Промышленная микробиология, предмет, задачи и перспективы

ЛЕКЦИИ ПО ДИСЦИПЛИНЕ «СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ» Преподаватель: Григорян Л.Н.; Группа: ДАГ21 Тема 1. Промышленная микробиология, предмет, задачи и перспективы Микроорганизмы, используемые в микробиологической промышленности. Область практического использования микроорганизмов чрезвычайно многообразна - от переработки сельскохозяйственных продуктов до катализа сложных химических превращений. С незапамятных времен человек использовал деятельность микроорганизмов в самых разнообразных традиционных процессах. Возбудители спиртового брожения - дрожжи широко применялись в виноделии, хлебопечении, пивоварении; уксуснокислые бактерии - для получения уксуса; молочнокислые бактерии (иногда одновременно с дрожжами) - при производстве кисломолочных продуктов и в сыроделии. Прошло три столетия с тех пор, как впервые удалось увидеть бактериальную клетку. Однако потребовалось еще много времени, прежде чем удалось определить ту огромную практическую роль, которую выполняют микроорганизмы. Этому способствовало бурное развитие технической микробиологии и биохимии. Особенность микроорганизмов состоит в том, что при определенных условиях они могут осуществлять биосинтез различных метаболитов. Одноклеточным микроорганизмам присущ простой и интенсивный способ размножения. Этим в значительной степени и определяется их синтетическая деятельность. Микроорганизмы растут во много раз быстрее, чем самые урожайные сельскохозяйственные культуры, и чем самые быстрорастущие породы сельскохозяйственных животных. За 1 с растущая бактериальная клетка может создать до 150000 пептидных связей. Другой пример: для получения микробной массы чаще используются дрожжевые микроорганизмы, которые при определенных условиях способны синтезировать до 40-50 % белка от своей массы, некоторые бактериальные культуры образуют 60-70 % белка. Успехи научных исследований и открытий позволили в течение нескольких десятилетий значительно усовершенствовать и интенсифицировать многие производства, связанные с жизнедеятельностью микроорганизмов. Появились новые виды производств - получение антибиотиков, ряда витаминов, незаменимых аминокислот, стимуляторов роста растений, бактериальных препаратов для защиты растений от вредителей. В пищевой, легкой и медицинской промышленности широко используются ферментные препараты, получаемые с помощью бактериальных и грибных культур микроорганизмов. В медицине широко применяются кровезаменители, вырабатываемые с помощью микроорганизмов. Последние принимают также участие в синтезе новых лекарственных препаратов - стероидных гормонов. Во многих странах организовано микробиологическое производство лимонной, молочной, коевой, фумаровой и других кислот. Следует также отметить, что встречающиеся в природе в больших количествах некоторые виды сырья - целлюлоза, нефть, природный газ - могут использоваться только микроорганизмами и превращаются либо в клеточное вещество, либо в промежуточные продукты обмена, выделяемые в среду. Вполне естественно поэтому, что точное знание основ жизнедеятельности микроорганизмов является важнейшим условием рациональной постановки технологических процессов, лежащих в основе этих производств. Основные отрасли микробиологической промышленности. Предприятия микробиологической промышленности занимаются производством продукции с помощью участия в процессе искусственно разведённых или отобранных в естественной среде микроорганизмов. Это действие получило название ферментации, а емкость для него – биореактором. Процессы с участием грибковых организмов и бактерий человек использовал для своих нужд ещё тысячи лет назад, но только буквально век назад они перешли на совершенно новый креативный уровень и стали полноценной отраслью промышленности. Сейчас микроорганизмы используются для изготовления напитков и продуктов в пищевой сфере. С их помощью выполняют обработку материалов в текстильной и кожевенной промышленности. С усилением мирового научного прогресса в двадцатом веке появилась одна из самых прогрессивных сфер исследований – биотехнологическая. Теперь ферментация стала не просто достоянием нескольких небольших лабораторий, но и глобальной, практически независимой промышленного комплекса государства. Первостепенным движущим рычагом микробиологической промышленности России стала необходимость в обеспечении потребностей сельского хозяйства и всей агропромышленности в целом. Наиболее приоритетным сейчас является производство белков, для откорма крупного рогатого скота и полного обеспечения сырьём фермерского хозяйства. Его успешное изготовление налажено путём переработки углеродного сырья из компонентов растительного происхождения. Другим важным направлением отрасли выступают самые обычные дрожжи. Они сейчас повсеместно доступны в любом магазине или супермаркете, но мало кто знает, что их производство связанно с цепью производственных процессов высокой сложности. В состав микробиологической промышленности входят: — заводы, выполняющие органический синтез; — предприятия, берущие на себя роль гидролизного производства. Вполне логично, что фабрики, полноценно использующие сырьё из углеводов, находятся недалеко от заводов перерабатывающих нефтепродукты. Связанно это со схожими потребностями в наличии компонентов, итогом чего становится низкая материалоёмкость первых. Исследовательская статистика говорит о том, что для получения одной тонны белка необходимо как минимум две с половиной тонны чистых углеводов. Вторая главная часть промышленности перерабатывает сельскохозяйственные отходы, путём их разложения гидролизом. В результате рынок получает кормовые дрожжи высокого качества, способные обеспечить животноводческий комплекс страны. Чаще всего, сырьём для этой отрасли служат, подлежащие утилизации отходы: — остающиеся при лесопильном производстве; — обычные кочерыжки от кукурузных кочанов; — лузга от подсолнечника или тыквенных семечек; — шелуха от риса или хлопка. Практическое применение микроорганизмов Благодаря большому разнообразию синтезируемых ферментов микроорганизмы могут выполнять многие химические процессы более эффективно и экономично, чем, если бы эти процессы проводились химическими методами. Изучение биохимической деятельности микроорганизмов позволило подобрать условия для максимальной активности их как продуцентов различных полезных ферментов - возбудителей нужных химических реакций и процессов. Микроорганизмы все шире применяются в различных отраслях химической и пищевой промышленности, сельском хозяйстве, медицине. В нашей стране создана и успешно развивается новая отрасль промышленности - микробиологическая, все производства которой базируются на деятельности микроорганизмов. Микроорганизмы, с помощью которых производят пищевые продукты, называют культурными. Их получают из чистых культур, которые выделяют из отдельных клеток. Последние хранят в музейных коллекциях и снабжают ими различные производства. В результате осуществляемых культурными микроорганизмами химических реакций растительное или животное сырье превращается в пищевые продукты. С помощью микроорганизмов получают многие жизненно важные продукты питания, и хотя изготовление их знакомо человеку с древних времен, роль в нем микроорганизмов открыта сравнительно недавно. Хлебопекарное производство. Хлебопечение основано на деятельности дрожжей и молочнокислых бактерий, развивающихся в тесте. Совместное действие этих микроорганизмов приводит к сбраживанию сахаров муки. Дрожжи вызывают спиртовое брожение, молочнокислые бактерии - молочнокислое. Образующиеся при этом молочная и другие кислоты подкисляют тесто, поддерживая оптимальный для жизнедеятельности дрожжей уровень рН. Углекислый газ разрыхляет тесто и ускоряет его созревание. Применение культурных микроорганизмов в виде прессованных хлебопекарных дрожжей, сушеных или жидких заквасок улучшает вкус и аромат хлеба. Производство сыра. Сыроделие основано на деятельности многих видов микроорганизмов: молочнокислые (термофильный стрептококк), пропионовокислые бактерии и др. Под действием молочнокислых бактерий происходит накопление молочной кислоты и сквашивание молока, под действием других полезных микроорганизмов созревает сыр. Участвуют в этом процессе также некоторые плесневые грибы. Сычужный фермент и молочнокислые бактерии производят глубокое расщепление белков, сахара и жира. Различные бактерии вызывают накопление в острых сырах летучих кислот, придающих им специфический аромат. Использование микробиологических процессов в других отраслях промышленности. Творог, сметану, масло, ацидофилин, простоквашу приготовляют на чистых Культурах с применением различных заквасок. Молоко предварительно пастеризуют. Для производства творога и сметаны применяют мезофильные молочнокислые бактерии; ряженки, варенца и подобных продуктов - термофильные стрептококки и болгарскую палочку; ацидофилина - кислотовыносливые молочнокислые бактерии; кефира - многокомпонентные закваски, состоящие из дрожжей, молочнокислых и часто уксуснокислых бактерий. Для изготовления кислосливочного масла в пастеризованные сливки вносят закваску молочнокислых бактерий и выдерживают до требуемой кислотности. Пивоваренное, спиртовое, ликеро-водочное и винодельческое производства. Вино, пиво, квас, водку и другие напитки приготовляют с применением дрожжей, вызывающих спиртовое брожение сахарсодержащих жидкостей. В результате брожения жидкости (сусла, бражки, сока и т. п.) образуется алкоголь, СО2 и незначительные количества побочных продуктов. Подсобную роль выполняют молочнокислые бактерии: они подкисляют среду и облегчают деятельность дрожжей (например, при производстве кваса). В производстве спирта и пива для осахаривания заторов применяют также ферментные препараты грибного и бактериального происхождения. Квашение и соление. Сущность этого способа консервирования состоит в создании условий для преимущественного развития одних микроорганизмов - молочнокислых бактерий и подавления развития других - гнилостных бактерий. Заквашивают капусту, огурцы, помидоры, яблоки, арбузы. Применяют этот способ также при закладывании на длительное хранение корма для скота - заквашивается зеленая масса из трав, растительных остатков и др. Этот процесс носит название силосования кормов. Получение органических кислот. Уксусную, молочную и лимонную кислоты производят также с помощью микроорганизмов. Молочную кислоту получают способом брожения из сахарсодержащего сырья - патоки, крахмала, молочной сыворотки и др. Молочнокислые бактерии выращивают на средах, содержащих до 15 % сахара. Выход молочной кислоты достигает 60-70 % массы содержащегося в заторе сахара. Промышленное получение уксуса для пищевых целей основано на уксуснокислом брожении. Уксуснокислые бактерии в специальных чанах на буковых стружках окисляют поступающую питательную среду - уксусно-спиртовой раствор - до уксусной кислоты. Лимонную кислоту раньше получали из плодов цитрусовых. В настоящее время ее также получают путем брожения. Возбудителем брожения является гриб Аспергиллус нигер, основное сырье - черная патока. Брожение происходит в растворе с содержанием 15 % сахара в аэробных условиях при температуре около 30 °С. Лимонная кислота используется в кондитерской промышленности, производстве безалкогольных напитков, сиропов, кулинарии и медицине. Использование микроорганизмов для клонирования эукариотических генов. Структура генов прокариот очень проста: есть начало, есть конец, получается мРНК, которая имеет начало и конец, идет транскрипция, трансляция и белок (рис. 53, А). Даже если при фрагментировании геномной ДНК последовательность нуклеотидов, кодирующих структуру определенного белка, прерывается, метод частичного гидролиза позволяет получить рекомбинантные ДНК, в сумме представляющие собой полноразмерный структурный ген интересующего исследователя белка. Схема основных этапов экспрессии генов в клетках прокариот (А) и эукариот (Б) Структура гена эукариот сложнее. Из длинной пре-мРНК (первичный транскрипт) удаляются (вырезаются) интроны (insertion sequences, вставочные последовательности), а оставшиеся экзоны сшиваются в единую нить. Из пре-мРНК в результате процесса, который получил название сплайсинг, получается зрелая мРНК. Потом происходит трансляция зрелой мРНК, в результате образуется белок.. Проблемы клонирования эукариотических генов в системе прокариот включает два основных момента: 1. Прокариоты не способны удалять интроны из первичных РНК-транскриптов, поэтому правильная трансляция эукариотических мРНК в бактериальной клетке невозможна. 2. Экспрессия эукариотической ДНК может осуществляться только при наличии эукариотических сигнальных последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию (кэп, поли-А-хвост и др.) В связи с этим для клонирования генов эукариот разработаны и применяются другие схемы. Можно выделить основные этапы таких экспериментальных подходов: · выделение мРНК на колонках, заполненных олиго(dT)-целлюлозой или олиго(dT)-сефарозой; · cинтез одноцепочечной кДНК на матрице мРНК с помощью ревертазы, праймера олиго(dT) и четырех dNTP; · cинтез двухцепочечной кДНК; · gосле завершения синтеза молекулы мРНК гидролизуют РНК-азой Н, а ДНК обрабатывают нуклеазой SI, в результате чего получаются линейные молекулы ДНК с тупыми концами без шпилек; · кДНК встраивают в плазмидный вектор и получают кДНК-библиотеку. Для скрининга кДНК-библиотеки также можно использовать метод гибридизации или иммунологические методы. Новые направления в современной промышленной микробиологии и биотехнологии. Среди достижений биотехнологии выделяют: • использование иммобилизированных ферментов; • синтез искусственных вакцин. Широко распространены гибродомы и синтезируемые ими антитела, которые в дальнейшем используются как диагностические и лечебные препараты. Микроорганизмы играют не последнюю роль в жизнедеятельности человека. Они участвуют в очистке воздуха и сточных вод, уничтожении отходов. Некоторые бактерии способствуют очищению водоемов. Этические аспекты исследований в биотехнологии Этика в биотехнологии чаще всего относится к проблеме идентификации эмбриона как человека. Ученые рассматривают метод терапевтического клонирования как источник клеток, которые будут использоваться в дальнейшем лечении. Но противники этого метода заявляют, что человеческий эмбрион – это маленький человек с уникальными способностями и характером в будущем. Поэтому такие кардинальные методы биотехнологии до сих пор находятся на стадии разработки. Биотехнологические компании Среди наиболее развивающихся компаний можно рассмотреть следующие: • «GENENTECH». Один из лидеров на рынке биотехнологии. Входит в группу швейцарской фармацевтической компании. Специализируется на исследованиях и разработке в областях онкологии, офтальмологии. • «NOVARTIS». Швейцарская корпорация, специализирующаяся на производстве инновационных лекарственных средств, вакцин. Занимается исследованиями в области кардиологии, дерматологии, онкологии, иммунологии, неврологии. • «MERCK&CO.». Американская компания, которая реализует препараты в терапевтических целях. Также занимается производством безрецептурных вакцин, чтобы предотвратить распространение редких заболеваний. Новые виды сырья. Наиболее важным критерием, определяющим выбор сырья для био­технологических процессов, являются: стоимость, наличие в достаточных количествах, химический состав, форма и степень окисленности источника углерода и т. п. В настоящее время наиболее широко используемыми и коммерчески выгодными материалами являются крахмал (преимущественно кукурузный), метанол, меласса и сырой сахар. Практически нет сомнения в том, что зерновые (в частности, кукуруза, рис и пшеница) будут основными краткосрочными сырьевыми материалами для биотехнологических процессов именно в тех странах, где развиты интен­сивные биотехнологические процессы. Следует отметить, что биотехнология на современном этапе своего развития преимущественно ориентируется на различные виды недорогого, легкодоступного и возобновляемого сырья, наиболее значимым из которого является растительная масса. При конверсии субстратов в биотехнологических процессах основное внимание обращается на создание безотходных производств, когда побочные про­дукты одного процесса служат питательными субстратами для последующего. Использование методов биоинженерии. До того как возникла биотехнология, широко применялась селекция. Она была известна еще тысячи лет назад. Тогда это был шанс человека хоть немного приблизиться к решению вопроса «как подчинить природу». Скрещивая овощи и фрукты разных сортов, люди могли в результате получить улучшенный вкус или повышенную урожайность, устойчивость к неблагоприятным погодным условиям. Селекция постепенно развивалась, поэтому не потеряла актуальность и по сей день. Ученые-селекционеры до сих пор путем скрещивания пытаются улучшить особенности растений, создать более урожайные сорта и новые породы домашнего скота. Сам селекционный процесс состоит в том, что предварительно необходимо сосредоточить внимание на отборе полезных животных и растений. Далее, происходит процесс скрещивания, после которого новый биологический организм наделен свойствами родительских генов. Недостатком селекционного метода можно считать неточность и большой период, необходимый для фиксации полученного результата. Современные и новейшие методы биотехнологии Генная и клеточная инженерия являются главными современными методами биотехнологии. В основе клеточной инженерии – создание и модификация клеток. Ученые постоянно занимаются исследованиями, чтобы в результате получать новые клетки из уже существующих. Для этого в лабораториях проводятся многочисленные опыты. Чаще всего в ходе экспериментов соединяются свойства разных клеток для получения новой. Генная инженерия действует на генетическом уровне. Генные инженеры стараются найти новые комбинации генов, которых нет в природе. В целом процесс можно описать следующим образом: • из определенных клеток собирают гены для считывания некоего вещества; • далее, проводится процесс адаптации для более плавного и гармоничного внедрения гена в чужеродную клетку; • в итоге получается измененная генетически ДНК, которая запрограммирована на выработку исходных веществ. Измененные генетически растения и животные называют трансгенными. Сейчас большинство товаров, которые находятся в супермаркетах и на рынках, получают из трансгенных