Основы асептики в биотехнологических производствах

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пензенский государственный технологический университет» (ПензГТУ) Факультет «Биомедицинских и пищевых технологий и систем» Кафедра "Биотехнологии и техносферная безопасность" МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ курс лекций по дисциплине: ОСНОВЫ АСЕПТИКИ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ Направление подготовки 240700.62 (19.03.01) Составитель: Марынова М.А. – к.т.н., доцент кафедры «Биотехнологии и техносферная безопасность» ПензГТУ Пенза, 2014 1 УДК 57.04 Рецензент: к.т.н., начальник НОЦ ОАО «Биосинтез» Полунина Е.Е. Марынова М.А.: Методы стерилизации / курс лекций по дисциплине «Основы асептики в биотехнологических производствах» / М.А. Марынова. – Пенза: ПензГТУ, 2014. – 34 с. Курс лекций содержит сведения об основных методах стерилизации, применяемых в биотехнологических производствах, их достоинствах и недостатках. 2 Содержание Общие положения и классификация 4 Термические методы стерилизации 4 Стерилизация фильтрованием 11 Стерилизация облучением 20 Химические методы стерилизации 23 Контрольные вопросы 33 Список использованной литературы 34 3 ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ Стерилизация – полное уничтожение всех видов микроорганизмов. Микроорганизмы отличаются друг от друга устойчивостью к различным воздействиям (высушиванию, свету, облучению, вакууму, давлению, холоду, нагреванию, химическим веществам и т.д). Как правило все микроорганизмы более чувствительны к влажному теплу, чем к сухому. Очень важным фактором, оказывающим влияние на термостойкость микроорганизмов, является среда, в которой они находятся. Например, терморезистентность особенно высока в масляных продуктах, молодые споры менее устойчивы, чем старые и т.д. Таким образом, методы стерилизации должны быть дифференцированными и они не должны изменять свойств обрабатываемого материала. Во всех случаях надо стремиться, чтобы время стерилизации по возможности было непродолжительным. Условно методы стерилизации можно разделить на: - термические (паровые и сухожаровые), - на физические (с помощью лучистой энергии) , - химические ( с использованием химических агентов в виде газов или растворов), - мембранные (фильтрованием). 1.ТЕРМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ Преимущества термических методов стерилизации: - надёжность, - отсутствие необходимости удаления стериизующих агентов из стерилизуемых объектов, 4 - технологическая простота, - возможность стерилизации объектов в упаковке, что позволяет сохранять стерильность определённый период времени. К этому виду обработки относятся прокаливание на огне, фломбирование, кипячение, стерилизация текучим паром, паром под давлением и при разряжении (низкотемпературный пар), пастеризация, тиндализация. Кипячение — процесс доведения воды до кипения. При кипячении микроорганизмов, погибает поэтому его большинство широко вегетативных используют при форм стерилизации предметов и материалов, не портящихся при такой обработке. Добавление бактерицидных веществ увеличивает скорость и надежность стерилизации кипячением. Недостатком метода является то, что при этом споры погибают не всегда. Пастеризация это однократное нагревание жидкостей при температуре около 60 град.C в течение 60 мин. или 70-80 град в теч. 30 мин. Пастеризация проводится с целью уничтожения вегетативных форм микроорганизмов, споровые формы при этом методе теплового воздействия сохраняют жизнеспособность. непродолжительный Поэтому период пастеризованные времени при объекты пониженных хранят температурах. Пастеризация применима для термочувствительных биологических жидкостей. Считается , что все биологически значимые соединения при этом методе воздействия сохраняются в неизменном виде. Технология предложена в 19 веке Луи Пастером Тиндализация- способ стерилизации, предложенный Дж. Тиндалем Её чаще всего проводят при 3-6 кратном нагревании (дробная стерилизация) в теченние 20-60 мин при 100 град. С с интервалом в 24 ч. В промежутках между нагреванием стерилизуемый материал выдерживают при 24-37 град С для возможности прорастания спор с целью их уничтожения при 5 очередной стерилизации. С помощью тиндализации стерилизуют биологические жидкости, содержащие кровь, сыворотку и д.