-1, спектр по расположению характеристических полос поглощения должен полностью соответствовать спектру стандартного образца хлорамфеникола. ИК спектрометрия – метод исследования веществ, основанный на поглощении ИК излучения, в результате чего происходит усиление колебательных и вращательных движений молекул. В основе получения ИК спектра лежит облучение исследуемого образца ИК излучением с постепенно изменяющейся частотой, осуществляемое с помощью прибора – ИК спектрометра. Каждое соединение независимо от его природы имеет строго индивидуальную картину спектра. ИК спектр представляет собой график пропускания веществом инфракрасного излучения (Т, %) в зависимости от длины волны (, мкм) или частоты излучения (, см-1). 6 Для подтверждения подлинности хлорамфеникола и его эфиров используют общие реакции на функциональные группы: - ароматическая нитрогруппа; - спиртовый гидроксил; - ковалентносвязанный хлор; - амидная и сложноэфирная группы; и специфические: - доказательство продуктов гидролиза эфиров хлорамфеникола (стеариновая и янтарная кислоты); - ион натрия в хлорамфеникола натрия сукцинате (окрашивание пламени в желтый цвет) 7 Реакция гидролиза в щелочной среде лежит в основе испытания подлинности хлорамфеникола и его производных. При нагревании хлорамфеникола с 20% раствором натрия гидроксида появляется желтое окрашивание, обусловленное образованием аци-соли за счет ароматической нитрогруппы, ощущается запах аммиака, обусловленный гидролитическим разложением по амидной группе, ковалентносвязанный хлор переходит в натрия хлорид (минерализация). Фильтрат после подкисления азотной кислотой дает реакцию на хлориды: NaCI + HNO3 → HCI + NaNO3 HCI + AgNO3 → AgCI ↓+ HNO3 8 Хлорамфеникол за счет наличия в молекуле спиртового гидроксила и вторичной алифатической аминогруппы может образовывать окрашенные комплексные соединения с солями тяжелых металлов. С раствором меди (II) сульфата образуется синий осадок, который растворяется в н-бутаноле, окрашивая его в синефиолетовый цвет. 9 Подлинность эфиров хлорамфеникола - хлорамфеникола стеарата и хлорамфеникола натрия сукцината подтверждают реакциями гидролитического разложения по сложноэфирной группе, с последующей идентификацией продуктов гидролиза. Хлорамфеникола стеарат гидролизуется в присутствии хлористоводородной кислоты концентрированной (при нагревании) с образованием хлорамфеникола и стеариновой кислоты, которая всплывает на поверхность в виде маслянистых капель, затвердевающих при охлаждении. Хлорамфеникола натрия сукцинат гидролизуется серной кислотой концентрированной с образованием хлорамфеникола и янтарной кислоты. Реакцию проводят в присутствии резорцина. 10 При осторожном нагревании образовавшаяся янтарная кислота циклизуется (в результате реакции конденсации между двумя карбоксильными группами, серная кислота концентрированная используется как водоотнимающее средство) и вступает в реакцию конденсации с резорцином. После прибавления раствора натрия гидроксида образуется хиноидная структура, наблюдается образование раствора оранжевого цвета, имеющего интенсивно зеленую флуоресценцию. Реакция фармакопейная. 11 При проверке доброкачественности субстанций контролируются следующие показатели: прозрачность раствора; цветность раствора; общие примеси; потеря в массе при высушивании; специфические (родственные) примеси. Прозрачность – растворы субстанций хлорамфеникола (в спирте 96%), хлорамфеникола натрия сукцината (в воде) должны быть прозрачными. Цветность раствора устанавливается только для хлорамфеникола окраска спиртового раствора не должна превышать эталон цветности Y5 (шкала желтых оттенков). Сама по себе субстанция хлорамфеникола может иметь желтоватый или желтовато-зеленоватый оттенок, но цветность не должна превышать указанного эталона. Превышение цветности может быть при недостаточной очистке субстанции, т.к. при синтезе в качестве исходного продукта используют п-нитроацетофенон - порошок ярко-желтого цвета. Общие примеси – указывают на степень очистки ЛС, не имеют специфического действия, но в больших количествах снижают фармакологическую активность ЛС. Из общих примесей контролируются: хлориды, сульфаты, сульфатная зола, тяжелые металлы. Примеси допустимые, их количество регламентируется ФС. Потеря в массе при высушивании происходит за счет влаги и некоторых летучих веществ, например, летучих кислот, аминов, диоксида углерода и др. Образец субстанции сушат до постоянной массы при определенной температуре, условия и температура указываются в ФС. Таким образом контролируется содержание влаги (воды) и возможных летучих примесей. Для хлорамфеникола - потеря в массе при высушивании д.б. не более 0,5%, для хлорамфеникола натрия сукцината контролируется содержание воды методом К.Фишера, д.б. не более 2% (является солью сильного основания – гигроскопичен!). 