продуктов. Достижения биотехнологии и этические аспекты ее исследований Биотехнология – дисциплина, которая занимается исследованиями в сфере возможного использования живых организмов в промышленных целях. На данном этапе развития науки активно внедряется микробиологический синтез ферментов, аминокислот, витаминных комплексов, антибиотиков. С помощью современных методов генной инженерии можно в перспективе произвести гормональные препараты, которые бы повысили иммунитет. Постепенно совершенствуясь, биотехнология в дальнейшем сможет решить проблему нехватки продовольственных товаров, минеральных ресурсов, улучшить состояние системы здравоохранения. Медицина также рассчитывает на достижения в биотехнологии, поскольку с помощью новейших методов дисциплины можно создавать лекарственные препараты, направленные на лечение неизлечимых заболеваний. В сельском хозяйстве многих стран, используя методы генной инженерии, создаются сорта растений, которые не боятся вредителей и гербицидов. Такие достижения в биотехнологии, прежде всего, соотносятся с успешными исследованиями в смежных дисциплинах: • биохимии; • цитологии; • фармакологии; • экологии; • генетики; • вирусологии; • микробиологии; • паразитологии. Этические аспекты исследований в биотехнологии связывают с попытками клонирования человека и искусственным созданием эмбрионов для лечения. Многие полагают, что вмешиваться в естественный поток вещей в природе непоправимо. Методы биотехнологии растений В основе биотехнологии растений – метод клонального микроразмножения. Его активируют разными способами, среди которых: • активация пазушных меристем; • соматический эмбриогенез в каллусной ткани; • возникновение адвентивных побегов в каллусе. Активация уже имеющихся меристем в растении – это основа клонального микроразможения. Биотехнология микроорганизмов Биологические методы часто используются при борьбе с загрязнениями окружающей среды. Применение смешанных культур, термофильных микроорганизмов, иммобилизованных клеток. Описанные особенности термофильных микроорганизмов делают весьма заманчивой перспективу использования их в различных отраслях промышленности. Пока данной области сделано очень мало, хотя представляющиеся здесь возможности очевидны. К примеру можно взять хотя бы бродильную промышленность. Известно, что микробиологические процессы при высоких температурах осуществляются значительно быстрее, чем при обычно используемых в практике бродильных производств. В южных местностях, к тому же при высокой летней температуре, некоторые бродильные процессы подавляются, и для их интенсификации желательно было бы, вместо обычных микроорганизмов, применять термофильные или термотолерантные их формы. Например, летняя жаркая погода весьма осложняет работы на заводах уксусной кислоты. Аналогичное явление происходит и на спиртовых заводах. Несмотря на отмеченные моменты, в бродильной промышленности пока используется лишь относительно теплолюбивая культура молочнокислой палочки Bact. delbrucki, весьма энергично образующая молочную кислоту. Термофильных возбудителей других процессов найти в природе пока не удалось, а искусственное их выведение только начинают изучать. К настоящему времени известное практическое применение нашли термофильные целлюлозоразрушающие микроорганизмы. Имшенецкий рекомендовал их культуры использовать для испытания целлюлозных материалов. Специальные ткани, рыболовные сети, покровы кабеля и прочие материалы подвергают пропитыванию различными бактерицидными веществами для предупреждения разложения микроорганизмами. Без подобной обработки отмеченное оборудование подвергается быстрой порче, чем приводит к большим экономическим потерям. До последнего времени для сравнительной оценки качества отдельных антисептиков обработанные ими ткани или волокна помещались в почву или подвергались действию смешанной микрофлоры конского навоза. При проведении эксперимента испытываемые тест-объекты подвергались периодическому испытанию на прочность. Таким путем создавалось впечатление о консервирующем действии тех или иных химических веществ. Отмеченные нами методы, как это очевидно без особых объяснений, весьма несовершенны. Прежде всего, проводимые этими методами испытания требуют значительного времени (8—10 дней). Помимо того, разобранные приемы испытаний не могут гарантировать стандартных результатов, так как в отдельных случаях для работы берется совершенно различная микрофлора. Это мешает сопоставлять данные, полученные в различное время. Имшенецкий предложил значительно более совершенную методику, основанную на применении обогащенных культур термофильных целлюлозразлагающих бактерий. Это дает возможность проводить работу в совершенно стандартных условиях. Сущность метода Имшенецкого состоит г следующем. Исследуемые целлюлозные материалы помещают в большие стеклянные банки и заливают средой Вильджона и Фреда. Последняя имеет следующий состав: 1.5 г Na NH4 НРO4∙4Н2O, 0,5 г КН2 РO4, 0.5 г К2НРO4, 0.4 г MgSO4, 0.1 г NaCl, по 1 капле 1%-ного раствора, 5.0 г пептона, 15.0 г фильтровальной бумаги, 2 г CaCO3, 1000 мл водопроводной воды. Значение pH среды равно 7.0. К ней добавляется 0.25% печеночного экстракта или 10% фекального экстракта. Количество материалов, подвергающихся испытанию, не должно превышать 3% от веса добавляемой питательной среды. Затем в сосуды добавляют 10% двух-трехсуточной хорошо бродящей культуры целлюлозных бактерий и помещают их в термостат на 60°. Для предотвращения всплывания материалов на них сверху накладывают груз. В качестве контроля производят сбраживание в таких же условиях испытуемых материалов, но не пропитанных соответствующими бактерицидными составами. В зависимости от характера испытуемых материалов их извлекают из сосудов через различное число дней и производят определение их прочности на разрыв с помощью специальных приборов. На основании работы о термофильных клетчаткуразрушающих бактериях своеобразный метод обработки каучуконосов предложил Филиппов (1945). Он рекомендовал использовать в буртах из каучуконосов добавки навоза. Богатый питательными для микробов веществами навоз способствует бурному развитию микрофлоры и возникновению термогенеза. Развившиеся в среде термофилы обусловливают быстрое освобождение каучука от клетчатки. Клетчатка должна составлять 6—8% массы питательной среды. Питательная среда заражается обогащенной культурой термофильных целлюлозных бактерий или конским навозом, богатым термофильной микрофлорой. Брожение проводят при 50—60° в продолжение 5—7 дней. Химический состав получающихся при брожении клетчатки продуктов разбирался в общей части настоящей работы. Надо, однако, иметь в виду, что в практической обстановке дело приходится иметь не с чистой целлюлозой, а с растительным материалом, в состав которого входят разнообразные соединения. Их присутствие сильно сказывается на выходах, так как эти вещества также перерабатываются смешанной микрофлорой закваски. Неудивительно поэтому, что состав конечных продуктов брожения в отдельных случаях довольно сильно варьирует. Это зависит как от применения нестандартных заквасок, так и от пестроты используемого растительного материала. Получение высокоактивных штаммов микроорганизмов. Методы современной селекции продуцентов основываются на генетическом конструировании in vivo и in vitro. Генетическое конструирование in vivo: позволяет получить и выделить мутанты, используя различные способы обмена генетической информацией между живыми микробными клетками. Генетическое конструирование in vitro: основано на введении индивидуальных фрагментов ДНК в живую клетку с получением рекомбинантных генетических структур с заданными свойствами Стратегия селекционной работы с микроорганизмами заключается в поиске природных форм, которые обладают какими-либо полезными для человека свойствами (синтез ценных соединений, высокая скорость роста, способность к усвоению дешевых и доступных субстратов и т. д.), а же дальнейшем их улучшении, создании на их основе промышленных штаммов. Эта задача решается обычно путем изменения регуляции метаболической активности клетки. Современные тенденции развития селекции продуцентов – конструи­рование промышленных штаммов с заданными свойствами с использова­нием новейших достижений фундаментальных отраслей биологии в сочетании с приемами классической селекции. Накопление желаемых микроорганизмов происходит за счет создания элективных условий культивирования, благоприятных для данной группы. Для этого нужно учитывать физиолого-биохимические особенности выделяемой культуры. Избирательного подавления роста определенных групп микроорганизмов можно достичь внесением в среду антибиотиков. Например, для получения накопительной культуры азотфиксирующих микроорганизмов следует приготовить среду без связанных форм азота. Для замедления развития грамположительных бактерий можно добавить пенициллин. Получение накопительных культур представляет собой основной этап процесса, который позволяет получить чистые культуры. Оно также дает возможность оценить различные воздействия факторов окружающей среды на смешанную микробную популяцию, благодаря которым может происходить отбор микроорганизмов, способных взаимодействовать со специфическими субстратами или хорошо расти в необычных условиях. Выделение чистой культуры данного микроорганизма будет успешным, если он присутствует в смешанной популяции в достаточно высокой концентрации. Как правило, накопительные культуры получают в закрытых системах, т. е. микроорганизмы выращивают в обычных периодических (стационарных) условиях на чашках Петри, в колбах или пробирках, где в среде культивирования концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма постоянно изменяется в процессе роста клеток. Для получения накопительных культур используются также открытые хемостатные системы, позволяющие контролировать концентрацию питательных веществ, лимитирующих рост клеток, что, в свою очередь, может избирательно влиять на скорость роста различных организмов в смешанной культуре, в результате чего какой-то микроорганизм начинает количественно преобладать. Для выделения микроорганизмов в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего используют способ изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, применяя при этом метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Тема 2. Общие закономерности жизнедеятельности микроорганизмов Общая характеристика микроорганизмов. Отличительный признак микроорганизмов - крайне малые размеры отдельной особи. Диаметр бактерий не превышает 0,001 мм. В микробиологии пользуются единицей измерения - микрон, 1 мкм = 10-3 мм. Детали структуры микроорганизмов измеряют в нанометрах (1 нм = 10-3 мкм = 10-6 мм). Благодаря небольшим размерам микроорганизмы легко перемещаются с током воздуха, по воде. Быстро распространяются. Одной из важнейших свойств микроорганизмов является их способностью к размножению. Возможности миорганизмов к быстрому размножению намного превосходят животных и растения. Некоторые бактерии могут делиться каждые 8-10 мин. Так из одной клетки массой 2,5· 10-12 гр. за 2-4 сутки в благоприятных условиях могла бы образоваться биомасса порядка 1010 тонн. Другой отличительной характеристикой миорганизмов является разнообразие их физиологических и биохимических свойств . Некоторые миорганизмы могут расти в экстремальных условиях. Значительное число миорганизмов могут жить при температуре - 1960С (температура жидкого азота). Другие виды миорганизмов - термофильные м/организмы, рост которых наблюдается при 800С и выше. Многие микроорганизмы устойчивы к высокому гидростатическому давлению (в глубинах морей и океанов; месторождениях нефти). Также многие миорганизмы сохраняют жизнедеятельность в условиях глубокого вакуума. Некоторые миорганизмы выдерживают высокие дозы ультрафиолетовой или ионизирующей радиации. Морфологические особенности: форма, размеры, строение клеток; химический состав. Изучением строения клетки занимается цитология(от латинского cytos – клетка и logos – учение). Клетка – это ограниченная активной мембраной, упорядоченная, структурированная система биополимеров, образующих цитоплазму и ядро, участвующих в единой совокупности метаболических, энергетических и информационных процессов и осуществляющих поддержание и воспроизведение всей системы в целом. Размер клеток может быть различным. Некоторые шаровидные бактерии имеют ничтожные размеры: от 0,2 до 0,5 мкм в диаметре (напомним, что 1 мкм в тысячу раз меньше 1 мм). В то же время существуют клетки, которые видны невооруженным глазом. Например, яйцо птицы – это, в сущности, одна клетка. Яйцо страуса достигает в длину 17,5 см, и это самая крупная клетка. Однако, как правило, размеры клеток колеблются в значительно более узких пределах – от 3 до 30 мкм. Формы клеток также очень разнообразны. Клетки живых организмов могут иметь вид шара, многогранника, звезды, цилиндра и других фигур. Формы клеток: 1 - клетка крови - лимфоцит; 2 - клетка печени - гепатоцит; 3 - клетка костной ткани - остеобласт; 4 – клетка мерцательного эпителия; 5 - бокаловидная клетка слизистой оболочки толстой кишки; 6 - мужская половая клетка (сперматозоид); 7 - клетка нервной ткани - нейрон Несмотря на то, что клетки имеют разные формы и размеры, выполняют различные и часто весьма специфические функции, они, в принципе, имеют одинаковое строение, то есть у них можно выделить общие структурные единицы.. Иногда после деления дочерние клетки остаются связанными друг с другом с помощью тонких цитоплазматических перемычек. Есть примеры безъядерных клеток, имеющих в своем составе только клеточную мембрану и цитоплазму, они обладают ограниченными функциональными возможностями, так как лишены способности к самообновлению и воспроизводству, в связи с отсутствием ядра. Клеточная мембрана представляет собой оболочку, отделяющую содержимое клетки от внешней среды или соседних клеток. Основу клеточной мембраны составляет двойной слой липидов, в который погружены белковые молекулы, некоторые из них выполняют функцию рецепторов. Снаружи мембрана покрыта слоем гликопротеинов – гликокаликсом. Одна из основных функций клеточной мембраны – барьерная, поскольку она ограничивает свободное перемещение веществ между цитоплазмой и внешней средой. Выросты (реснички мерцательного эпителия дыхательных путей, микроворсинки клеток кишечного эпителия) на клеточной мембране могут участвовать в процессах всасывания веществ внутрь клетки. Они значительно увеличивают площадь клеточной мембраны и наиболее характерны для эпителиальных клеток. Например, клетка кишечного эпителия имеет до 3000 микроворсинок, что увеличивает общую поверхность тонкой кишки до 200-300 м2 и способствует интенсивному всасыванию питательных веществ. Физические, химические и биологические факторы. Развитие и жизнедеятельность микроорганизмов зависят от среды их обитания. Чем благоприятнее условия жизни, тем интенсивнее развиваются микроорганизмы, и наоборот, чем условия менее благоприятны, тем медленнее происходит их развитие. Знание основных условий взаимодействия между средой и микроорганизмами позволяет разработать мероприятия по успешной борьбе с ним или по эффективному использованию микроорганизмов в производственных процессах. Регулируя условия внешней среды, можно не только управлять жизнедеятельностью микроорганизмов, но и вызвать у них желаемые изменения, получить новые, более полезные формы микроорганизмов. На развитие микроорганизмов влияют физические, химические и биологические факторы. Физические факторы К физическим факторам относятся температура, влажность среды, концентрация в ней растворенных веществ, осмотическое давление, свет. Температура. Это один из главных факторов, определяющих жизнедеятельность микроорганизмов. Каждый из видов микроорганизмов может развиваться лишь при определенных пределах температуры. Для одних видов микроорганизмов эти пределы сравнительно узки, для других — относительно широки (десятки градусов). Наименьшая температура, при которой еще могут развиваться микроорганизмы, называется минимальной. Температура, при которой развитие микроорганизмов идет наиболее интенсивно, называется оптимальной. Наивысшая температура, при которой еще происходит развитие микроорганизмов, называется максимальной. При переходе температурных условий за границы минимальной и максимальной температур развитие микроорганизмов прекращается. При понижении температуры вплоть до глубокого замораживания происходит замедление и прекращение их жизнедеятельности. Однако после размораживания при повышении температуры до оптимальной микробы вновь начинают размножаться. Поэтому в замороженных и оттаявших или охлажденных и вновь нагревшихся молочных продуктах может происходить интенсивное размножение микроорганизмов, приводящее к быстрой порче продуктов. При повышении температуры выше максимальной микроорганизмы погибают. Температура, при которой происходит гибель микроорганизма, называется смертельной. Для временного прекращения или замедления микробиологических процессов при транспортировании и хранении молочные продукты охлаждают и замораживают, для уничтожения нежелательной микрофлоры — нагревают до высоких температур. По отношению к температуре микроорганизмы обычно разделяют на следующие группы: психотрофные, мезофильные и термофильные. Психотрофные микроорганизмы хорошо растут при низких температурах. Для них характерен температурный минимум в пределах от —10 до 0°С, оптимум — от 10 до 20 °С и максимум — около 30 °С. Эти микроорганизмы развиваются обычно в молоке и молочных продуктах в процессе хранения при низких температурах и вызывают их порчу. К ним относятся флюоресцирующие бактерии, некоторые плесневые грибы. Мезофильные микроорганизмы развиваются при средних температурах. Температурный минимум для них 0—10 °С, оптимум 25—35 °С, максимум 40—50 °С. Эта группа микроорганизмов наиболее широко распространена в природе. В нее входит большинство микроорганизмов, встречающихся в молоке и молочных продуктах, — мезофильные молочнокислые стрептококки и палочки, бактерии группы кишечной палочки, уксуснокислые, маслянокислые и пропионовокислые бактерии, дрожжи и др. Термофильные микроорганизмы развиваются при повышенной температуре. Температурный минимум их развития 25—30 °С, оптимум 50—60 °С, максимум 70—80 °С. Отдельные виды этих бактерий не размножаются при температуре ниже 45 °С, хотя некоторые из них могут развиваться и при 25 °С. Из этой группы в