р. Метод достигает цели, когда споры находятся в среде пригодной для их прорастания, и среда не содержит ингибиторов роста, а также при условии, если инкубация между циклами стерилизации проводится при благоприятных для прорастания спор температуре и других условиях. Метод не пригоден в случаях, когда оптимальная температура роста микроорганизмов выше температуры прогревания или инкубации (например у некоторых термофилов), а также для культур у которых споры в промежутках стерилизации не прорастут, если стерилизуемая среда непригодна для прорастания спор или содержит ингибиторы, если в ней имеются споры облигатных анаэробов, которые в аэробных условиях не прорастут и следовательно не погибнут. Кроме того, при повторном и продолжительном нагревании сред, содержащих углеводы и фосфаты, могут видоизмениться полисахариды и сахара и образоваться нежелательные продукты. Агар и желатина, например, могут потерять гелеобразующие свойства особенно, если среда сильнокислая или сильнощелочная. Общим недостатком методов дробной стерилизации является большие затраты времени, а достоинством то, что не требуется специальная аппаратура и возможность проводить процесс стерилизации в щадящих условиях. Паровая стерилизация осуществляется с помощью насыщенного водяного пара без и под давлением. Сочетанное воздействие на микроорганизмы влажностью и высокой температурой является основой парового метода стерилизации. Стерилизующий эффект пара связан с прогреванием объекта в процессе конденсации пара на поверхности и внутри объекта. Эффект конденсации оптимален у насыщенного пара, содержанием 3% воды. Перегретый пар, 6 содержващий менее 2 % воды может сжечь объект, а влажный пар с содержание влаги более 3% сильно увлажняет стерилизуемые объекты. Стерилизация текучим паром Текучим называется насыщенный водяной пар (без примеси воздуха), имеющий давление 760 мм рт. ст. и температуру 100 °С. Стерилизацию текучим паром осуществляют в паровом стерилизаторе при 100 °С в течение 30-60 мин в зависимости от объема раствора. Это один из распространенных методов стерилизации инъекционных растворов в аптеках. Если пар поступает централизовано из котельной, то перед вводом его в камеру сосуда должны иметься специальные устройства (ловушки пара), удаляющие конденсат, образующийся в коммуникациях при движении от источника пара до автоклава. Стерилизуемый материал, как и в других случаях тепловой обработки, располагают так, чтобы между объектами оставалось пространство для свободной циркуляции пара. Длительность стерилизации после достижения в аппарате 100 град С и выхода из камеры полной и непрерывной струи пара может быть различной - от нескольких минут до 1-1,5ч в зависимости от вида, массы, объёма, плотности упаковки и свойств материала, его термостабильности, загруженности камеры и т.д. Текучим паром стерилизуют питательные среды, растворы сахаров, аммиачные соли, мочевину, молоко, картофель, некоторые соли и реактивы, а также лабораторную продукцию и материалы, разрушающиеся при нагревании под давлением. Стерилизацию обычно проводят 3 сут. подряд, по 30 мин ежедневно (дробная стерилизация). В промежутках между стерилизациями материал, как и при других методах дробной стерилизации, выдерживают при температуре 2437 град С. Этот метод обеспечивает гибель только вегетативных форм микроорганизмов, споры же в промежутках между циклами стерилизации прорастают и погибают только при повторной стерилизации. 