Современные методы иммунного анализа

Классификация современных методов иммунного анализа

Классификация современных методов иммунного анализа:

• конкурентные методы, основанные на применении меченного антигена — хемолюминисцентный иммунный анализ, иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ, флуоресцентный иммуноанализ;
• конкурентные методы, основанные на применении меченных антител — хемолюминисцентный иммунный анализ, методы гетерогенного или твердофазного анализа, флуоресцентный иммуноанализ;
• методы, основанные на агрегации и осаждении, подсчете частиц — нефелометрический иммунный анализ, турбидиметрический иммунный анализ, латекс-агглютинация;
• методы, основанные на применении избытка антигена или антител — иммунорадиометрический метод анализа, методы гетерогенного или твердофазного анализа, флуоресцентный иммуноанализ, хемолюминисцентный иммунный анализ;
• методы для определения специфических антител (антиген в избытке, фиксированный на твердой фазе) — иммуноферментный анализ, радиоаллергосорбентный анализ;методы, основанные на модификации активности ферментной метки при связывании — иммуноанализ с измерением активности фермента, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ с гашением флуоресценции и др.

Методы иммунного анализа без использования меток

К методам иммунного анализа, проводимого без использования меток относятся:

• реакция преципитации (реакция кольцепреципитации, реакция преципитации в геле, реакция флоккуляции);
• реакция агглютинации;
• иммуноэлектрофорез (ракетный иммуноэлектрофорез, электросинерез (встречный иммуноэлектрофорез), перекрестный (двумерный) иммуноэлектрофорез);
• реакция нейтрализации;
• реакция связывания комплемента (реакция радиального гемолиза, реакция иммунного прилипания).

Реакция преципитации – это формирование с дальнейшим осаждением комплекса растворимого антигена с антителами (преципитата) в виде помутнения. Компонентами реакции являются преципитиноген (растворимый антиген или гаптен), иммунная преципитирующая сыворотка (антитела-преципитины), изотонический раствор хлорида натрия, агаровый гель). Антигенами в реакции преципитации являются растворимые соединения: белки, комплексы белков с липидами и углеводами, бактериальные экстракты и др. Оптимальное специфическое взаимодействие антигена с антителом происходит в среде, близкой к нейтральной.

Реакция агглютинации — это реакция, основанная на «склеивании» антителами корпускулярных антигенов в присутствии электролита. Антигенами могут выступать эритроциты, другие клетки, бактерии, нерастворимые частицы с адсорбированными антигенами, макромолекулярные агрегаты. В реакциях агглютинации антиген является агглютиногеном, антитело — агглютинином, а образующийся осадок — агглютинатом.

Иммуноэлектрофорез — это метод иммунного анализа, основанный на электрофоретическом разделении антигенов (антител) в геле и последующем их проявлением посредством преципитации соответствующими антителами (антигенами). Иммуноэлектрофорез позволяет определить концентрацию иммуноглобулинов разных классов, диагностировать иммунодефицитные состояния, идентифицировать миеломные белки.

Вначале проводят электрофоретическое разделение белковых антигенов в геле агара. После того, как будет снято напряжение вдоль движения белков в электрическом поле, в геле вырезают канавку и вносят в нее преципитирующую иммунную сыворотку. Антиген и антисыворотка движутся в геле навстречу друг другу, в результате в месте их взаимодействия появляются линии преципитации, положение, число и форма которых указывают на состав первоначальной смеси антигенов.

Повышение разрешающей способности электрофореза способствует улучшению полос преципитации. Результаты иммуноэлектрофореза зависят от факторов, действующих во время электрофореза и на этапе иммунодиффузии. На иммунодиффузию оказывают влияние титр и специфичность используемой антисыворотки, концентрация антигенов, геометрическое расположение в геле канавок для антител и лунок для антигенов.

Реакция нейтрализации — это иммунологическая реакция, в основе которой лежит способность антител связывать разные микроорганизмы или их продукты жизнедеятельности (ферменты, токсины). Возбудители или метаболиты при связывании с антителами утрачивают свои биологические качества, нейтрализуются.

Реакции нейтрализации позволяют:

• идентифицировать выделенный вирус;
• идентифицировать экзотоксин, продуцируемый неизвестным микроорганизмов;
• обнаружить и определить титр вируснейтрализующих антител;
• выявить антитела к ферментам возбудителей (антистрептокиназ, антистрептолизинов, антистафилолизинов);
• определить активность антитоксических лечебных сывороток.

Идентификацию вируса проводят путем его исследования с разными, заведомо известными антителами (сыворотками). Компонентами реакции при идентификации вируса выступают: исследуемый вирус, диагностическая вируснейтрализующая сыворотка, индикаторная система (куриные эмбрионы, культуры клеток, лабораторные животные).

Реакция связывания комплемента относится к серологическим реакциям, в которых участвуют комплемент и две системы «антиген-антитело»: первая система - диагностическая; вторая система – индикаторная. Для проведения реакции связывания комплемента необходимы пять основных ингредиентов: антиген (экстрат, лизат, гаптен), антитела, комплемент, антиген (эритроциты барана), антитело (гемолизин к эритроцитам барана).

Методы иммунного анализа с использованием меченых реагентов

Метод использования меченных атомов основан на применении специфической и высокоактивной метки — маркера, позволяющего обнаружить продукт иммунной реакции.

Методы, основанные на применении меченных атомов обладают высокой специфичностью, чувствительностью, требуют минимального количества биоматериала. Они позволяют получать объективные, качественные результаты, осуществлять диагностику и скрининг на ранних стадиях заболевания с при минимальных изменениях в организме или объекте исследования.

К методам с использованием меченых реагентов относятся:

• радиоиммунный анализ — метод количественного определения биологически активных веществ (ферментов, гормонов, лекарственных веществ, маркеров злокачественных новообразований, наркотиков и других веществ) в биологических жидкостях; метод основан на конкурентном связывании определяемых или аналогичных меченных радионуклидами веществ со специфическими связывающими системами (специфическими антителами);
• флуоресцентный иммунный анализ, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ — гетерогенный метод, основанный на том, что антигены тканей, микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флуорофорами, могут светиться в ультрафиолетовых лучах люминисцентного микроскопа;
• иммуноферментный анализ — высокоспецифический и высокочувствительный иммунохимический метод, позволяющий провести количественное и качественное содержание разных веществ, обладающих свойствами антител, антигенов, гаптенов;
• иммуноблоттинг — разновидность гетерогенного иммунного анализа, метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и иммуноферментного анализа, или электрофореза и радиоиммунного анализа;
• иммунохроматографический анализ — метод, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и включающий реакцию между антигеном и соответствующим антителом в биологических материалах.