молоке наиболее часто встречаются термофильные молочнокислые стрептококки и палочки, а также споровые бактерии. Указанные температурные границы развития для разных групп микроорганизмов установлены в условиях, когда микроорганизм размножался в чистой культуре. В природе и в производственных условиях одни микроорганизмы обычно развиваются вместе с другими. В этих случаях температурные границы развития для отдельных микроорганизмов могут заметно изменяться. Так, термофильные молочнокислые палочки, которые в чистой культуре при 30 °С развиваются очень медленно, при совместном развитии с мезофильными молочнокислыми стрептококками размножаются достаточно интенсивно, что часто приводит к возникновению в молочных продуктах порока — излишняя кислотность. Влажность среды. В клетках большинства микроорганизмов содержится до 75—85 % воды. Питательные вещества поступают в клетку с водой, с ней же удаляются из клетки продукты ее жизнедеятельности. Вода поддерживает необходимое натяжение клеточной оболочки. Поэтому развитие микробов возможно только при наличии в субстрате определенного количества доступной для них воды. С уменьшением влажности субстрата интенсивность размножения микробов понижается, а при удалении влаги из него (ниже определенного уровня) совсем прекращается. Развитие бактерий приостанавливается обычно при влажности среды около 25 %, плесеней — около 15 %. В высушенном состоянии жизнедеятельность микроорганизмов обычно заметно не проявляется, но она сохраняется в течение длительного времени. Особенно устойчивы споры, которые сохраняются в высушенном состоянии многие годы. Увлажнение высушенных продуктов при хранении и транспортировании ведет к их порче в результате возобновления развития оставшихся микроорганизмов. В молочной промышленности влагу из молока и молочных продуктов удаляют отжиманием (масло, творог), сепарированием (творог), выпариванием (сгущенное молоко), высушиванием (сухое молоко). Удаление влаги отжиманием микроорганизмы переносят лучше, чем выпариванием или сушкой. Это объясняется тем, что в первом случае концентрация оставшейся влаги не изменяется и в ней микроорганизмы могут попрежнему развиваться. При выпаривании и высушивании повышается концентрация веществ в оставшейся влаге и соответственно повышается осмотическое давление, что неблагоприятно сказывается на развитии микроорганизмов. Концентрация растворенных в среде веществ. Большинство микроорганизмов может существовать в средах со сравнительно невысокой концентрацией растворенных веществ и обладает значительной чувствительностью к ее колебаниям. Повышение концентрации веществ в среде приводит к нарушению обмена веществ между нею и средой и затем к прекращению жизнедеятельности клетки или ее гибели. Некоторые микроорганизмы способны сохранять жизнедеятельность в условиях повышенной концентрации растворенных веществ длительное время. Плесени переносят повышение концентрации веществ, как и другие неблагоприятные воздействия среды, лучше, чем бактерии. Губительное воздействие на микроорганизмы среды с высокой концентрацией веществ используется в молочной промышленности при консервировании молочных продуктов солью и сахаром. При содержании в среде поваренной соли до 3 % замедляется развитие некоторых микроорганизмов. При концентрации в продукте около 5 % соли полностью подавляется жизнедеятельность молочнокислых, а при 10 % — гнилостных бактерий. Малоустойчивы к воздействию поваренной соли многие возбудители пищевых заболеваний, например сальмонеллы и бациллы ботулизма. Зато коагулазоположительные стафилококки более устойчивы по отношению к соли, чем молочнокислые бактерии. Концентрация соли в молочных продуктах редко достигает величин, способствующих полному подавлению развития микроорганизмов, однако в какойто мере она, безусловно, играет роль консерванта (соленое масло, творожные изделия, сыры). Жизнедеятельность микроорганизмов замедляется также при концентрации в среде сахара (60—70 %). Этот способ консервирования применяют при производстве сгущенного молока с сахаром, в котором концентрация сахара достигает 63,5—64 %. Однако консервирующее действие сахара и при этих концентрациях не всегда оказывается полным, поэтому его сочетают с одновременным нагреванием продукта в процессе производства. Свет. Прямой солнечный свет губителен для большинства микроорганизмов, рассеянный свет лишь подавляет их развитие. Особенно чувствительны к воздействию света болезнетворные микроорганизмы. Внутрь молока и молочных продуктов свет не проникает. Наиболее активной частью солнечного света являются ультрафиолетовые лучи. Специальные бактерицидные лампы, излучающие ультрафиолетовые лучи, используют для стерилизации воздуха производственных помещений (заквасочные отделения, микробиологические боксы и т. д. Если лампы включены, люди не должны находиться в помещении. При обработке ультрафиолетовыми лучами молока (в тонком слое) отмечается ухудшение его вкусовых и снижение питательных свойств. Химические факторы К химическим факторам относятся реакция и окислительно-восстановительные условия среды, наличие в ней необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов веществ, а также веществ, подавляющих их развитие, присутствие кислорода воздуха. Реакция среды. Степень кислотности или щелочности среды оказывает большое влияние на жизнедеятельность микроорганизмов. Большинство бактерий лучше развивается при нейтральной, дрожжи и плесени — при кислой реакции среды. В молоке и молочных продуктах чаще всего протекают процессы, в результате которых реакция среды становится кислой. Это происходит в результате развития молочнокислых бактерий, вырабатывающих молочную кислоту. Окислительно-восстановительные условия среды. Эти условия характеризуются способностью среды восстанавливать или окислять находящиеся в ней вещества, в результате чего может изменяться направление брожения и образование конечных его продуктов. Так, в закваске для масла аромат образуется только в том случае, если закваска обладает слабыми восстанавливающими свойствами. При активном размножении микроорганизмов в молоке накапливаются восстановительные ферменты (так называемые редуктазы) и оно приобретает способность к восстановлению веществ. Если к такому молоку добавить вещество, цвет которого при восстановлении меняется, то по скорости обесцвечивания можно косвенно определить примерное количество микроорганизмов. Это свойство используют в молочной промышленности для определения обсемененности сырого молока микробами. В качестве веществ, подвергающихся восстановлению, при проведении редуктазной пробы применяют метиленовый голубой и резазурин. Вещества, необходимые для развития микроорганизмов. Молоко является прекрасной средой для развития многих микроорганизмов. В нем имеются необходимые для питания азотистые соединения (белки, пептоны, пептиды, аминокислоты), витамины, лактоза (молочный сахар) как основной энергетический материал, молочный жир, который некоторые микроорганизмы также способны использовать в качестве энергетического материала. Из всей микрофлоры молока и молочных продуктов наибольшие требования к наличию питательных веществ в молоке предъявляют молочнокислые бактерии. Многие из них нуждаются в наличии свободных аминокислот и витаминов. Содержание этих веществ может меняться под влиянием ряда факторов — периода года, лактации, кормления животных. Потребности в источниках питания у молочнокислых бактерий могут меняться в зависимости от стадии их развития. Так, молочнокислые палочки в начале своего размножения в среде нуждаются в наличии дополнительных питательных веществ (аминокислот, витаминов). В дальнейшем они способны разлагать белок молока на составные части и получать необходимые аминокислоты и полипептиды самостоятельно. Молочнокислые стрептококки обладают меньшей способностью к протеолизу белков молока, но в начале своего развития требуют меньшего содержания аминокислот и витаминов. В целом протеолитическая активность молочнокислых бактерий в молоке сравнительно невелика, однако для самих микроорганизмов она имеет очень большое значение. Способность молочнокислых бактерий к разложению казеина, т. е. к добыванию питательных веществ, определяет возможность их активного развития в молоке и энергичного кислотообразования. Установлено, что культуры молочнокислых палочек и стрептококков, обладающие более высокой протеолитической активностью (способностью к разложению казеина), накапливают в молоке больше кислоты. При совместном развитии молочнокислых бактерий с другими микроорганизмами, например дрожжами, уксуснокислыми бактериями, способными к протеолизу белка и синтезу витаминов, происходит активизация жизнедеятельности молочнокислых бактерий. Белки молока служат для молочнокислых бактерий не только источником необходимых питательных веществ, но оказывают на них и определенное защитное воздействие, связывая образующуюся молочную кислоту. Этим объясняется тот факт, что по мере обогащения продуктов белком повышается способность молочнокислых бактерий сбраживать лактозу. Так, если в молоке молочнокислые стрептококки могут перерабатывать лишь около 1 % молочного сахара, то при производстве творога его сбраживается уже до 2 %. При развитии молочнокислых стрептококков предельная кислотность сыворотки достигает 70-80 °С, молока 120, творога около 200 °С и выше. Вещества, подавляющие развитие микроорганизмов. Среди химических веществ в среде могут оказаться и ядовитые вещества. Проникнув в клетку, они соединяются с элементами цитоплазмы, нарушают обмен веществ, клетка гибнет. На микроорганизмы оказывают ядовитое воздействие соли тяжелых металлов (ртути, серебра и пр.), хлор, йод, перекись водорода, марганцовокислый калий, сернистая кислота и сернистый газ, углекислота, спирты, органические кислоты, антибиотики и другие соединения. В молочной промышленности часть этих веществ используют для борьбы с микроорганизмами. Этиловый спирт применяют для обработки микробиологических инструментов и материалов при культивировании кефирных грибков, кислоты и щелочи — для мойки оборудования молочной промышленности. Хлорсодержащие (хлорная известь, гипохлориты) и йодсодержащие (йодофор) соединения оказывают сильное бактерицидное (убивающее воздействие на микроорганизмы. Четырехзамещенные аммонийные соединения относятся к поверхностно-активным веществам, некоторые из которых обладают, активным бактерицидным действием. Перекись водорода уничтожает значительную часть (до 85 %) микрофлоры молока, разлагаясь при этом. Остатки перекиси водорода разрушаются в молоке при добавлении к нему фермента каталазы. Однако введение любых посторонних химических веществ в молоко нежелательно, поэтому перекись водорода не находит широкого применения в молочной промышленности. Кислоты, образующиеся в молоке, или добавленные в него, оказывают сильное угнетающее воздействие на многие микроорганизмы. Молочная кислота, накапливающаяся в результате молочнокислого брожения, подавляет развитие многих микроорганизмов, вызывающих порчу молока и молочных продуктов, в первую очередь гнилостных. Добавление сорбиновой кислоты к молочным продуктам — плавленым сырам, молочным консервам, творогу — задерживает развитие плесени. Диоксид углерода оказывает заметное подавляющее воздействие на развитие плесеней. Антибиотики — это вещества, вырабатываемые некоторыми микроорганизмами (плесенями — пенициллин, актиномицетами; бактериями), которые подавляют развитие других микроорганизмов. Эти вещества широко применяют в медицине для лечения многих заболеваний. Широко применяют антибиотики и в ветеринарии, в частности, при лечении маститов. Антибиотики в течение периода их применения и нескольких дней после этого выделяются вместе с молоком из вымени животного. Антибиотики могут попадать в молоко также при скармливании коровам кормов, предназначенных для других животных, например свиней. В такие корма они вводятся специально. Молоко, содержащее антибиотики, на предприятия молочной промышленности не сдают. Наличие антибиотиков в молоке приводит к нарушению процесса сквашивания при производстве заквасок, сыров и кисломолочных продуктов. Микроорганизмы молока проявляют различную чувствительность по отношению к антибиотикам, содержащимся в молоке. Термофильные молочнокислые палочки и стрептококки примерно в 10 раз более чувствительны по отношению к антибиотикам, чем мезофильные молочнокислые стрептококки. Коагулазоположительные стафилококки проявляют по отношению к антибиотикам значительно большую устойчивость, чем молочнокислые стрептококки. В молоко могут попадать и другие вещества, применяемые в ветеринарии, — формалин, хлорная известь и др. Они также оказывают подавляющее воздействие на молочнокислые бактерии и вредны для здоровья человека. Все эти вещества, включая антибиотики, называют ингибирующими. Для их определения, применяют специальные методы, основанные на использовании чувствительных микроорганизмов. Биологические факторы В природе и в производственных условиях микроорганизмы никогда не развиваются в чистой культуре. Развитие одного вида микробов протекает обычно одновременно с развитием других видов. Под влиянием совместного развития с другими микроорганизмами у микроба данного вида могут изменяться отдельные важные свойства — отношение к температуре, питательным веществам, способность к образованию тех или иных продуктов обмена и т. д. Взаимоотношения между микроорганизмами при их совместном развитии носят разнообразный характер. В микробиологии говорят о симбиозе, если два или более различных вида микроорганизмов развиваются в совместной культуре и способствуют взаимному развитию. Часто микроорганизмы при совместном развитии приобретают способность к развитию в условиях, в которых каждый в отдельности не может развиваться. Примером симбиотических взаимоотношений между представителями микрофлоры молока является кефирный грибок, в котором совместно развиваются несколько видов молочнокислых бактерий, дрожжи, уксуснокислые бактерии. Симбиотический характер носят взаимоотношения молочнокислых бактерий и дрожжей, применяемых при производстве молочных продуктов, молочнокислых и уксуснокислых бактерий, между разными видами молочнокислых бактерий, например, между некоторыми видами стрептококков и палочек. Если взаимная польза не выражена столь отчетливо, но сожительство не приносит вреда микроорганизмам, то говорят о комменсализме. Примером может служить нормальная микрофлора кишечника человека. Между микроорганизмами очень распространены взаимоотношения, когда жизнедеятельность одних микробов способствует развитию других, расщепляя, например, недоступные для них продукты на более простые или образуя необходимые для них соединения. Этот тип взаимоотношений называют метабиозом. Между микроорганизмами распространены также антагонистические взаимоотношения, когда продукты жизнедеятельности одного вида микробов неблагоприятно действуют на другой или даже вызывают его гибель. Случаи антагонизма могут сводиться к потреблению одним микробом питательных веществ, необходимых другому, выделению одним микробом продуктов обмена, вредных для развития другого, выделению одним микробом специфических веществ, убивающих другие микроорганизмы. Например, молочная кислота, являющаяся продуктом обмена молочнокислых бактерий, оказывает резкое угнетающее воздействие на гнилостные, болезнетворные и другие микроорганизмы молока. Специфические вещества, выделяемые микроорганизмами и оказывающие губительное воздействие на другие, называются антибиотиками. Среди молочнокислых бактерий имеются виды, образующие специфические антибиотические вещества, угнетающие развитие ряда микроорганизмов. Так, ацидофильные бактерии вырабатывают вещества, подавляющие развитие возбудителей дизентерии и брюшного тифа, дрожжи, сбраживающие лактозу, туберкулезную палочку, некоторые мезофильные молочнокислые стрептококки вырабатывают антибиотическое вещество низин, угнетающий развитие маслянокислых, а также некоторых молочнокислых бактерий. Среди микроорганизмов встречаются также паразитические взаимоотношения, когда один микроорганизм использует для питания живые вещества другого. Примером паразитизма может служить развитие бактериофага в бактериальной клетке. Обмен веществ и питание микроорганизмов. Обмен веществ (метаболизм) - это совокупность химических превращений веществ, которые протекают в клетке в тесном взаимодействии с окружающей средой. Обмен веществ у микроорганизмов слагается из двух процессов: процессов конструктивного обмена (питание) и энергетического (дыхание). Процесс питания организма состоит из поступления и усвоения пищи (ассимиляция). Поступившие извне вещества сначала расщепляются на более простые (распад или катаболизм) и из этих разнообразных низкомолекулярных соединений синтезируются сложные вещества (анаболизм). Это так называемый строительный обмен, поскольку постоянно происходит обновление клеточной структуры организма. Этот процесс преобладает в период роста. Дыхание организма состоит из процессов расщепления и окисления органических веществ (диссимиляция), которая сопровождается освобождением энергии, необходимой для жизни и осуществления синтетических процессов. Этот процесс начинает преобладать у организмов к старости. Оба эти противоположных процесса находятся в тесной взаимосвязи и взаимозависимости. Они неотделимы один от другого, обуславливают рост, развитие и размножение организма. Конечные продукты обмена веществ выделяются во внешнюю среду. Особенностью микробов является необычайно интенсивный обмен веществ. За сутки при благоприятных условиях одна клетка потребляет пищи (по массе) в 30-40 раз больше массы своего тела. Основная часть пищи расходуется в энергетическом обмене, при котором выделяется в среду большое количество продуктов обмена: кислот, спиртов, углекислого газа, водорода и др. Эта особенность микроорганизмов широко используется в практике переработки растительного и животного пищевого и непищевого сырья; она же вызывает явление быстрой порчи пищевых продуктов. Такая способность обусловливается наличием у микроорганизмов большого разнообразия ферментов. Микроорганизмы не имеют специальных органов питания. Поступление питательных веществ и воды в клетку и выделение продуктов обмена во внешнюю среду происходит через всю поверхность клеток. Проникновение питательных веществ в клетку всегда осуществляется за счет явлений осмоса и диффузии. Явление осмоса всегда возникает там, где есть два