7 Стерилизация паром под давлением Такой способ наиболее надежен при уничтожении микроорганизмов и спор. Его проводят в автоклавах разнообразных по размерам, рабочему давлению, конструкциям, степени автоматизации и другим показателям. Повышение давления повышает точку кипения воды и соответственно температуру пара. Для стерилизации в автоклаве используют насыщенный пар, который соприкасается с холодными предметами и при этом происходит быстрая конденсация и нагревание. Из стерилизуемого объекта вода не испаряется. Благодаря этому удаётся избежать обезвоживания таких материалов как резина, ткани, бумага, разрушающиеся в процессе нагревания при той же температуре сухим жаром. Считается что при 121градС живые клетки погибают в течении 10 мин, большинство спор – после 5 мин экспозиции. Споры термофильных видов при таком воздействие погибают лишь через 23 мин, а споры, содержащиеся в земле – через 25 мин. При изучение влияния различных режимов тепловой стерилизации в автоклавах на питательные среды, используемые для биосинтеза пенициллина и эритромицина, и изменения биохимических свойств компонентов этих сред, установлено, что оптимальных для достижения высоких активности и надежности стерильности является режим: показателей Т=120град С±1, время= 25мин. Описаны бактерии выдерживающие температуру 350 град С и давление 265 атм. Стерилизация при пониженном давлении (низкотемпературный пар) Пар нагретый до 80 град С рекомендуется для дезинфекции пластмассовых, а также сложных и чувствительных к нагреванию материалов. Метод основан на том, что воздух из автоклава тщательно удаляется при 8 помощи вакуума после чего камера заполняются паром и формалином. При пониженном давлении легколетучие соединения переходят в пар. Количество используемого формалина и способ его введения зависит от типа стерилизатора. На этот метод нет тестов контроля с использованием химических индикаторов. Суховоздушная стерилизация Этот метод рекомендуется для материалов, портящихся от воздействия пара (коррозия и др.) и непроницаемых для пара: стеклянная посуда, пипетки завернутые в бумагу, пергамент или подпергамент, вата, пробирки, колбы, флаконы, металлические предметы и другие термоустойчивые материалы. Растворы, содержащие воду и органические вещества, при таком методе стерилизации могут стать непригодными. Следует также избегать стерилизации этим методом масел, если в них содержится много воды, а также органических веществ, животных и растительных тканей и волокон. В первом случае может произойти закипание, выброс и воззагорание, а во втором - изменение и порча среды. При суховоздушной , и при автоклавировании действующим фактором является теплота, однако стерилизация происходит в воздушной среде, что существенно изменяет характер прогрева и его действие на микроорганизмы. При этом методе стерилизации происходит перенос теплоты путем теплопроводности, конвекции и лучистой энергии. Трудности расчета и регулирования суховоздушной стерилизации связаны со сложным распределением температуры по отдельным точкам по зонам камеры. Суховоздушная стерилизация наиболее эффективна при свободном размещении стерилизуемого материала на решетчатых полках и при принудительной циркуляции воздуха в печи. Следует иметь в виду, что даже при правильном размещении стерилизуемого материала в камере трудно достичь его равномерного прогревания. Недостаток суховоздушной стерилизации - медленное прогревание. 9 Скорость прогревания зависит от ряда факторов (плохая передача тепла от воздуха к стерилизуемому предмету, масса предмета и его поверхность, вид и теплопроводимость стерилизуемого материала, конструкция стерилизатора, количество полок и др.). Имеют значение также способ размещения стерилизуемого материала, объем и упаковка стерилизуемых предметов, характеристика циркуляции воздуха, т.