12 Специфические (родственные) примеси в субстанции хлорамфеникола определяют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) – метод основан на разделении веществ между подвижной и неподвижной фазами, в качестве подвижной фазы используется система растворителей, неподвижной - слой сорбента, нанесенный на инертную твердую поверхность (пластинку). К родственным примесям относятся исходные, промежуточные и побочные продукты синтеза, а так же продукты разложения. Контролируемые в субстанции хлорамфеникола родственные примеси неидентифицированные, в качестве раствора сравнения используется испытуемый раствор разбавленный в 200 раз. Примеси допустимые, не более 1,5%. В субстанции хлорамфеникола стеарата контролируется содержание исходного продукта синтеза и продукта возможного гидролиза по сложноэфирной группе – стеариновой кислоты. Определяют алкалиметрическим методом по варианту нейтрализации. Примесь допустимая, не более 3%. В субстанции хлорамфеникола натрия сукцината определение родственных примесей проводят методом ВЭЖХ – Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся под давлением через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Примеси допустимые, не более 2 %. 13 Количественное определение хлорамфеникола и его эфиров в субстанции и готовых ЛС проводят спектрофотометрическим методом. ЛС содержат в своей структуре замещенный ароматический радикал и нитрогруппу и могут поглощать излучение в УФ- области. Спектрофотометрический метод основан на свойстве растворов ЛС поглощать монохроматическое излучение в УФ-области. Расчет количественного содержания проводят по удельному показателю поглощения. В готовых лекарственных средствах, например, в таблетках, определение и расчеты проводят по стандартному образцу, в качестве которого используются субстанции соответствующих ЛС. 14 В условиях аптеки количественное определение хлорамфеникола проводят нитритометрическим методом после восстановления ароматической нитрогруппы до первичной аминогруппы водородом в момент выделения (используют цинковую пыль или гранулы в кислой среде). После восстановления полученное аминопроизводное определяют нитритометрическим методом по варианту диазотирования, с соблюдением всех необходимых условий: кислая среда, пониженная температура, катализатор - калия бромид, определенная скорость титрования (медленно). Коэффициент стехиометричности равен 1. 15 Хлорамфеникол и его эфиры хранят в хорошо закрытой упаковке, в защищенном от света месте. Эфиры могут постепенно гидролизоваться по сложноэфирной группе. Ароматическая нитрогруппа под влиянием света в присутствии следовых количеств металлов может восстанавливаться до аминогруппы. ЛС необходимо хранить в защищенном от света месте, исключается использование металл содержащих упаковочных средств. Хлорамфеникола натрия сукцинат гигроскопичен, т.к. является солью сильного минерального основания, хранят в плотно закрытой упаковке. 16 17 18 Хинолин представляет собой конденсированную гетероциклическую систему, состоящую из пиридина и бензола. В качестве антисептических средств используют производные 8-гидроксихинолина. 19 Нитроксолин Описание. Желтый или серовато-желтый мелкокристаллический порошок, допускается легкий зеленоватый оттенок. Растворимость. Практически нерастворим в воде, мало растворим в спирте 96%, мало растворим в эфире и умеренно растворим в хлороформе. Хлорхинальдол Описание. Кремоватый или оранжево-кремоватый мелкокристаллический порошок со своеобразным запахом. Растворимость. Практически нерастворим в воде, мало растворим в спирте 96%, умеренно растворим в ацетоне. Получают синтетически. 20 Температура плавления является важной физической константой ЛС и наряду с другими физическими характеристиками используется при определении подлинности и ориентировочного определения чистоты. Температурой плавления называют температуру, при которой происходит переход вещества из твердого состояния в жидкое. В НД она приводится, как правило, в виде интервала значений. Температуры плавления: нитроксалин от 178 до 182 °С; хлорхинальдол от 108 до 114 °С. ФС рекомендует подтверждать подлинность рассматриваемых ЛС по ИК- спектру, снятому в диске с калия бромидом в области 4000 – 400 см-1, спектр по расположению характеристических полос поглощения должен полностью соответствовать спектру стандартного образца. ИК спектрометрия – метод исследования веществ, основанный на поглощении ИК излучения, в результате чего происходит усиление колебательных и вращательных движений молекул. В основе получения ИК спектра лежит облучение исследуемого образца ИК излучением с постепенно изменяющейся частотой, осуществляемое с помощью прибора – ИК спектрометра. Каждое ЛС независимо от его природы имеет строго индивидуальную картину спектра. ИК спектр представляет собой график пропускания веществом инфракрасного излучения (Т, %) в зависимости от длины волны (, мкм) или частоты излучения (, см-1). Спектрофотометрия основана на поглощении ЛС монохроматического излучения в УФ- области. Поглощение излучения в УФ- области обусловлено наличием в структуре ЛС системы двойных связей. Графическое изображение зависимости поглощения от длины волны света называется спектром. Поглощение производными 8-оксихинолина излучения в УФ-области обусловлено наличием в их структуре ароматических колец пиридина и бензола, имеющих различные заместители. Максимумы поглощения для данных ЛС указаны на слайде. 21 Для подтверждения подлинности производных 8-оксихинолина используют общие реакции на функциональные группы: - фенольный гидроксил; - третичный атом азота; и специфические: - ароматическая нитрогруппа (нитроксолин); - ковалентносвязанный хлор (хлорхинальдол) 22 Общей реакцией на рассматриваемые ЛС является реакция комплексообразования с железа (III) хлоридом, протекает за счет фенольного гидроксила (проявляет слабые кислотные свойства) и третичного атома азота. Образуется комплекс сине-зеленого цвета. 