раствора с разной концентрацией веществ, разделенных между собой полупроницаемой мембраной. Проникновение через полупроницаемую перегородку воды и растворенных в ней веществ происходит по-разному. Вода всегда стремится в сторону большей концентрации, чтобы разбавить раствор. Скорость движения будет тем больше, чем больше будет разность концентраций растворенных веществ по обе стороны полупроницаемой мембраны. Каждое растворенное вещество движется в ту сторону, где его концентрация ниже. Движущей силой будет возникшее осмотическое давление т. е. та энергия, с какой оба вещества будут стремиться выровнять свою концентрацию. Проникновение каждого вещества через перегородку прекращается лишь тогда, когда по обе стороны концентрация его станет одинаковой. В зависимости от концентрации веществ в окружающей среде микробная клетка может находиться в трех состояниях. Тургoр - если осмотическое давление микробных клеток, обусловленное растворенными в клеточном соке веществами, несколько выше, чем в среде, то за счет притока из нее воды в клетке создается определенное упругое напряжение. Протопласт клетки при этом прижимается к клеточной оболочке, слегка растягивая ее. Находясь на пищевых продуктах в таком состоянии, микробы проявляют большую активность и быстро вызывают порчу. Поэтому в пищевой промышленности часто используются такие методы консервирования пищевых продуктов, как сушка и вяление, чтобы микробы не переходили в состояние тургора и не вызывали их порчу. Плазмолиз если микроорганизм попадает в субстрат, осмотическое давление которого выше, чем в клетке, то цитоплазма отдает воду во внешнюю среду. Питательные вещества в клетку не поступают, содержимое клетки уменьшается в объеме, и протопласт отстает от клеточной оболочки. Это явление широко используется в пищевой промышленности, когда продукты питания консервируются сахаром и солью. Плазмомтис - явление, обратное плазмолизу. Наступает при чрезмерно низком осмотическом давлении внешней среды, когда вследствие высокой разности осмотических давлений цитоплазма быстро переполняется водой. Это может привести к разрыву клеточной оболочки, что наблюдается, например, при помещении бактерий в дистиллированную воду. Требования большинства микроорганизмов к источникам питания разнообразны. Однако, учитывая некоторые общие особенности питания микробов, их принято делить на две группы. I. Автотрофы - питаются, подобно зеленым растениям, минеральными веществами, синтезируя из этих простых веществ все сложные компоненты клетки. Автотрофные (от греч. аutos - сам, trophe - пища) микроорганизмы способны в качестве единственного источника углерода для синтеза органических веществ тела использовать углекислоту и ее соли. Среди автотрофных микроорганизмов имеются виды, которые ассимилируют углекислый газ, как и зеленые растения, используя солнечную энергию, - их называют - фотосинтезирующими. К ним относятся некоторые пигментные бактерии, например зеленые и пурпурные серобактерии. Другие автотрофные микроорганизмы в процессе синтеза органических соединений используют энергию химических реакций окисления некоторых минеральных веществ. Такие микроорганизмы называют хемосинтезирующими. К ним относятся бактерии, окисляющие водород с образованием воды (водородные бактерии), аммиак в азотистую кислоту (нитрифицирующие бактерии), сероводород до серной кислоты (бесцветные серобактерии). II. Гетеротрофы (от греч. heteros - другой) - подобно животным организмам нуждаются в органических соединениях, которые служат одновременно источником углерода и энергии. Их подразделяют на две группы: - сапрофиты (от греч. sapros - гнилой, phyton - растение) - они живут за счет использования органических веществ различных субстратов животного и растительного происхождения. К ним относятся все те микробы, которые разлагают органические вещества в природе (в почве, воде), вызывают порчу пищевых продуктов или используются в процессах переработки растительного и животного сырья; - паразиты - они способны развиваться только в теле других организмов, питаясь органическими веществами, входящими в состав последних. К паразитам принадлежат возбудители заболеваний человека, животных и растений. Влияние внешней среды на жизнедеятельность микроорганизмов. Изменение условий внешней среды оказывает воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов. Физические, химические, биологические факторы среды могут ускорять или подавлять развитие микробов, могут изменять их свойства или даже вызывать гибель. К факторам среды, оказывающим наиболее заметное действие на микроорганизмы, относятся влажность, температура, кислотность и химический состав среды, действие света и других физических факторов. Влажность Микроорганизмы могут жить и развиваться только в среде с определенным содержанием влаги. Вода необходима для всех процессов обмена веществ микроорганизмов, для нормального осмотического давления в микробной клетке, для сохранения ее жизнеспособности. У различных микроорганизмов потребность в воде не одинакова. Бактерии относятся в основном к влаголюбивым, при влажности среды ниже 20 % их рост прекращается. Для плесеней нижний предел влажности среды составляет 15%, а при значительной влажности воздуха и ниже. Оседание водяных паров из воздуха на поверхность продукта способствует размножению микроорганизмов. При снижении содержания воды в среде рост микроорганизмов замедляется и может совсем прекращаться. Поэтому сухие продукты могут храниться значительно дольше продуктов с высокой влажностью. Сушка продуктов позволяет сохранять продукты при комнатной температуре без охлаждения. Некоторые микробы очень устойчивы к высушиванию, некоторые бактерии и дрожжи в высушенном состоянии могут сохраняться до месяца и более. Споры бактерий и плесневых грибов сохраняют жизнеспособность при отсутствии влаги десятки, а иногда и сотни лет. Температура Температура — важнейший фактор для развития микроорганизмов. Для каждого из микроорганизмов существует минимум, оптимум и максимум температурного режима для роста. По этому свойству микробы подразделяются на три группы: • психрофилы — микроорганизмы, хорошо растущие при низких температурах с минимумом при -10-0 °С, оптимумом при 10-15 °С; • мезофилы — микроорганизмы, для которых оптимум роста наблюдается при 25-35 °С, минимум — при 5-10 °С, максимум — при 50-60 °С; • термофилы — микроорганизмы, хорошо растущие при относительно высоких температурах с оптимумом роста при 50-65 °С, максимумом — при температуре более 70 °С. Большинство микроорганизмов относится к мезофилам, для развития которых оптимальной является температура 25-35 °С. Поэтому хранение пищевых продуктов при такой температуре приводит к быстрому размножению в них микроорганизмов и порче продуктов. Некоторые микробы при значительном накоплении в продуктах способны привести к пищевым отравлениям человека. Патогенные микроорганизмы, т.е. вызывающие инфекционные заболевания человека, также относятся к мезофилам. Низкие температуры замедляют рост микроорганизмов, но не убивают их. В охлажденных пищевых продуктах рост микроорганизмов замедленно, но продолжается. При температуре ниже О °С большинство микробов прекращают размножаться, т.е. при замораживании продуктов рост микробов останавливается, некоторые из них постепенно отмирают. Установлено, что при температуре ниже О °С большинство микроорганизмов впадают в состояние, похожее на анабиоз, сохраняют свою жизнеспособность и при повышении температуры продолжают свое развитие. Это свойство микроорганизмов следует учитывать при хранении и дальнейшей кулинарной обработке пищевых продуктов. Например, в замороженном мясе могут длительно сохраняться сальмонеллы, а после размораживания мяса они в благоприятных условиях быстро накапливаются до опасного для человека количества. При воздействии высокой температуры, превышающей максимум выносливости микроорганизмов, происходит их отмирание. Бактерии, не обладающие способностью образовывать споры, погибают при нагревании во влажной среде до 60-70 °С через 15-30 мин, до 80-100 °С — через несколько секунд или минут. У спор бактерий термоустойчивость значительно выше. Они способны выдерживать 100 °С в течение 1-6 ч, при температуре 120-130 °С споры бактерий во влажной среде погибают через 20-30 мин. Споры плесеней менее термостойки. Тепловая кулинарная обработка пищевых продуктов в общественном питании, пастеризация и стерилизация продуктов в пищевой промышленности приводят к частичной или полной (стерилизация) гибели вегетативных клеток микроорганизмов. При пастеризации пищевой продукт подвергается минимальному температурному воздействию. В зависимости от температурного режима различают низкую и высокую пастеризацию. Низкая пастеризация проводится при температуре, не превышающей 65-80 °С, не менее 20 мин для большей гарантии безопасности продукта. Высокая пастеризация представляет собой кратковременное (не более 1 мин) воздействие на пастеризуемый продукт температуры выше 90 °С, которая приводит к гибели патогенной неспороносной микрофлоры и в то же время не влечет за собой существенных изменений природных свойств пастеризуемых продуктов. Пастеризованные продукты не могут храниться без холода. Стерилизация предусматривает освобождение продукта от всех форм микроорганизмов, в том числе и спор. Стерилизация баночных консервов проводится в специальных устройствах — автоклавах (под давлением пара) при температуре 110-125°С в течение 20-60 мин. Стерилизация обеспечивает возможность длительного хранения консервов. Молоко стерилизуется метолом ультравысокотемпературной обработки (при температуре выше 130 °С) в течение нескольких секунд, что позволяет сохранить все полезные свойства молока. Реакция среды Жизнедеятельность микроорганизмов зависит от концентрации водородных (Н+) или гидроксильных (ОН-) ионов в субстрате, на котором они развиваются. Для большинства бактерий наиболее благоприятна нейтральная (рН около 7) или слабощелочная среда. Плесневые грибы и дрожжи хорошо растут при слабокислой реакции среды. Высокая кислотность среды (рН ниже 4,0) препятствует развитию бактерий, однако плесени могут продолжать расти и в более кислой среде. Подавление роста гнилостных микроорганизмов при подкислении среды имеет практическое применение. Добавление уксусной кислоты используется при мариновании продуктов, что препятствует процессам гниения и позволяет сохранить продукты. Образующаяся при квашении молочная кислота также подавляет рост гнилостных бактерий. Концентрация соли и сахара Поваренная соль и сахар издавна используются для повышения стойкости продуктов к микробной порче и лучшей сохранности пищевых продуктов. Повышение содержания растворенных веществ (соли или сахара) в питательной среде сказывается на величине осмотического давления внутри микроорганизмов, вызывает их обезвоживание. При повышении концентрации поваренной соли в субстрате более 3-4 % размножение многих, в том числе гнилостных, микроорганизмов замедляется, при концентрации более 7-12% — прекращается. Некоторые микроорганизмы нуждаются для своего развития в высоких концентрациях соли (20 % и выше). Их называют солелюбивыми, или галофилами. Они могут вызывать порчу соленых продуктов. Высокие концентрации сахара (выше 55-65 %) прекращают размножение большинства микроорганизмов, это используется при приготовлении из плодов и ягод варенья, джема или повидла. Однако эти продукты тоже могут подвергаться порче в результате размножения осмофильных плесеней или дрожжей. Свет Некоторым микроорганизмам свет необходим для нормального развития, но для большинства из них он губителен. Ультрафиолетовые лучи солнца обладают бактерицидным действием, т. е. при определенных дозах облучения приводят к гибели микроорганизмов. Бактерицидные свойства ультрафиолетовых лучей ртутно-кварцевых ламп используют для дезинфекции воздуха, воды, некоторых пищевых продуктов. Инфракрасные лучи тоже могут вызвать гибель микробов за счет теплового воздействия. Воздействие этих лучей применяют при тепловой обработке продуктов. Негативное воздействие на микроорганизмы могут оказывать электромагнитные поля, ионизирующие излучения и другие физические факторы среды. Химические факторы Некоторые химические вещества способны оказывать на микроорганизмы губительное действие. Химические вещества, обладающие бактерицидным действием, называют антисептиками. К ним относятся дезинфицирующие средства (хлорная известь, гипохлориты и др.), используемые в медицине, на предприятиях пищевой промышленности и общественного питания. Некоторые антисептики применяются в качестве пищевых добавок (сорбиновая и бензойная кислоты и др.) при изготовлении соков, икры, кремов, салатов и других продуктов. Биологические факторы Между различными микроорганизмами могут устанавливаться разные взаимоотношения: симбиоз- взаимовыгодные отношения; метабиоз — жизнедеятельность одного за счет другого без принесения вреда; паразитизм — жизнедеятельность одного за счет другого с причинением ему вреда; антагонизм — один из видов микроорганизмов угнетает развитие другого, что может привести к гибели микробов. Например, развитие молочнокислых бактерий угнетает рост гнилостных, эти антагонистические взаимоотношения используют при квашении овощей или для поддержания нормальной микрофлоры в кишечнике человека. Антагонистические свойства некоторых микроорганизмов объясняются способностью их выделять в окружающую среду вещества, обладающие антимикробным (бактериостатическим, бактерицидным или фунгицидным) действием, — антибиотики. Антибиотики продуцируются в основном грибами, реже бактериями, они оказывают свое специфическое действие на определенные виды бактерий или грибов (фунгицидное действие). Антибиотики применяются в медицине (пенициллин, левомицетин, стрептомицин и др.), в животноводстве в качестве кормовой добавки, в пищевой промышленности для консервирования пищевых продуктов (низин). Антибиотическими свойствами обладают фитонциды — вещества, обнаруженные во многих растениях и пищевых продуктах (лук, чеснок, редька, хрен, пряности и др.). К фитонцидам относятся эфирные масла, антоцианы и другие вещества. Они способны вызывать гибель патогенных микроорганизмов и гнилостных бактерий. В яичном белке, рыбной икре, слезах, слюне содержится лизоцим — антибиотическое вещество животного происхождения. Тема 3. Основы микробиологического производства Культуры микроорганизмов-продуцентов. Существует два способа культивирования микроорганизмов – продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный. Первый способ, применяемый для культивирования микроскопических грибов, характеризуется развитием мицелия на поверхности твердого или жидкого субстрата. На жидком субстрате образуется пленка мицелия, продуцирующего не только амилолитические ферменты, но и органические кислоты, инактивирующие их, поэтому используют твердые субстраты с развитой поверхностью – пшеничные отруби, дробину барды, картофельную мезгу и др. Максимальная активность ферментов достигается при культивировании грибов на пшеничных отрубях. Дробина барды бедна питательными веществами, и активность ферментов в культурах грибов, выращенных на ней, в 4-5 раз ниже, чем на отрубях. Зрелая культура грибов вследствие обволакивания частиц отрубей мицелием имеет вид плотной войлокообразной массы. При поверхностном культивировании пшеничные отруби должны быть увлажнены и простерилизованы. В стерильных условиях готовят посевную культуру, но выращивают грибы в нестерильных условиях в кюветах, устанавливаемых в негерметичных растильных камерах. Теплоту, выделяющуюся в процессе роста грибов, удаляют продуванием через растильную камеру стерильного кондиционированного воздуха. Поверхностный способ выращивания микроскопических грибов имеет ряд преимуществ. Так как во время роста гриба отруби не перемешиваются, посторонние микроорганизмы не распространяются по всей их массе и вызывают лишь незначительное местное инфицирование, которое, как правило, не влияет на активность ферментов. Это, однако, не исключает необходимости тщательной стерилизации воздуха, среды и оборудования. Культуру на отрубях высушивают до содержания влаги 10-11%. В таком виде она может храниться продолжительное время без значительной потери активности. Это позволяет организовать централизованное снабжение спиртовых заводов сухой культурой микроскопических грибов, что является одним из преимуществ поверхностного способа выращивания. Недостаток поверхностного способа – необходимость устанавливать множество кювет, работу с которыми трудно механизировать. Себестоимость культуры гриба-продуцента высока, причем в основном из-за затраты большого количества ручного труда. Механизация процесса выращивания возможна путем создания непрерывнодействующих установок или бескюветных аппаратов с вертикальным толстым слоем питательной среды и интенсивным продуванием воздуха через этот слой. Глубинную культуру микроорганизмов выращивают на жидкой питательной среде при энергичной аэрации в герметически закрытых аппаратах и в стерильных условиях. Процесс полностью механизирован. Стерильность глубинной культуры микроорганизма-продуцента ферментов положительно отражается на результатах сбраживания сусла дрожжами. Поверхностное культивирование микроскопических грибов. Питательные среды. При поверхностном культивировании твердой средой обычно служат пшеничные отруби, содержащие в достаточных количествах все вещества, необходимые для питания грибов. Лучшие результаты достигаются при содержании не менее 16% крахмала в отрубях или в другой питательной среде. Получение посевного материала. Для засева производственной питательной среды может быть использован посевной материал трех видов: споры, мицелий и спороносящая культура, выращенная на твердой питательной среде. Споровый материал готовят поверхностным культивированием гриба на твердой или жидкой питательной среде в специальных аппаратах с кюветами. В первом случае гриб выращивают в пробирке на косом агаре до обильного образования спор, затем спорами засевают колбы со стерильными пшеничными отрубями, наконец, спороносяшую культуру передают в специальный аппарат. По окончании спорообразования в этом аппарате отбирают споры посредством специального вибросепаратора при тщательной аспирации. Споры фасуют в полиэтиленовые мешочки, стеклянные или дюралюминиевые банки, в которых они могут сохраняться при температуре от 8 до 24°С около 1,5 лет. Во втором случае из спор, собранных в