к. при недостаточной циркуляции воздуха могут возникать большие перепады температуры в различных участках камеры и воздушных карманах с разницей до 30 град С. Другой недостаток суховоздушной стерилизации слабая и неравномерная проницаемость жара и вредное действие его на некоторые материалы (ткани, кожа, бумаги и др.). Однако в целом суховоздушная стерилизация - достаточно надежный метод для обработки материалов, в которые пар трудно проникает (например воска масла). Резистентные микроорганизмы, находящиеся в глубине этих веществ не погибают при паровой стерилизации, несмотря на то, что температура при автоклавировании может достигнуть 121 град С. Гибель микроорганизмов при стерилизации сухим воздухом, по мнению большинства исследователей, связана с инактивацией клеточных белков и ферментов. Бактерицидное действие сухого горячего воздуха значительно слабее чем влажного пара при одной и тойже температуре. Так вегетативные формы микроорганизмов при температуре сухого воздуха 100 град С погибают через 1,5 ч, споры при 140 град С через 2 -3ч, а отдельные виды спор - при 170200 град С через 2ч. При воздействии пара они погибали значительно быстрее. Резистентность микроорганизмов к суховоздушной стерилизации зависит от ряда факторов: вида культуры, характера стерилизуемого материала, массы упаковки, содержания влаги в стерилизуемом материале и т.д. Так при содержании влаги 50% яичный альбумин коагулирует при 56 град, при полном отсутствии влаги - при 160-170 град С. Чаще всего суховоздушную 10 стерилизацию проводят при температуре 160-170 град С в течение 1-4ч. Описаны культуры, споры которых погибают через 139 ч суховоздушной стерилизации. Продолжительность суховоздушной стерилизации зависит и от физикохимических свойств материала, теплоемкости и теплопроводимости, массы, формы и плотности упаковки и т.д. Существует зависимость температуры и длительности стерилизации: при 170 град С-1ч; при 160 градС-2ч; при 150 град С-2,5ч; при 140 град С-3ч, при 120 град С-6ч. Однако по мнению некоторых исследователей температуру лучше не поднимать выше 160 град С. В противном случае из ваты и некоторых сортов бумаги выделяются ингибирующие рост микроорганизмов соединения. Эти вещества могут выделяться и при более мягком режиме стерилизации, но в значительно меньших количествах. При охлаждение камеры они конденсируются, поэтому стенки камеры периодически следует очищать. При стерилизации в суховоздушных шкафах открывать камеру можно только после ее охлаждения иначе при резкой перемене температуры стеклянная посуда может лопнуть, а в результате притока кислорода некоторые соединения способны к возгоранию. 2. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ФИЛЬТРОВАНИЕМ Стерилизацию фильтрованием проводят главным образом для термолабильных растворов – сывороток, токсинов, анатоксинов, некоторых питательных сред, лекарственных препаратов, т.е. когда при нагревании или других методах стерилизации свойства обрабатываемого продукта могут значительно измениться. Этот метод используют и в случаях, когда возможна тепловая стерилизация, но кроме микроорганизмов нужно удалить и субмелкие частицы. Фильтрование можно применить при очистке от микроорганизмов и 11 частиц пыли различных растворов, аэрозолей, эмульсий и воздуха. В отличие от других методов, когда умерщвленные микроорганизмы остаются в стерилизуемом продукте и могут быть причиной различных не желательных явлений (в частности пирогенности), при фильтровании клетки м.о. удаляются из стерилизуемого продукта. Эффективность фильтрации зависит главным образом от размера пор фильтров, структуры и поверхности фильтра, скорости фильтрования, размера частиц фильтруемой жидкости, ее химических свойств (она должна быть инертна по отношению к материалу фильтра), рН (щелочные жидкости с рН 7,28,0 фильтруются легче), давления и т.д. Материалы, понижающие поверхностное натяжение (сыворотки, желчь, кислоты, мыла и лаурилсульфат натрия) способствуют проникновению микроорганизмов через фильтр содержащий кремний. Скорость фильтрования повышается с повышением температуры. Необходимо иметь в виду, что некоторые виды м.о. могут быть фильтрующимися или находится в L-форме, что нарушит эффективность стерилизации. В некоторых случаях перед фильтрованием жидкость центрифугируют или предварительно фильтруют для отделения грубых частиц, снижающих скорость и эффективность стерилизации фильтрованием. 2.1. Фильтрующие материалы и устройства Для стерилизации используют фильтры изготовленные из материалов с различными физическими и химическими свойствами, пропускной и адсорбционной способностями и т.