23 Третичную аминогруппу (проявляет слабые основные свойства) доказывают реакциями с общеалкалоидными осадительными реактивами: Драгендорфа - КBiI4 ; Вагнера-Бушарда – I2 (KI); пикриновая кислота. Образуются окрашенные осадки, на слайде представлена реакция с реактивом Драгендорфа. 24 Ароматическую нитрогруппу в структуре нитроксолина можно доказать реакцией образования аци-соли, проявляются слабые кислотные свойства, за счет перераспределения двойных связей образуется окрашенная хиноидная структура. Кроме того, ароматическую нитрогруппу можно доказать после восстановления до первичной ароматической аминогруппы реакциями образования азокрасителя или оснований Шиффа. Ковалентносвязанный галоген (хлор) в структуре хлорхинальдола доказывают после восстановительной минерализации водородом в момент выделения (цинковой пылью в присутствии уксусной кислоты), образовавшийся хлорид-ион (хлористоводородную кислоту) доказывают реакцией осаждения серебра нитратом. 25 При проверке доброкачественности субстанций контролируются следующие показатели: общие примеси; потеря в массе при высушивании; специфические (родственные) примеси. Общие примеси – указывают на степень очистки ЛС, не имеют специфического действия, но в больших количествах снижают фармакологическую активность ЛС. Из общих примесей контролируются: хлориды, сульфаты, сульфатная зола, тяжелые металлы. Примеси допустимые, их количество регламентируется ФС. Потеря в массе при высушивании происходит за счет влаги и некоторых летучих веществ, например, летучих кислот, аминов, диоксида углерода и др. Образец субстанции сушат до постоянной массы при определенной температуре, условия и температура указываются в ФС. Таким образом контролируется содержание влаги (воды) и возможных летучих примесей. Потеря в массе при высушивании д.б. не более 0,5%. 26 Специфические (родственные) примеси в субстанциях рассматриваемых ЛС определяют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) – метод основан на разделении веществ между подвижной и неподвижной фазами, в качестве подвижной фазы используется система растворителей, неподвижной - слой сорбента, нанесенный на инертную твердую поверхность (пластинку). К родственным примесям относятся исходные, промежуточные и побочные продукты синтеза, а так же продукты разложения. В субстанции нитроксолина контролируется примесь 5-нитрозо8-гидроксихинолина; в субстанции хлорхинальдола – 5,7-дихлор-8гидроксихинолина. Примеси допустимые. 27 Для количественного определения производных 8оксихинолдина использую как химические, так и инструментальные методы. Для количественного определения субстанций используют ацидиметрию в среде протогенного растворителя. Для количественного анализа готовых ЛС спектрофотометрический метод. 28 Количественное определение субстанций ЛС данной группы по ФС проводят ацидиметрическим методом в среде протогенного растворителя – уксусного ангидрида. Метод основан на солеобразовании органических оснований с хлорной кислотой в среде протогенного растворителя, усиливающего основные свойства. Производные 8-оксихинолина проявляют слабые основные свойства за счет третичного азота в 1-м положении. Точку эквивалентности определяют потенциометрически или с помощью индикатора кристаллического фиолетового. Коэффициент стехиометричности равен 1. 29 Производные 8-оксихинолина содержат в своей структуре кольцо бензола и пиридина и могут поглощать излучение в УФобласти. В готовых лекарственных формах, например, в таблетках, для количественного определения применяется спектрофотометрический метод, основанный на свойстве растворов ЛС поглощать монохроматическое излучение в УФ-или видимой области. Расчеты проводят по стандартному образцу, в качестве которого используются субстанции ЛС. Количественное определение таблеток хлорхинальдола проводят в УФ-области, для извлечения ЛС из порошка растертых таблеток используют раствор натрия гидроксида. Количественное определение таблеток нитроксалина проводят в видимой области , т. к получаемый в процессе извлечения ЛС из таблеток раствор окрашен. 30 Количественное определение производных 8-оксихинолина можно проводить алкалиметрическим методом в среде протофильного растворителя – диметилформамида (усиливающего слабые кислотные свойства фенольного гидроксила). Количественное определение хлорхинальдола можно провести аргентометрическим методом по ковалентносвязанному хлору после восстановительной минерализации водородом в момент выделения. Для количественного определения нитроксолина можно использовать нитритометрический метод (вариант диазотирования) после восстановления нитрогруппы до аминогруппы. 31 ЛС, производные 8-оксихинолина хранят в хорошо закрытой упаковке, в защищенном от света месте. Могут постепенно окисляться кислородом воздуха (под воздействием света) по фенольному гидроксиду. Ароматическая нитрогруппа (нитроксолин) под влиянием света в присутствии следовых количеств металлов может восстанавливаться до аминогруппы. ЛС необходимо хранить в защищенном от света месте, исключается использование металл содержащих упаковочных средств. 32 33