пробирке с косым агаром, готовят водную суспензию и ею засевают жидкую питательную среду, которую направляют в растильный аппарат. Из-под выросшей спороносящей пленки удаляют жидкую среду, пленку подсушивают, снимают с кювет, измельчают и упаковывают. Готовый споровый материал не содержит примеси среды и обладает высокой всхожестью (90-95%), которая сохраняется свыше 3 лет. Споры (конидии), полученные любым методом, обладают водоотталкивающей способностью и почти не смачиваются водой. Это свойство приводит к неравномерности засева среды и, следовательно, к неодинаковой скорости роста культуры. Смачиваемость спор можно улучшить, если добавить в их водную суспензию 25-50 мг поверхностно-активного вещества, например алкилбензолсульфата на 1 г спорового материала. При этом всхожесть спор остается без изменения. Для сокращения длительности культивирования микроскопических грибов в производственных условиях можно применять предварительное проращивание спор в течение 7 ч. в жидкой питательной среде до появления ростовых трубочек. При этом продолжительность лаг-фазы сокращается на 8-9 ч. и увеличивается оборачиваемость растильных камер. При использовании спорового материала упрощается технологический процесс, появляется возможность более полно механизировать его, а также сократить площадь цеха чистой культуры. Централизованное производство спорового материала для группы предприятий, работающих с данным штаммом гриба, выгодно создать в одном специализированном цехе чистой культуры. Положительный опыт подобной организации имеется в производстве лимонной кислоты биотехнологическим способом. Исследователями было предложено засевать производственную питательную среду мицелием, полученным глубинным культивированием гриба или бактерий в колбах на качалке. Культуру получают из лаборатории чистых культур. Исходная – музейная чистая культура хранится в холодильнике при температуре от 2 до 4°С. Один раз в месяц пересевают споры музейной культуры из пробирки в пробирку с сусло-агаром с соблюдением правил проведения микробиологических работ. При этом первая засеянная пробирка является музейной, а остальные две-три пробирки используют для дальнейшего размножения. Засеянные пробирки помещают в термостат при температуре 30°С и выдерживают в нем в течение 4-6 сут. При нормальном росте поверхность сусло-агара равномерно покрывается спороносящим мицелием. Культура гриба с плохим спороношением, медленно растущим мицелием, пушком вторичного роста в производство не допускается. Пробирки с выросшеи культурой вынимают из термостата и хранят в холодильнике. Перед посевом в колбы проверяют чистоту культуры высевом в чашки Петри и микроскопированием. Чистая культура на сусло-агаре служит исходным материалом для размножения грибов на пшеничных отрубях в колбах. Отруби смешивают с водопроводной водой в соотношении 1:0,7 и переносят в несколько колб по 10-20 г. в каждую. Колбы закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,15 МПа в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры в колбы вносят суспензию спор гриба, содержащую 150-200 тыс. спор в 1 мл. Для этого в пробирку с культурой гриба на сусло-агаре прибавляют 10 мл стерильной водопроводной воды и при помощи стерильной пипетки над огнем соскабливают конидии гриба. Полученную суспензию используют для посева (2-2,5% массы засеваемой среды или 0,4-0,5 мл на 10 г отрубей). Принципы подбора культур микроорганизмов для различных производств. Главным звеном биотехнологического процесса, определяющим всю его сущность, является биологический объект, способный осуществлять определенную модификацию исходного сырья и образовывать тот или иной необходимый продукт. В качестве таких объектов биотехнологии могут выступать клетки микроорганизмов, животных и растений, трансгенные животные и растения, а также многокомпонентные ферментные системы клеток и отдельные ферменты. Основой большинства современных биотехнологических производств до сих пор все еще является микробный синтез, т. е. синтез разнообразных биологически активных веществ с помощью микроорганизмов. К сожалению, объекты растительного и животного происхождения в силу ряда причин еще не нашли столь широкого применения. Независимо от природы объекта, первичным этапом разработки любого биотехнологического процесса является получение чистых культур организмов (если это микробы), клеток или тканей (если это более сложные организмы – растения или животные). Многие этапы дальнейших манипуляций с последними (т.е. с клетками растений или животных), по сути дела, являются принципами и методами, используемыми в микробиологических производствах. И культуры микробных клеток, и культуры тканей растений и животных с методической точки зрения практически не отличаются от культур микроорганизмов. Поэтому дальнейшие рассуждения целесообразно вести применительно к микробиологическим объектам. Мир микроорганизмов крайне разнообразен. В настоящее время относительно хорошо охарактеризовано (или известно) более 100 тысяч различных их видов. Это в первую очередь прокариоты (бактерии, актиномицеты, риккетсии, цианобактерии) и часть эукариот (дрожжи, нитчатые грибы, некоторые простейшие и водоросли). При столь большом разнообразии микроорганизмов весьма важной, а зачастую и сложной, проблемой является правильный выбор именно того организма, который способен обеспечить u1087 получение требуемого продукта, т. е. служить промышленным целям. Разделение микроорганизмов на промышленные и непромышленные для лиц, далеких от микробиологии, молекулярной биологии и молекулярной генетики, кажется достаточно определенным: те микроорганизмы, которые используются в промышленном производстве – промышленные, а те, которые не используются, – непромышленные. Однако для тех, кто близко соприкасается с вышеперечисленными отраслями биологических знаний, граница проходит между немногочисленной, но глубоко изученной группой микроорганизмов, служащих модельными объектами при исследованиях фундаментальных жизненных процессов, и всеми остальными микроорганизмами, которые, как правило, генетиками, молекулярными биологами и генными инженерами не изучались совсем или изучались в очень ограниченной степени. К числу первых относятся кишечная палочка (E. coli), сенная палочка (Bac. subtilis) и пекарские дрожжи (S. cerevisiae). Во многих биотехнологических процессах используется ограниченное число микроорганизмов, которые классифицируются как GRAS («generally recognized as safe» обычно считаются безопасными). К таким микроорганизмам относят бактерии Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, другие виды бацилл и лактобацилл, виды Streptomyces. Сюда также относят виды грибов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и дрожжей Saccharomyces и др. GRAS-микроорганизмы непатогенные, нетоксичные и в основном не образуют антибиотики, поэтому при разработке нового биотехнологического процесса следует ориентироваться на данные микроорганизмы, как базовые объекты биотехнологии. Микробиологическая промышленность сегодня использует тысячи штаммов из сотен видов микроорганизмов, которые первично были выделены из природных источников на основании их полезных свойств, а затем (в большинстве своем) улучшены с помощью различных методов. В связи с расширением производства и ассортимента выпускаемой продукции в микробиологическую промышленность вовлекаются все новые и новые представители мира микробов. Следует отдавать себе отчет, что в обозримом будущем ни один из них не будет изучен в той же степени, как E.coli и Bac.subtilis. И причина этого очень простая – колоссальная трудоемкость и высокая стоимость подобного рода исследований. Следовательно, возникает проблема разработки стратегии и тактики исследований, которые обусловили бы с разумной затратой труда извлечь из потенциала новых микроорганизмов все наиболее ценное при создании промышленно важных штаммов-продуцентов, пригодных к использованию в биотехнологических процессах. Существует и другой путь подбора микроорганизмов-продуцентов – это выбор нужного вида из имеющихся коллекций хорошо изученных и досконально охарактеризованных микроорганизмов. При этом, естественно, устраняется необходимость выполнения ряда трудоемких операций. Главным критерием при выборе биотехнологического объекта (в нашем случае микроорганизма-продуцента) является способность синтезировать целевой продукт. Однако помимо этого, в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые порой бывают очень и очень важными, чтобы не сказать решающими. В общих словах микроорганизмы должны: • обладать высокой скоростью роста; • утилизировать необходимые для их жизнедеятельности дешевые субстраты; • быть резистентными к посторонней микрофлоре, т. е. обладать высокой конкурентоспособностью. Все вышеперечисленное обеспечивает u1079 значительное снижение затрат на производство целевого продукта. Конечно, в каждом конкретном случае ведущим является какой-то один из этих критериев, поскольку в природе устроено так, что во всем получить выигрыш не удается никогда. И это правило необходимо постоянно иметь в виду. Ниже приводятся примеры, имеющие своей целью проиллюстрировать ранее сказанное. 1.Одноклеточные организмы, как правило, характеризуются более высокими скоростями роста и синтетических процессов, чем высшие организмы. Тем не менее это присуще не всем микроорганизмам. Существуют такие из них (например, олиготрофные), которые растут крайне медленно, однако они представляют известный интерес, поскольку способны продуцировать различные очень ценные вещества. 2. Особое внимание как объекты биотехнологических разработок представляют фотосинтезирующие микроорганизмы, использующие в своей жизнедеятельности энергию солнечного света. Часть из них (цианобактерии и фотосинтезирующие эукариоты) в качестве источника углерода утилизируют СО2, а некоторые представители цианобактерий, ко всему сказанному, обладают способностью усваивать атмосферный азот (т. е. являются крайне неприхотливыми к питательным веществам). Фотосинтезирующие микроорганизмы перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и ряда органических соединений. Однако пpoгpecca в их использовании вследствие ограниченности фундаментальных знаний об их генетической организации и молекулярно-биологических механизмах жизнедеятельности, по всей видимости, следует ожидать не в скором будущем. 3. Определенное внимание уделяется таким объектам биотехнологии, как термофильные микроорганизмы, растущие при 60–80° С. Это их свойство является практически непреодолимым препятствием для развития посторонней микрофлоры при относительно не стерильном культивировании, т. е. является надежной защитой от загрязнений. Среди термофилов обнаружены продуценты спиртов, аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Способы усиления активности промышленных штаммов. Способы увеличения продуктивности штаммов Мутагенез и отбор В прошлом для увеличения продуктивности штаммов обычно использовали мутагенез и отбор: именно таким путем удалось повысить выход антибиотиков, синтезируемых грибами и актиномицетами. Было последовательно отобрано свыше двадцати штаммов, продуцирующих все больше пенициллина, и, в конечном счете, продуктивность увеличилась в 55 раз. Как в этом случае, так и во многих других прямого отбора не происходило, поскольку не удавалось создать условия, при которых росли бы только искомые штаммы. Вместо этого пришлось применять метод скрининга: клетки, выжившие после воздействия больших доз мутагенов, размножали в колбах на качалках, после чего в фильтратах культуральной среды определяли количество антибиотика. Скрининг требует много времени и напряженного труда. Часто штаммы, для которых был получен большой выход при выращивании в колбах, оказывались непродуктивными в условиях роста в ферментере большого объема. Нередко успеху способствовало знание «секретов мастерства»: так, оказывается, что большая продуктивность обычно свойственна особым морфологическим вариантам. Скрининг с использованием чашек с агаром вместо колб на качалках позволяет обследовать гораздо больше мутантов. Образование антибиотиков или метаболитов нередко оценивается методом биопроб, когда в агар вводят индикаторные организмы. Разработаны устройства для автоматического скрининга чашек. В них используются механические приспособления для инокуляции и производится периодическое фотографирование и последующий компьютерный анализ изображений. Можно создать особые условия, при которых мутанты с нужными свойствами не растут. В этом случае применяется так называемый метод обогащения, когда активно растущие клетки дикого типа погибают, а нерастущие мутантные выживают. Так, например, пенициллин или нистатин вызывает гибель растущих клеток бактерий или грибов соответственно. При работе с грибами недостаток в среде инозитола приводит к автолизу растущих, но не покоящихся клеток. Наиболее подходящим способом является, конечно, прямой отбор, когда создаются условия для роста только мутантных клеток. Этот подход применялся для выделения штаммов - сверхпродуцентов некоторых метаболитов, например аминокислот или цитрата. Обработанную мутагеном культуру выращивают в присутствии ингибитора (например, аналога аминокислоты), в результате чего отбираются мутанты, преодолевающие нарушение обмена за счет образования избытка желаемого соединения. Отбор на чашках с агаром основан на том, что часть организмов отвечает на воздействие по принципу «все или ничего». Колонии мутантов растут, а диких клеток -- нет. Однако при получении промышленных штаммов, особенно предназначенных для использования в длительных процессах ферментации, нередко стремятся получить для конкретных условий относительно небольшие различия в скорости роста. В этом случае отбор происходит при непрерывном культивировании. В хемостатах при длительном выращивании культура все время находится в экспоненциальной фазе роста, и это позволяет выделять даже те мутанты, у которых сродство к субстрату, удельная скорость роста или устойчивость к токсическому действию высоких концентраций субстрата или продукта лишь немного превышает исходный уровень. Гибридизация путем скрещивания Наиболее простой путь создания организмов с желаемым комплексом генетически обусловленных признаков -- это скрещивание штаммов, принадлежащих к противоположным половым типам. Как про-, так и эукариотические микроорганизмы скрещиваются при контакте клеток, и этот процесс используется для получения рекомбинантов. Конъюгация у бактерий У бактерий половой процесс называют конъюгацией. Контакт между двумя клетками осуществляется за счет образования длинного конъюгационного мостика, который служит для переноса ДНК из одной клетки в другую. Способность к формированию мостика закодирована во многих плазмидах (см. далее); по нему они переносят свои гены, а в некоторых случаях и гены клетки-хозяина в клетку-реципиент. Плазмиды, осуществляющие перенос генов клетки-хозяина, обладают, таким образом, способностью к мобилизации хромосом. У Escherichia coli такие F-плазмиды выступают в роли фактора пола. Они способны мобилизовать хромосому не только Е. coli, но и родственных энтеробактерий (Shigella, Klebsiella, Salmonella, Erwinia) и поэтому могут использоваться для переноса генов между бактериями разных родов. Некоторые плазмиды, выделенные из Pseudomonas aeruginosa, еще более «неразборчивы». Так, плазмида R68.45 может переносить хромосомные гены между видами Pseudomonas, в том числе и Pseudomonas putida, но кроме этого, обладает способностью к мобилизации хромосом и таких родов, как Rhizobium, Rhodopseudomonas, Azospiril-lum, Agrobacterium и Escherichia. К числу наиболее широко используемых в промышленности микроорганизмов относятся разнообразные виды Streptomyces: с их помощью получают более 60% разновидностей применяющихся сегодня антибиотиков. У этих организмов хорошо развиты системы скрещивания, которые обнаружены и у их близких родственников, видов Nocardia. Методы хранения промышленных штаммов. Сохранение активности штамма Индуцированные путем генетических манипуляций свойства, как правило, являются нестабильными, и новый штамм подвергается реверсии, т.