д. Так фильтры из нитрата целлюлозы неустойчивы к кетонам, сложным эфирам, низкомолекулярным спиртам. Они пригодны для работы в пределах рН 1-10. Фильты из поликриамида пригодны для работы при рН 5-12 и устойчивы ко многим органическим растворителям. Устойчивы почти ко всем органическим растворителям и концентрированным 12 кислотам и щелочные фильтры из политетрафторэтилена (фторопласта). Для стерилизации фильтрованием применяют такие фильтры-свечи различных конструкций (Шамберлана, Беркефельда и др.), фильтры Зейтца и др. 2.2 Фильтры-свечи Это полые цилиндры закрытые с одного конца, изготовленные из фарфора, диатомита, кремнезема, каолина с примесью песка и других материалов. Фильтрование может проходить снаружи внутрь свечи или наоборот. Свечи Шамберлана в верхней части (шейке) имеют покрытую глазурью головку для соединения с сосудом и выпускаются с порами разного размера обозначенными L1,L2,...........................L13 ( чем крупнее поры тем ниже индекс) Фильтрующиеся вирусы легко проходят через фильты L1,L2. Эти фильтры иногда используют для осветления и предварительного фильтрования. Для бактериологических целей наиболее часто используют свечи марок L5,L6 и L7. Основной недостаток свечей Шамберлана закупорка пор и необходимость регенерации. Фильтры Беркефельда - это полые цилиндры длиной 5-25 см и диаметром 1,5-5 мм, имеющие в верхней части фарфоровую или металлическую головку для соединения с резиновой трубкой. Они менее прочны и более пористы чем свечи Шамберлана, не выдерживают частой обработки и действия кислот. Имеют следующие обозначения W-wenlgiurohlaasig- малой пропускной способности, мелкопористые (до 3-4 мкм), N- normaldurchlaaaig-нормальной пропускной способности (от 5 до 7 мкм) и V-vieldurchlaaaig-крупнопористые (812мкм). Основной недостаток этих свечей -непрочность особенно в местах соединения с металлической оправой. Кроме того, они обладают адсорбирующей способностью и имеют сравнительно малую фильтрационную скорость. Их можно использовать повторно после регенерации, хотя во многих 13 руководствах это не рекомендуется. Фильтры-свечи стерилизуют в автоклавах в собранном виде 30 мин при 121 град С или другими способами. Чтобы в отводной трубке вата не отсырела, перед автоклавированием конец трубки заворачивают в бумагу. При фильтровании создают повышенное давление над фильтруемой жидкостью или разряжение в сосуде для накопления отфильтрованной жидкости. Давление или разрежение при фильтрации необходимо создовать постепенно до величины не более 400 мм рт.ст. Фильтрование под давлением более предпочтительно, так как при этом можно менять приемник, сохраняя не прерывность процесса. При этом исключается вспенивание жидкостей содержащих белок (например бульон и др.). Перед применением простерилизованные свечи выборочно проверяют на целостность. Для этого их опускают в сосуд с водой и накачивают воздух. При наличии дефектов и трещин выделяются пузырьки газа. Для проверки можно также провести пробное фильтрование суспензии мелких микроорганизмов. При неповрежденном фильтре они должны задерживаться и не попадать в фильтрат. Фирма " Мillipore Intertech Inc" для контроля марок не которых стерилизующих фильтров используют культуру Pseudomonas dininuta с минимальным размером клеток-0,3 мrм. В зависимости от размера пор фильтра в одних случаях профильтрованная бульонная культура при инкубации прорастает. в других нет. После употребления свечи стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 121 градС. Их нельзя оставлять во влажном состоянии во избежание прорастании микрофлоры. Затем свечи промывают и в случае необходимости регенерируют, после чего они могут быть использованы повторно. 