е. обратному мутированию. Ревертанты бывают более жизнеспособными и вытесняют из популяции высокопродуктивные клетки мутанта. Работа селекционера не заканчиваете получением нового, высокопродуктивного штамма; новые свойства необходимо закрепить. Необходимо накопить гены-модификаторы, которые постепенно «приспосабливают» новые свойства мутанта к общему метаболизму клетки. Для сохранения свойств также отбираются двойные мутанты, что уменьшает вероятное возникновения ревер-тантных форм продуцента. Индуцированные свойства легче сохранить у мутантов, которые при культивировании имеют селективные преимущества, например требующие особых условий для выделения продуцента. Иногда уже при селекции штамма удается индуцировать свойства, автоматически обеспечивающие преимущество перед ревертантами. В большинстве случаев в промышленных условиях не удается обеспечить селективные преимущества мутантам, их приходится регулярно клонировать и отбирать из популяции клеток активные клоны. Консервация продуцентов Кроме сохранения активности в промышленных и лабораторных условиях важно обеспечить жизнеспособность штамма при более или менее длительном его хранении. Наиболее распространенный способ поддержания жизнедеятельности культур — периодические пересевы продуцента на свежие питательные среды. Однако при многократных пересевах увеличивается возможность реверсии и потери активности продуцента, поэтому любой продуцент-мутант лучше хранить в консервированном виде. При этом микроорганизмы сохраняют жизнеспособность в течение 10—30 лет и дольше. С точки зрения количественного сохранения не имеет значения, сколько сохранилось клеток — 100% или 0,0001% — из совокупности, включающей, скажем, 109 клеток. Понижение температуры до 0—4 °С не препятствует делению клеток. Его можно остановить только путем замораживания или обезвоживания клеток. Большинство промышленных микроорганизмов можно сохранить в активной форме в холодильнике при 4—6 °С в течение 1—2 мес. При температуре ниже О °С жизнедеятельность клеток замедляется, поэтому микроорганизмы нередко хранят в замороженном состоянии. Выживаемость в этом случае зависит от скорости замораживания и последующего оттаивания, от состава суспензионной среды и температуры хранения. Массовая гибель микроорганизмов при замораживании наблюдается в диапазоне температур от — 15 до —35 °С. Выживаемость микроорганизмов максимальна, если их хранить при температуре ниже —130 °С (в качестве хладагента обычно используют жидкий азот температурой —196 °С). Обычно после 3—5-летнего хранения на холоде выживаемость микроорганизмов 40—70%, после 10—20-летнего хранения — 10—20%. Другим широко применяемым способом консервации является хранение культур под слоем минерального масла. Метод чрезвычайно прост: масло предохраняет субстрат от высыхания и ограничивает доступ атмосферного кислорода. Микроорганизмы, образующие споры, обладают большей устойчивостью при хранении под маслом, поэтому данный метод часто используют для консервации микромицетов. Обычно применяют вазелиновое масло высокой вязкости (плотность 0,8—0,9). Масло предварительно стерилизуют в автоклаве при 1,0—1,5 кгс/см2 или в электрическом сушильном шкафу при 150—170 °С в течение 1,5 ч. P?nicillium chrysogenum — продуцент пенициллина — сохраняет активность и жизнеспособность после 3—5-летнего хранения под маслом. Все применяемые способы искусственной консервации микроорганизмов являются попыткой в той или иной форме смоделировать самосохранение микроорганизмов в экстремальных условиях. Интерес микробиологов давно привлекают почва, а также торф, песок и другие природные субстраты, в которых в состоянии анабиоза микроорганизмы могут сохранять жизнеспособность сотни лет. К сожалению, почву чрезвычайно трудно простерилизовать, поэтому нередко применяют промытый и простерилизованный кварцевый песок. Высушенные микромицеты рода Fusarium в песке сохраняют жизнеспособность даже после 10—15-летнего хранения. Для сохранения спор микромицетов (например, Aspergillus niger — продуцента лимонной кислоты) используют активный уголь, смешивая его со спорами продуцента в соотношении (2—5) : 1 и подсушивая смесь до влажности 20—25%. При комнатной температуре споры могут храниться более 10 лет, их выживаемость 20-25%. Культуры грибов удобно хранить на естественно или принудительно высушенных питательных субстратах. Выращенные на картофельно-декстриновом агаре и высушенные при комнатной температуре представители родов Pinicillium, Mucor, Aspergillus, Fusarium и др. в холодильнике при температуре 6—7 °С сохраняют жизнеспособность 3 года и дольше. Широко применяют выращивание и хранение продуцентов пенициллина на пшене. После спорообразования выращенные на пшене микромицеты высушивают в вакууме и сохраняют при температуре 4—6 °С в течение 4—5 лет. Для консервации применяют также высушивание спор в вакууме или высушивание живых клеток (дрожжей) в конвективной сушилке. Выживаемость высушенных клеток зависит от скорости и режимов высушивания и от скорости регидратации клеток. Применяют также особые защитные вещества, например глутаминовую кислоту. Продуценты, способные образовывать споры, длительное время можно сохранять в виде спор, ибо спора — естественный анабионт, приспособленный для продолжительного пассивного существования. Так, для сохранения винных дрожжей их выращивают на агаре с дефицитом питательных веществ. В таких неблагоприятных для существования условиях большинство дрожжевые клеток (60—80%) формируют эндоспоры, которые в высушенном виде сохраняют жизнеспособность и специфические свойства в течение 2—4 лет. В настоящее время самый распространенный способ сохранения микробных культур — лиофилизация. Она заключается в том, что вода при пониженном атмосферном давлении испаряется из замороженного материала, превращаясь в пар, минуя жидкое состояние. Обычно микробные культуры лиофилизуют при температуре от —45 до —60 °С в течение 1—2 ч при остаточном атмосферном давлении 200—500 мм рт. столба. Большинство спор грибов и вегетативные клетки бактерий, высушенные при лиофильной сушке, сохраняют жизнеспособность в течение 15—50 лет. В целях увеличения выживаемости вегетативных клеток микробов перед лиофилизацией их, как правило, помещают в защитные среды (стерильную бычью сыворотку, лошадиную сыворотку, смесь 10%-ного раствора сахарозы и 1%-ного раствора желатина и др.). Защитные среды, очевидно, регулируют осмотическое давление клетки при высушивании. Для успешной лиофилизации необходимо учитывать следующие факторы: • лиофилизируемые культуры следует выращивать в оптимальных условиях; • культуру для лиофилизации берут в конце экспоненциальной фазы роста; • лучшим субстратом для приготовления суспензии клеток или спор перед лиофилизацией считаются сахарозо-желатиновая среда или обезжиренное молоко; • концентрацию суспензии для лиофилизации следует устанавливать индивидуально для каждой лиофилизируемой культуры; • остаточная влажность лиофилизата должна быть в пределах 2%. Такие культуры в лиофилизированном состоянии можно хранить при комнатной температуре. Если остаточная влажность лиофилизата превышает 2%, его следует хранить при температуре 2-4 °С. Методика реактивации (вывод из состояния анабиоза) существенно отражается на выживаемости клеток и должна быть разработана для каждой культуры отдельно. Часто при переходе от лабораторных условий к культивированию в промышленных масштабах происходит утрата свойств продуцентов. Для уменьшения этих потерь необходимо в биореакторе создать условия, максимально приближенные к условиям лаборатории. Применение антимутагенов (веществ, снижающих частоту спонтанных мутаций) препятствует накоплению ревертантов. При масштабировании сохранению свойств, полученных селекционером, способствуют использование двойных мутантов и создание условий, в которых продуцент получает преимущества. Методы генной инженерии позволяют вводить в клетки гены, определяющие антагонизм к клеткам, не содержащим эти гены. Так, можно использовать киллерные свойства дрожжей или колицино-генные свойства кишечной палочки. Включая эти гены в клетки продуцентов, можно уменьшить опасность роста в биореакторах посторонней микрофлоры. Важно так проводить селекцию продуцентов, чтобы они смогли размножаться при высоких концентрациях субстрата, при которых не способны расти ревертанты. Например, метанолутилизирующие бактерии, полученные путем плазмидного переноса генов, способны расти при концентрациях метанола, при которых подавляется развитие утративших плазмиду бактерий того же вида. Питательные среды для культивирования микроорганизмов. Микробиологическое исследование - это выделение чистых культур микроорганизмов, культивирование и изучение их свойств. Чистыми называют культуры, состоящие из микроорганизмов одного вида. Они нужны при диагностике инфекционных болезней, для определения видовой и типовой принадлежности микробов, в исследовательской работе, для получения продуктов жизнедеятельности микробов (токсинов, антибиотиков, вакцин и т. п.). Для культивирования микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты - питательные среды. На средах микроорганизмы осуществляют все жизненные процессы (питаются, дышат, размножаются и т. д.), поэтому их еще называют средами для культивирования. Питательные среды Питательные среды являются основой микробиологической работы, и их качество нередко определяет результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные (наилучшие) условия для жизнедеятельности микробов. Требования, предъявляемые к средам Среды должны соответствовать следующим требованиям: 1) быть питательными, т. е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы. Минеральные вещества не только входят в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства сред (осмотическое давление, рН и др.). При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста - витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать; Внимание! Микроорганизмы, как все живые существа, нуждаются в большом количестве воды. 2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов - рН, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2-7,4). Исключение составляют холерный вибрион - его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,5-9,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,2-6,8). Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т. е. содержать вещества, нейтрализующие продукты; обмена; 3) быть изотоничными для микробной клетки; т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида; 4) быть стерильными, так как посторонние микробы препятствуют росту изучаемого микроба, определению его свойств и изменяют свойства среды (состав, рН и др.); 5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию; 6) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом. Для одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других - низкий. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы - при RH2 не ниже 10. Окислительно-восстановительный потенциал большинства сред удовлетворяет требованиям к нему аэробов и факультативных анаэробов; 7) быть по возможности унифицированным, т. е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Так, среды для культивирования большинства патогенных бактерий должны содержать 0,8-1,2 г/л аминного азота NH2, т. е. суммарного азота аминогрупп аминокислот и низших полипептидов; 2,5-3,0 г/л общего азота N; 0,5% хлоридов в пересчете на натрия хлорид; 1% пептона. Желательно, чтобы среды были прозрачными - удобнее следить за ростом культур, легче заметить загрязнение среды посторонними микроорганизмами. Классификация сред Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме того, на выбор той или иной среды влияют цели исследования. В настоящее время предложено огромное количество сред* в основу классификации которых положены следующие признаки. 1. Исходные компоненты. По исходным компонентам различают натуральные и синтетические среды. Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения. В настоящее; время разработаны среды, в которых ценные пищевые продукты (мясо и др.) заменены непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Несмотря на то что состав питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и меняется в зависимости от исходного сырья, эти среды нашли широкое применение. Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворенных в дважды дистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен (известно, сколько и какие вещества в них входят), поэтому эти среды легко воспроизводимы. 2. Консистенция (степень плотности). Среды бывают жидкие, плотные и полужидкие. Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым для получения среды нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар или желатин. Агар-агар - полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Он не является для микроорганизмов питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В воде агар плавится при 80-100° С, застывает при 40-45° С. Желатин - белок животного происхождения. При 25-30° С желатиновые среды плавятся, поэтому культуры на них обычно выращивают при комнатной температуре. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшается, и они плохо застывают. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество - при их росте среда разжижается. Кроме того, в качестве плотных сред применяют свернутую сыворотку крови, свернутые яйца, картофель, среды с селикагелем. 3. Состав. Среды делят на простые и сложные. К первым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и агар Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду. Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма. 4. Назначение: а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства патогенных микробов. Это вышеупомянутые МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода; б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют сахар, для пневмо- и менингококков - сыворотку крови, для возбудителя коклюша - кровь; в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Так, соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН. Жидкие элективные среды называют средами накопления. Примером такой среды служит пептонная вода с рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие микроорганизмы не растут; г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать) один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды Гисса с углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется цвет среды; д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды - глицериновая смесь, используемая для сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных бактерий. Рецепты приготовления некоторых сред приведены в конце следующего раздела и во второй части учебника. Состав питательных сред. Питательные среды могут иметь неопределенный состав, то есть включать биогенные (растительные, животные, микробные) добавки - мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.д. Применяют также среды, приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях - синтетические среды. В состав практически любой питательной среды входят такие компоненты, как вода, соединения углерода, азота, фосфора и других минеральных веществ, витамины. Вода. Вода должна отвечать требованиям ГОСТ (чистая, бесцветная, без привкуса, запаха и осадка). Источники углерода. Легкодоступными считаются сахара: глюкоза, сахароза, лактоза, за ними следуют многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Далее следуют полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, которые могут быть источниками углерода либо после превращения их в усвояемые микроорганизмами моно- и низкомолекулярные олигосахариды, либо микроорганизмы должны иметь набор ферментов, гидролизующих эти вещества. Такими микроорганизмами являются плесневые грибы родов Aspergillus, Penicillium, бактерии рода Bacillus и другие. На практике встречается большое количество микроорганизмов, которые успешно утилизируют органические кислоты, особенно в анаэробных условиях. Низкомолекулярные спирты: метанол и этанол - относятся к числу перспективных видов сырья. Многие дрожжи родов Candida, Hansenula и др. способны ассимилировать этанол. Дрожжи родов Pichia, Candida и другие, бактерии рода Flavobacterium используют в качестве единственного источника углерода метанол. Некоторые виды микроорганизмов (незначительная часть) используют в качестве источника углерода и энергии углеводороды: н-алканы и некоторые фракции нефти. Источники азота. Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот. Большинство дрожжей хорошо усваивает аммиачные соли, а также аммиак из водного раствора, потребность в нитратах испытывают только некоторые виды дрожжей. Источником азота могут служить и органические соединения: аминокислоты, мочевина и т.д., которые легко усваиваются микроорганизмами. Известно, что бактерии более требовательны к источникам азота, чем другие микроорганизмы (грибы, актиномицеты и дрожжи). Источники фосфора.Фосфор является важнейшим компонентом клетки. Он входит в состав АТФ (аденозинтрифосфата), АДФ, АМФ и тем самым обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также синтез белков, нуклеиновых кислот и другие процессы биосинтеза. Фосфор вносят в среду в виде солей фосфорной кислоты. Источники витаминов и микроэлементов. Потребность микроорганизмов в этих соединениях различна, тем не менее, практически все микроорганизмы лучше растут в присутствии витаминов. Эффективной добавкой к питательным средам оказался кукурузный экстракт благодаря наличию в нем витаминов, аминокислот и минеральных элементов в легко ассимилируемых формах. В рецептуры сред включают также дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, сок картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков и другие продукты. Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие на микробные клетки. При составлении питательной среды для конкретного вида микроорганизма подбираются наиболее подходящие источники углерода, азота, фосфора и других веществ. Методы культивирования микроорганизмов. Поверхностный, глубинный, периодический, непрерывный. Культивирование микроорганизмов можно проводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным способами, в аэробных или анаэробных условиях. Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного для культивирования микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивирования: накопление биомассы или получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.). При культивировании поверхностным способом микроорганизмы выращивают на поверхности плотной, сыпучей среды или в тонком слое жидкой среды, при этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. На сыпучих средах поверхностным методом получают ферментные препараты. Поверхностное культивирование микроорганизмов применяют как в лабораторных условиях, так и в промышленности. Все способы культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. При глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать (подводить кислород в глубь жидкой среды). Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Наиболее широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования — выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или пробирок, в результате чего увеличиваются соприкосновение среды с воздухом и насыщение ее кислородом. Аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием (барботированием) через толщу среды стерильного воздуха. Этот способ используют в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, кислот. Преимущества глубинного культивирования заключаются в том, что при этом не требуются большие площади и громоздкое оборудование, объем ферментеров можно увеличить за счет увеличения высоты. Немаловажны также простота обслуживания, возможность автоматизации, удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости. Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным. При периодическом методе культивирования весь объем питательной среды засевают чистой культурой и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Поскольку культивирование происходит на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), клетки все время находятся в меняющихся условиях. Сначала все питательные вещества в среде присутствуют в избытке, затем постепенно их количество уменьшается, а количество вредных продуктов обмена микроорганизмов увеличивается. В связи с этим культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения, в течение которых изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства. Закономерность роста чистой культуры микроорганизма: 1 — лаг-фаза; 2 — логарифмическая фаза; 3 — стационарная фаза; 4 — фаза отмирания Первая стадия — лаг-фаза, или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду. В этой фазе микроорганизмы не размножаются, а приспосабливаются к среде, в них повышается содержание нуклеиновых кислот, увеличивается размер клеток. Эта стадия является подготовкой к дальнейшему интенсивному синтезу белка клеткой, т.