2.3. Фильтры Зейтца 14 Эти фильтры обычно представляют собой одну или несколько пластинок, их поверхность с одной стороны гладкая, с другой- шероховатая. При сборке фильтра пластины кладут на металлическую сетку гладкой поверхностью вниз. Асбестовые пластинки выпускают разной толщины (4-6мм) и диаметра (35140мм) размер пор 0,8-1,8мкм. Отечественные асбестовые пластинки по ГОСТУ 480-78 имеют обозначения Ф и Ф1 (для осветвления житкостей) и ОФ, ОФ1, ОФ3 и ОФ5 (для стерильной фильтрации медицинских препаратов). Импортные имеют обозначения E-entkeined (стерилизующий). EK-размер пор 1,5-18 мкм EKS-1,1-1,2-1,5мкм и EKB-0,8-1,0 мкм. Недостаток асбестовых фильтров следующие. Они довольно ломкие, их нельзя регенерировать, из них выделяются щелочные ионы и следы железа, поэтому первые порции фильтрата рекомендуется отбрасывать и фильтры предварительно промывать слабой кислотой и дистилированной водой. Кроме того они имеют сравнительно малую скорость фильтрования загрязняют фильтрат волокнами и адсорбируют различные вещества, задерживая значительное количество ферментов вирусов и др. Для устранения последнего недостатка рекомендуется сначала профильтровать бульон или 0,006%-й раствор желатины или 0,05%-й раствор альгинатаа натрия (потери основного фильтруемого вещества могут уменьшаться при этом на 2-3%). К достоинствам асбестовых фильтров можно отнести дешевизну, доступность, способность улавливать пирогенные вещества и высокую емкость поглощения. Фильтр Зейтца в собранном виде заворачивают в бумагу и стерилизуют в автоклаве 30мин 121град С или другими методами. Асбестовые пластины перед использованием монтируются в прибор Зейтца или другом устройстве- держателе, который обычно состоит из двух частейверхней и нижней, соответствующего между размера, которыми накладываемая закладывается на металлическую пластинка сетку и закрепляемая винтами (не рекомендуется винты перед автоклавировании того 15 затягивать). Наиболее удобным является устройства, позволяющие вести фильтрование как под давлением так и под вакуумом. Монтаж винтов для большей надежности рекомендуется производить до автоклавирования и с соблюдением стерильности или все части фильтра Зейтца стерилизовать заранее. Для лабораторных целей применяют обычно смонтированный аппарат с одной пластиной диаметром от 3 до 14 см а для производственных целей существуют многорамные аппараты с большим количеством пластин (50-80) диаметром 22-30см. Каждый фильтр специально подбирают к приемнику, куда будет собираться фильтрат. Приемник присоединяют к водоструйным или масляным насосам с помощью вакуумной резиновой трубки. Вакуум насос рекомендуется включать спустя 5-10мин, чтобы фильтруемая жидкость за это время могла пропитать пластину (можно пропитать и стерильной дистиллированной водой). Фильтрование проводится по возможности при малом и постоянном давлении для предотвращения одновременного поступления в поры большого количества частиц, вызывающих закупорку отверстий. Давление должно быть не больше 0,35кг/см2. Его следует повышать постепенно, так как сильное разряжение или сильное давление может ускорить закупорку пор и привести к проскоку микробных клеток. Пластинки Зейтца после употребления автоклавируют 30мин при 121 градС, фильтры после обезвреживания выбрасывают. 2.4. Стеклянные фильтры Фильтрующим элементом являются пластины из мелкопористого стекла. Наибольшая пористость 250-100мкм (фильтр ОО) наименьшая 1-1,5мкм. Для стерилизации используют фильтры с диаметром пор менее 2 мкм. Стеклянные фильтры имеют отрицательный заряд, слабее адсорбируют 16 растворенные вещества при фильтрации, не загрезняют фильтрат. Их можно стерилизовать теплом и обрабатывать кислотами. Скорость фильтрования через стеклянные фильтры относительно низкая. После употребления стеклянные фильтры обеззараживают, затем промывают дистиллированой водой, пропуская ее в обратном фильтрованию направлении. После этого фильтр заливают на 10-12 ч концентрированной серной кислотой с небольшим количеством нитрита натрия и хлорида кальция, промывают многократно дистиллированной водой и кипятят. Нельзя допускать засорения пор стеклянных фильтров. Широко распространены фильтры Нутча и воронки Бюхнера. в которые впаяны пластины из мелкопористого стекла с порами 30-120мкм. 2.5. Мембранные фильтры и ультрафильтры Обычно это диски толщиной 0,1мм и диаметром до 50 мм, изготовленные из ацетата целлюлозы и нитроцеллюлозы, ацетилцеллюлозы, полиамида, политетрафторэтилена и т.