е. ее росту и размножению. Вторая стадия — фаза логарифмического роста (экспоненциальная), характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена. Время, необходимое для удвоения числа клеток, называется продолжительностью генерации. В благоприятных условиях клетки бактерий делятся каждые 20—30 мин, их число увеличивается в геометрической прогрессии (1, 2, 4, 8, 16 и т.д.). Третья стадия — стационарная (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется, и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным. Четвертая стадия — фаза отмирания, когда клетки начинают погибать и их число снижается за счет отмирания и автолиза (само- переваривания). Периодическое культивирование осуществляют во многих производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Недостатком периодического культивирования являются нерациональные затраты времени на прохождение всех четырех стадий развития культуры, причем период самой активной жизнедеятельности — фаза логарифмического роста — занимает лишь небольшую часть производственного цикла. Метод непрерывного культивирования имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим способом (не прерывается производственный цикл, сохраняется микробиологическая чистота получаемой культуры). В последние годы активно разрабатывают и применяют метод непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном (прикрепленном) состоянии — на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность. Непрерывное культивирование очень перспективно и широко используется в пищевой и микробиологической промышленности. Оно позволяет автоматически поддерживать заданные оптимальные условия, благодаря чему удается получать стандартный готовый продукт при наименьших затратах. Условия непрерывного культивирования. Более перспективно непрерывное культивирование. Его сущность заключается в том, что в ферментаторе поддерживаются постоянные условия среды, в результате чего микроорганизмы остаются в определенном физиологическом состоянии. Подается свежая питательная среда и удаляется избыток среды с продуктами метаболизма, поддерживается фаза экспоненциального роста. Если для культивирования продуцента используется один ферментатор, то говорят о гомогенно-непрерывном процессе. Если же используется батарея, то это гетеро-непрерывный процесс, так как в каждом ферментаторе, соединенном в батарею, поддерживаются постоянные условия. При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутствует смена фаз развития культуры. В таких процессах скорость потока питательной среды и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время. Поддержание динамики равновесия в реакторе осуществляется двумя методами: турбидостатным и хемостатным. По турбидостатному принципу концентрация биомассы поддерживается скоростью потока среды, а по хемостатному – концентрацией подаваемого субстрата. Известен также способ регулирования роста культуры по рН. Классификация систем непрерывного культивирования. По технологическому оформлению различают следующие микробиологические процессы: 1) аэробное и анаэробное культивирование; 2) асептическое и нестерильное; 3) гидродинамические условия в ферментере близкие к идеальному перемешиванию, идеальному вытеснению или промежуточное состояние; 4) поверхностное (на поверхности твердых или жидких питательных сред (агаризованые среды, твердые субстраты: пшено, ячмень, пшеничные отруби)) и глубинное (выращивание микроорганизмов во всем объеме питательной среды) культивирование; 5)периодическое и непрерывное культивирование. При периодическом способе в ферментатор загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание производят в оптимальных условиях в течение определенного времени. В этих условиях микроорганизмы растут и размножаются, проходя определенный цикл развития, выражаемый в смене фаз. I фаза – лаг-фаза или фаза приспособления. Она начинается от момента внесения инокулята в питательную среду до начала размножения микроорганизмов. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма, состава посевной и питательной сред и условий культивирования. В клетке происходит ряд биохимических изменений. II фаза – фаза ускорения роста или переходная фаза характеризуется началом деления клеток, вследствие чего начинает увеличиваться численность популяции и скорость роста культуры. III фаза – экспоненциальная или логарифмическая фаза – фаза наиболее активного роста числа клеток, в которой устанавливается максимальная скорость роста. IV фаза – фаза замедленного роста или уменьшения скорости роста. Скорость роста снижается вследствие понижения концентрации питательных веществ, накопления продуктов обмена, пространственной ограниченности. V фаза – стационарная – прирост биомассы прекращается, в культурах накапливается максимальное количество биомассы или максимальное число клеток (эти максимальные величины принято называть выход или урожай). IV фаза – фаза отмирания или гибели. Она начинается с того момента, когда число отмерших клеток становится больше числа вновь образованных. При периодических процессах не используется в полной мере способность микроорганизмов к размножению. Период самой активной жизнедеятельности – логарифмическая фаза – занимает лишь небольшую часть производственного цикла. При этом способе все клетки находятся в непрерывно меняющихся условиях (сначала избыток источников питания, далее накопление продукта и продуктов жизнедеятельности, ингибирующих рост клеток). Избежать ингибирования можно постепенным введением питательных веществ в течение всего процесса. Такой метод называют культивированием с дробным введением субстрата. При этом происходит изменение объема питательной среды. Еще одним методом осуществления периодического культивирования с дробным дозированием субстрата через диализирующую мембрану, позволяющую проникать только определенным веществам за счет чего поддерживается их постоянная концентрация в среде. Чтобы сохранить объем постоянным и снизить концентрацию продуктов жизнедеятельности в среде, часть культуральной жидкости можно удалять через определенные промежутки времени. Такой способ культивирования называется «отъемно-доливным». В данном случае основные параметры процесса – объем, скорость разбавления, удельная скорость роста – не являются постоянными, и культура находится к квазистационарном (мнимостационарном) состоянии. Непрерывное культивирование заключается в непрерывной подаче веществ в ферментер в таком количественном и качественном соотношении, которое необходимо для поддержания микроорганизмов в в экспоненциальной фазе развития. Одновременно часть культуральной среды со взвешенными клетками с той же скоростью выводится из ферментатора. В современной литературе описаны сотни биореакторов, отличающихся по конструкции, принципу работы и размерам (от нескольких литров до нескольких тысяч кубометров). Рассмотрим некоторые типы ферментационных аппаратов. Аппараты для поверхностной и анаэробной ферментации менее сложны и энергоемки. Аппараты для анаэробных процессов применяются в процессах конверсии растительного сырья, в том числе растительных, а также различных других отходов. При метановом брожении для получения биогаза, а также в ряде других процессов (получения ацетона, шампанских вин) используют ферментационные аппараты (метантенки). Эти аппараты имеют различную конструкцию (от простой выгребной ямы до сложных металлических или железобетонных сооружений) и объемы (от нескольких до сотен кубометров). Данные аппараты оборудованы системой подачи сырья, системой теплообменных труб для стабилизации температуры, несложным перемешивающим устройством для гомогенного распределения сырья и биомассы продуцента, газовым колпаком и устройством переменного объема (газгольдером) для сбора образуемого биогаза. Аппараты для аэробной поверхностной ферментации широко применяются для производства органических кислот (жидкофазные) и ферментов (твердофазные). Поверхностная жидкофазная ферментация протекает в так называемых бродильных вентилируемых камерах, в которых на стеллажах размещены плоские металлические кюветы. В кюветы наливают жидкую питательную среду, высота слоя составляет 80-150 мм, затем с потоком подаваемого воздуха среду инокулируют продуцент. В камере стабилизируется влажность, температура и скорость подачи воздуха. После завершения процесса культуральная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днища штуцеры и поступает на обработку. При твердофазной ферментации процесс также протекает в вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах размещают лотки, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10-15 мм. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через перфорированное днище лотков. Количественные характеристики роста и продуктивности. Двухфазный рост. У бактерий, способных использовать два различных источника углерода, наблюдают двухфазный рост (так называемая диауксия). Примером может служить рост кишечной палочки на среде с глюкозой и сорбитолом. • Для подобных микроорганизмов характерен начальный пик роста, в течение которого бактерии утилизируют только один углевод. • После исчерпания его запасов наступает стационарная фаза, в течение которой в культуре инициируются синтез ферментов и механизмы транспорта для утилизации второго углевода. • Если физиологические условия удовлетворительны, в бактериальной культуре начинается фаза вторичного экспоненциального роста, инициированная утилизацией второго углевода. Для выращивания любой культуры необходимы: 1) жизнеспособный посевной материал; 2) источники энергии и углерода; 3) питательные вещества для синтеза биомассы; 4) отсутствие ингибиторов роста; 5) соответствующие физико-химические условия (температура, рН среды, наличие или отсутствие кислорода и др.). В благоприятных условиях в клетках микроорганизмов начинаются ферментативные процессы, обмен веществ с окружающей средой. Из веществ, проникших в клетку, образуются внутриклеточные вещества и структурные элементы. Одновременно идут процессы распада веществ – диссимиляции. Если анаболические процессы преобладают над катаболическими, наблюдается рост клетки, увеличение ее размеров. Достигнув определенных размеров в соответствующей фазе развития, клетка может начать размножаться. В результате роста и размножения в питательной среде увеличивается количество клеток. Из-за малых размеров микроорганизмов оценка роста происходит не для индивидуального организма, а для популяции. Оценка роста бактерий. Количественную оценку. роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма. Подсчёт микроорганизмов можно проводить непосредственно под микроскопом с использованием различных счётных камер (например, Петрова-Хаузера или Горяева). Если толщина слоя среды с микроорганизмами 0,02 мм, а сторона квадрата на предметном стекле 0,05 мм, то количество подсчитанных в квадрате клеток нужно умножить на 2*107, чтобы получить число клеток в 1 мл. Количество живых клеток определяют, подсчитывая выросшие на твёрдой питательной среде бактериальные колонии. При этом учитывают разбавление бактериальной суспензии, сделанное при посеве. Прирост биомассы бактерий оценивают после осаждения центрифугированием известного объёма питательной среды с последующим определением массы осадка (так называемый «сырой вес»). Сухой вес определяют, измеряя массу осадка, высушенного при 100 С  Фотометрические методы измерения мутности бактериальной суспензии основаны на её способности поглощать либо рассеивать свет пропорционально количеству бактерий; эти методы широко применяются на практике. Важно помнить, что линейная зависимость между мутностью суспензии и бактериальной массой наблюдается только при низких плотностях клеточных суспензий. Чтобы правильно измерить количество микроорганизмов в культуре с высокой плотностью, нужно сделать соответствующее разведение образца. Скорость роста. Основной стадией любого микробиологического производства является производственное культивирование соответствующего микроорганизма, проводимое либо с целью увеличения микробной массы - биомассы, либо для получения продуктов метаболизма растущей популяции микроорганизмов. Под биомассой понимают общую массу особей одного вида, группы видов или сообщества микроорганизмов в целом. Ее выражают в массе сырого или сухого вещества (г/м2, г/м3). Отсюда ясно, что задача инженера-технолога - создание условий, обеспечивающих максимальную утилизацию компонентов питательной среды и накопление целевого продукта с заданными свойствами. Естественно, теоретической основой для этого являются закономерности, определяющие рост популяции микроорганизмов в зависимости от условий его осуществления. Знание количественных закономерностей роста популяций микроорганизмов в реальных условиях его осуществления в емкостной аппаратуре, выраженных в виде соответствующей математической модели, во многом определяет переход от эмпирического поиска к строгому решению задачи оптимизации технологических режимов получения продуктов микробиологического синтеза. Экономический коэффициент или выход биомассы. Экономический коэффициент по биомассе YXS – его определяют, сравнивая количество выросшей за весь цикл ферментации биомассы Хк к количеству загруженного субстрата S0: Вернемся к коэффициенту YXS. Понятно, что он определен не совсем точно. В начале процесса уже существует некоторое количество биомассы, определяемое ее концентрацией X0, так что прирост ее за время ферментации меньше, чем Хк, и равен (Хк – X0). В то же время не весь субстрат до конца расходуется за время процесса; какая-то часть его, определяемая конечной концентрацией Sк, останется, так что потребление субстрата будет не S0, a (S0 – Sк). Таким образом, сам биологический процесс более правильно характеризовать коэффициентом, найденным по формуле: С точки зрения производственника лучше первое определение, так как остаточный субстрат – это в любом случае невосполнимые его потери, а выращенный до ферментации посевной материал – это достижение. Экономический коэффициент по продукту метаболизма YPS: Метаболические, или трофические, коэффициенты: Любой вид экономического или трофического коэффициента можно вычислять не только по начальным и конечным значениям параметров, т.е. за весь период ферментации, но и за любой произвольно взятый промежуток времени ∆t, используя для его вычисления соответственно этому промежутку определенные значения ∆Х, ∆S и ∆Р. К определению экономического коэффициента за произвольный промежуток времени ∆t = t1 – t2 Тогда получим значения коэффициентов YXS и YРS за данный промежуток времени. В пределе можно рассматривать промежуток ∆t сколь угодно малым – вплоть до бесконечно малого dt, и ему будут соответствовать сколь угодно малые приросты dX, dP и dS. Мгновенные текущие коэффициенты (относительные стехиометрические коэффициенты): Относительные коэффициенты образования продуктов в соответствии с приростом биомассы: Метаболический коэффициент. В любом биотехнологическом процессе ключевую роль играет биологический агент, его природа и физиолого-технологические свойства. Для любого биообъекта нужен исходный жизнеспособный посевной материал, источники энергии и углерода, питательные вещества для синтеза биомассы, отсутствие действия ингибиторов роста, соответствующие физико-химические условия ферментации (рН, температура, аэрация и др.). Одним из основных показателей, характеризующих адекватность условий ферментации, служит скорость роста продуцента. Скорость роста (увеличения биомассы) организмов с бинарным делением в хорошо перемешиваемой среде в периодической культуре будет пропорциональна концентрации микробной биомассы: dX/dt = mX где dX/dt - скорость роста, X - концентрация биомассы, m - коэффициент пропорциональности («удельная скорость роста»); параметр аналогичен сложным процентам (например, если удельная скорость роста равна 0.1 ч-1, значит, увеличение биомассы равно 10 % в час). Если величина m постоянна, как это бывает в установившемся режиме культивирования, то интегрирование представленного уравнения имеет вид 1пХ = 1пХо +m t, где X0 — биомасса в начальный период времени t. График зависимости 1пХ0 от времени будет иметь вид прямой линии с наклоном m. Удельная скорость роста является одним из основных параметров, характеризующих физиологическое состояние продуцента; ряд других параметров может быть выражен через этот показатель. Продуктивность процесса характеризуется количеством продукта, получаемого на единицу объема биореактора в единицу времени. Продуктивность процесса зависит от многих факторов: активности продуцента, значений коэффициента выхода продукта из потребительного субстрата, количества активной биомассы в ферментаторе: П=qsYp/sX[г/л-час], где qs - скорость потребления субстрата (метаболический коэффициент), YP/S - выход продукта (экономический коэффициент), X - концентрация биомассы, Р - продукт, S - субстрат. Влиять на величину продуктивности можно в результате изменения различных ее составляющих, но в каждом конкретном случае это приходится рассматривать отдельно. Так, при повышении величины X могут возникнуть ограничения по массообменным характеристикам и лимитирующие состояния; влиять на величину метаболического коэффициента культуры возможно только при условии глубокого значения взаимосвязей между физиолого-биохимическими характеристиками продуцента и условиями среды. Выход продукта (Y) (экономический коэффициент ) определяется как количество продукта, получаемого из данного количества субстрата: Y = X/(S0-S) где S и S0 — конечная и исходная концентрация субстрата. Данный коэффициент выражает эффективность использования субстрата для получения целевого продукта и является очень важной характеристикой, так как непосредственно связан с продуктивностью и позволяет влиять на себестоимость конечного продукта. Экономический коэффициент имеет четкий физический смысл, характеризующий степень перехода энергии, заключенной в субстрате, в продукт. Данная величина для расчетов и прогнозирования процесса в целом используется в качестве параметра для контроля и управления ходом различных процессов и сопоставления их эффективности. Конечная концентрация продукта должна планироваться с учетом продолжительности процесса и величины выхода продукта. Достижение конечной высокой концентрации продукта оправдано, когда трудоемки и дорогостоящи этапы постферментационной стадии (выделение, концентрирование). Удельные энергозатраты существенно варьируют в зависимости от направленности и схемы процесса ферментации, а также условий подготовки сырья на предферментационной стадии и от постферментационных процедур. Удельные энергозатраты очень существенно также зависят от типа ферментационного оборудования. Непродуктивные затраты субстрата (h) - затраты энергии субстрата, которые не проявляются в приросте продукта. В общем виде они выражаются через экономический коэффициент: Непродуктивные затраты существенно влияют на эффективность и экономику биотехнологического процесса, поэтому выявление причин и мест дополнительных трат энергетического субстрата очень важно. Непродуктивные затраты субстрата могут быть связаны с ошибками при считывании генетической информации в ходе быстрого роста продуцента и из-за возрастания трат энергии на поддержание жизни без размножения (транспорт субстратов и мономеров в клетке, защитные реакции, процессы репарации). Первичная оценка эффективности биотехнологических процессов по перечисленным параметрам проводится на стадии лабораторных разработок и испытаний процесса и далее уточняется при масштабировании на опытных и опытно-промышленных стадиях. Затраты на поддержание жизни без размножения. В любом биотехнологическом процессе ключевую роль играет биологический агент, его природа и физиолого-технологические свойства. Для любого биообъекта нужен исходный жизнеспособный посевной материал, источники энергии и углерода, питательные вещества для синтеза биомассы, отсутствие действия ингибиторов роста, соответствующие физико-химические условия ферментации (рН, температура, аэрация и др.). Одним из основных показателей, характеризующих адекватность условий ферментации, служит скорость роста продуцента. Скорость роста (увеличения биомассы) организмов с бинарным делением в хорошо перемешиваемой среде в периодической культуре будет пропорциональна концентрации микробной биомассы: dX/dt = m X где dX/dt - скорость роста, X - концентрация биомассы, m - коэффициент пропорциональности («удельная скорость роста»); параметр аналогичен сложным процентам (например, если удельная скорость роста равна 0.1 ч-1, значит, увеличение биомассы равно 10 % в час). Если величина m по­стоянна, как это бывает в установившемся режиме культивирования, то интегрирование представленного уравнения имеет вид 1пХ = 1пХо +m t, где X0 — биомасса в начальный период времени t. График зависимости 1пХ0 от времени будет иметь вид прямой ли­нии с наклоном m • Удельная скорость роста является одним из основных параметров, характеризующих физиологическое состояние продуцента; ряд других параметров может быть выражен через этот показатель. Продуктивность процесса характеризуется количеством продукта, получаемого на единицу объема биореактора в единицу времени. Продуктивность процесса зависит от многих факторов: активности продуцента, значений коэффициента выхода продукта из потребительного суб­страта, количества активной биомассы в ферментаторе : Влиять на величину продуктивности можно в результате изменения различных ее составляющих, но в каждом конкретном случае это приходится рассматривать отдельно. Так, при повышении величины X могут возникнуть ограничения по массообменным характеристикам и лимитирующие состояния; влиять на величину метаболического коэффициента культуры возможно только при условии глубокого значения взаимосвязей между физиолого-биохимическими характеристиками продуцента и условиями среды. Конечная концентрация продукта должна планироваться с учетом продолжительности процесса и величины выхода продукта. Достижение конечной высокой концентрации продукта оправдано, когда трудоемки и дорогостоящи этапы постферментационной стадии (выделение, концентрирование). Удельные энергозатраты существенно варьируют в зависимости от направленности и схемы процесса ферментации, а также условий подготовки сырья на предферментационной стадии и от постферментационных процедур. Удельные энергозатраты очень существенно также зависят от типа ферментационного оборудования. Непродуктивные затраты субстрата (h) - затраты энергии субстрата, которые не проявляются в приросте продукта. В общем виде они выражаются через экономический коэффициент. Непродуктивные затраты существенно влияют на эффективность и экономику биотехнологического процесса, поэтому выявление причин и мест дополнительных трат энергетического субстрата очень важно. Непродуктивные затраты субстрата могут быть связаны с ошибками при считывании генетической информации в ходе быстрого роста продуцента и из-за возрастания трат энергии на поддержание жизни без размножения (транспорт субстратов и мономеров в клетке, защитные реакции, процессы репарации). Первичная оценка эффективности биотехнологических процессов по перечисленным параметрам проводится на стадии лабораторных раз­работок и испытаний процесса и далее уточняется при масштабирова­нии на опытных и опытно-промышленных стадиях. Субстратная константа или константа насыщения. Одним из характерных проявлений жизни является удивительная способность живых организмов кинетически регулировать химические реакции, подавляя стремление к достижению термодинамического равновесия. Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента. Субстратная константа (KS) зависит от природы субстрата и фермента и отражает степень их сродства. Чем ниже значение KS, тем выше сродство фермента к субстрату тти, следовательно, скорость ферментативной реакции. Величина, обратная константе равновесия, называется субстратной константой Ks, или константой диссоциации фермент-субстратного комплекса: Из уравнения ясно, что субстратная константа уменьшается при высокой концентрации фермент-субстратного комплекса, т.е. при большой его устойчивости. Явление насыщения фермента субстратом изучали Леонор Михаэлис и Мод Мептен. На основе математической обработки результатов ими было выведено уравнение, получившее их имена, из которого ясно, что при высокой концентрации субстрата и низком значении субстратной константы скорость ферментативной реакции стремится к максимальной. Регуляция с помощью рост-лимитирующих и рост-ингибирующих факторов среды. В развитии микроорганизмов в несменяемой питательной среде наблюдается несколько фаз. Графическое отражение роста микроорганизмов носит название кривой роста, это необходимо, синтезируются новые ферментные системы. В период лаг-фазы стремительно возрастает количество нуклеиновых кислот, особенно РНК, что необходимо для биосинтеза белков. После лаг-фазы следует логарифмическая, или экспоненциальная, фаза II, в которой клетки размножаются с максимальной для данной культуры скоростью. Вследствие этого запас необходимых питательных веществ в среде уменьшается, кроме того, происходит накопление различных продуктов обмена веществ, которые в определенной концентрации могут мешать нормальному протеканию биохимических процессов обмена веществ. Иногда в питательной среде накапливается так много клеток, что не хватает пространства, (поверхности для новых поколений клеток). Именно через поверхность происходят процессы обмена – попадание питательных веществ в клетку и выведение метаболитов. Если клетка находится в тесном окружении других клеток, то площадь поверхности уменьшается и вместе с тем снижается интенсивность процессов обмена. Скорость роста культуры также уменьшается, если сокращается поверхность клеток на единицу объема. Это происходит при увеличении размеров клеток и, таким образом, особенно для клеток сферической формы, значительно ухудшаются условия питания. В ходе интенсивного роста и размножения внутри закрытой системы негативное влияние лимитирующих факторов увеличивается и в результате скорость роста уменьшается, наступает фаза замедленного роста III. Через определенное время в стационарной фазе IV масса клеток в питательной среде достигает максимального уровня, процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Затем наступает период, когда число отмерших и автолизированных клеток превышает прирост. В результате количество биомассы уменьшается – наступает фаза отмирания V. Следовательно, наиболее интенсивно рост и размножение происходят в логарифмической фазе, где еще не действуют лимитирующие факторы. Для характеристики физиологического развития культуры микроорганизмов и используют следующие параметры: - концентрация клеток (клеток/мл); - время генерации – промежуток времени, за который число клеток удваивается; - константа скорости деления – число удвоений в час; - скорость роста культуры – изменение количества биомассы в единицу времени; - константа скорости роста. Количество биомассы можно характеризовать по сухой массе клеток на единицу объема (мг/л, г/л кг/м), в том случае если клетки имеют примерно одинаковые размеры – по числу клеток в единице объема (млн./мл, млрд./мл). Количественная оценка роста микроорганизмов требует определения числа клеток в конкретный момент. Все эти методы подразделяют на прямые и косвенные. Прямые методы предполагают непосредственный подсчет клеток под микроскопом – в счетных камерах или на фиксированных мазках. К косвенным методам относятся: - метод предельного разбавления. При этом методе культуру постепенно разбавляют и определяют, при каком разбавлении не наблюдается ее роста; - посев на твердые питательные среды; - центрифугирование или фильтрция культуральной жидкость через мембранный фильтр и дальнейшее высушивание полученной биомассы до постоянной массы; - нефелометрия, измерение поглощения света клеточной суспензии, что пропорционально числу и размерам клеток; - определение содержания азота в биомассе, полученной из определенного объема питательной среды; - определение по интенсивности выделения какого-либо вещества (газа, кислоты и др.). Константа ингибирования. Вещества, присутствие которых в системе понижает активность фермента, т. е. уменьшает скорость реакции, называются ингибиторами. Если для ферментативного катализа необходимы предварительная адсорбция субстрата и его строгая ориентация относительно активных групп каталитического центра, то для ингибирования достаточно не только взаимодействия со всем адсорбционным участком, но и простого связывания ингибитора с отдельными участками адсорбционного центра. Соединения проявляют свойства ингибиторов либо благодаря возможности образовывать с каталитическим центром прочные комплексы (сероводород, цианиды), либо из-за воздействия на карбонильную группу фермента, либо благодаря своей способности денатурировать белки (например, соли серебра, меди, ртути). Эффект ингибирования может иметь место по разным причинам. Среди возможных типов обратимого ингибирования остановимся на трех. 1. Ингибитор / конкурирует с субстратом за активный центр, так как по строению близок к нему и является псевдосубстратом, образуя с ферментом неактивный комплекс (EI). Если при увеличении концентраций субстрата в растворе активность фермента восстанавливается, такое ингибирование называется конкурентным. 2. Ингибитор не конкурирует с субстратом за активный центр, так как присоединяется к другой части молекулы белка с образованием неактивных комплексов (EI и ESI), что приводит к снижению активности фермента, но не изменяет его сродство к субстрату. Если достигается обратимость ингибирования, т. е. восстановление активности фермента под действием отличных от субстрата веществ, такое ингибирование называется неконкурентным. 3. Если при ингибировании по типу 2 образуется только один неактивный комплекс ESI (фермент — субстрат — ингибитор), имеет место бесконкурентное ингибирование. Реакция конкурентного ингибирования протекает по следующему механизму: Величина, определяемая как называется константой ингибирования (АГ;) или константой диссоциации комплекса EI. Скорость реакции определяется скоростью образования конечного продукта: В присутствии ингибитора уравнение материального баланса для фермента примет вид Полученное выражение подставляем в уравнение, которое решаем относительно Теперь можно получить выражение для начальной скорости реакции, ускоряемой ферментом в присутствии конкурентного ингибитора: Сравнение уравнений Михаэлиса — Ментен, записанных для реакции с ингибированием и без него, показывает, что начальная скорость реакции в присутствии ингибитора всегда меньше скорости реакции в его отсутствие. Предельные значения скорости в обоих случаях для больших концентраций субстрата одинаковы и равны Из выражения для эффективной константы Михаэлиса можно получить соотношение для вычисления константы ингибирования: Управляемое культивирование микроорганизмов. Промышленное использование микроорганизмов требует получения значительного количества микробного продукта (биомассы микроорганизмов, продуцируемых ими антибиотиков, токсинов и др.). Для этого используют методы управляемого культивирования микроорганизмов. Управляемое культивирование проводят в специальном оборудовании -биореакторах, которые позволяют создавать благоприятные и равномерные условия для роста и размножения микроорганизмов, что повышает накопление их биомассы и метаболитов, сокращает время культивирования. Управляемое культивирование может быть периодическим или непрерывным, аэробным или анаэробным, поверхностным или глубинным (во всей толще жидкой питательной среды), защищенным (асептическим) или незащищенным. Периодическое культивирование микроорганизмов – выращивание микроорганизмов в стационарных условиях (в питательной среде без непрерывного поступления нутриентов извне). В таких условиях по мере роста микроорганизмов происходит снижение количества белковых и углеводных субстратов, снижение окислительно-восстановительного потенциала и рН, что приводит к гибели культуры. Для периодического культивирования используют специальное оборудование -ферментеры, в которых осуществляют постоянное перемешивание и аэрацию (барботаж) среды. Периодически ферментер опорожняют, производят выделение и очистку продукта, после чего начинают новый цикл. Существует несколько вариантов периодического культивирования: • продлённое периодическое культивирование, или культивирование сдробным дозированием субстрата - подпитывают культуру периодически добавляя питательные вещества; • многоциклическое культивирование - часть культуры предыдущего цикла переносят в новую среду; • отъемно-доливное культивирование - в середине экспоненциальной фазы роста отбирают половину культуральной жидкости, а вместо неё вносят свежую питательную среду. Непрерывное культивирование микроорганизмов - выращивание микроорганизмов в динамических условиях (в постоянно обно вляемой питательной среде). Проводят в специальных биореакторах - хемостатах или турбистатах, которые снабжены устройствами для поддержания температуры и рН на постоянном уровне, а также для автоматической подачи свежей питательной среды и удаления культуральной жидкости с продуктами метаболизма. Микробная популяция тем самым поддерживается необходимое время в ло­гарифмической фазе роста. Управление скоростью поступления питательных веществ в проточных биореакторах осуществляется двумя способами турбидостатными хемостатным. В турбидистате управление культивированием проводят путем измерения мутности выходящего потока с использованием фотоэлектрического элемента. Скорость разбавления свежей средой устанавливают в зависимости от требуемой плотности выходящей из турбидистата культуры. В хемостатах управление культивированием проводят путем лимитирования концентрации одного из ростовых факторов в поступающей в хемостат среде (например, концентрацию глюкозы, фосфора, серы), тем самым изменяют плотность микробных клеток в единице объёма среды. Регуляция метаболизма. Метаболизм микроорганизмов прежде всего регулируется факторами внешней среды. Так, кислород подавляет брожение; у денитрифицирующих бактерий нитратное дыхание может начаться лишь при недостатке кислорода; изменение рН в культурах Enterobacter и Clostridium влияет на природу образующихся продуктов брожения и прочее. Многообразие обменных процессов требует их хорошей координации. Только в этом случае клетка может приспосабливаться к меняющимся условиям внешней среды и оптимально согласовывать между собой различные метаболические процессы. Объектами такой оптимизации выступают ферменты. Регуляция клеточного метаболизма происходит на двух уровнях — на уровне синтеза ферментов и на уровне изменения их активности. На обоих уровнях участвуют аллостерические белки, свойства которых изменяются при связывании со специфическими малыми молекулами-эффекторами, например АТФ, АМФ, ацетил-КоА, фосфоэнолпируватом, НАДН+ и др. • Существует два класса аллостерических белков: аллостерические ферменты и регуляторные аллостерические белки. Последние лишены каталитической активности и регулируют синтез определённых ферментов путём присоединения к бактериальной хромосоме вблизи соответствующих генов, активность которых находится под контролем этих белков. Связывание регуляторных аллостерических белков с молекулами-эффекторами приводит к изменению скорости синтеза мРНК, кодируемых этими генами (регуляция на уровне синтеза ферментов). Регуляция на уровне изменения активности свойственна, как правило, только ключевым ферментам клеточного метаболизма, которые обычно образуются вне зависимости от условий среды. Согласование регуляторных механизмов отдельных стадий катаболизма углеводов (например, гликолиза, ЦТК, окислительного фосфорилирования) осуществляется через ключевые продукты. В данном случае соотношение АТФ и АДФ определяет не только скорость транспорта электронов и окислительного фосфорилирования, но и скорости ЦТК, окисления пирувата и гликолиза. Как только возрастает потребление АТФ (уменьшается его концентрация), концентрация АДФ возрастает, и вслед за этим увеличивается скорость переноса электронов и окислительного фосфорилирования. Значит, поток электронов в дыхательной цепи должен усилиться, а это связано с возрастанием скорости гликолиза, обеспечивающего усиленное образование пирувата. Когда концентрация АТФ возвращается к своему исходному высокому уровню, перенос электронов замедляется. Замедляются ЦТК и гликолиз, поскольку АТФ действует как эффектор аллостерических белков — ингибитор ключевых ферментов гликолиза и окисления пирувата.