д. Мембранные фильтры пронизаны множеством лабиринтных отверстий, соединяющих верхнюю часть диска с нижней. Поверхность их с одной стороны гладкая с другой шероховатая. Мембранные фильтры и ультрафильтры различаются в основном величиной и многослойностью структуры пор (у ультрафильтров диаметр пор 100мкм и меньше). Мембранные фильтры чаще используют для отделения или удаления бактерий, а ультрафильтры - для выделения вирусов и высокомолекулярных белков, поэтому их еще называют коллоидными У нас в стране в микробиологии используют химически стойкии мембранные фильтры " Владипор" микрофильтрационные ацетатные МФА-АА и МФА-А и ультафильтрационные ацетатные мембраны (УАМ и др.)(таб.3.). Таблица 3 Характеристика фильтров "Владипор" 17 Марка фильтра средний диаметр пор мкм УАМ-50 неболее 0,005 УАМ-100 0,005-0,01 УАМ-300 0,02-0,03 УАМ-500 более 0,03 МФА-МА№1 0,05-0,15 МФА-МА№3 0,251-0,35 МФА-МА№5 0,451-0,55 Эти фильтры разработанны на основе ацетата целлюлозы. Они обладают слабой сорбционной способностью не горючи не токсичны для животных пригодны для работы в диапазоне рН от 1до10,0 и в присутствии спирта. Мембранные фильтры широко применяются в лабораториях при бактериологических исследованиях воздуха, воды и различных жидкостей, а также антибиотиков и других веществ на присутствие в них бактерий. Для этих целей можно использовать отечественные фильтры марок МФА-МА и МФА-А с размерами пор 0,45-0,2мкм или фильтры "Миллипор" марки НА. За рубежом мембранные фильтры производят фирмы "Millipore Intertech" (США) "Sartorius Werke GmbH"(ФРГ) "Full Europe Ltd" (Великобритания) "Synpor" (Чехо-Словакия) и др. Сравнительно недавно фирма "Micron Separation Inc" собщила о производстве новых мембранных фильтров из ацеттата целлюлозы имеющих размер пор от 0,2 до 10мкм. Эти фильтры связывают незначительное количества белка и предназначены для использования в диагностических иследованиях при проведении которых нужно исключить потери белка. Мембранные фильтры непригодные для длительного фильтрования, 18 поскольку их поры закупориваются. Некоторые микроорганизмы (стрептомицеты) могут прорастать через поры некоторых мембранных фильтров. Достоинства мембранных фильтров - сравнительно большая скорость фильтрования, малая адсорбционная способность. Кроме того, все клетки микроорганизмов из большого количества фильтруемой жидкости (воды мочи молока разведенной крови и т.п.) накапливаются на маленьком участке- диске и можно исследовать стерильность фильтратов по количеству проросших на диске колоний. Стерилизовать мембранные фильтры можно при автоклавировании, а также при помощи оксида этилена в смеси с диоксидом углерода (время экспозиции 6ч) или 2%-го раствора формальдегида (экспозиция 24ч). После этого фильтры необходимо проветрить в стерильных условиях. При фильтровании растворов на мембранных фильтрах могут адсорбироваться токсичные катионы (например ионы меди). В результате высокой концентрации этих катионов на поверхности фильтров уменьшается количество колоний вырастающих на них. Поэтому их, по завершении процесса фильтрации, в случае изучения общего количества микробных клеток, содержащихся в исследуемой жидкости, промывают стерильной водой. Обратную картину можно наблюдать при подсчете числа колоний Е. cоli, если в фильтруемом растворе содержатся даже в малых концентрациях ионы Fe,Мg и др. Мембранные фильтры применяют для удаления пирогенных веществ из лекарственных препаратов, используемых для парентерального введения. 19 3. СТЕРИЛИЗАЦИЯ ОБЛУЧЕНИЕМ Этод метод относится к физическим методам. Бактерицидный и стерилизующий эфекты достигаются различными видами облучения инфракрасными (ИК), ультрафиолетовым (УФ), рентгеновскими лучами, альфа, бета и гамма лучами радиоактивных элементов, катодными лучами генерируемыми на ускорителях частиц и т.д. 3.1. Инфракрасные и ультрафиолетовые лучи Бактерицидное действие ИК-лучей на микроорганизмы зависит от длины волны, интенсивности и длительности облучения объекта. При длине волны 0,71,4 мкм они глубоко проникают в ткани человека, а более длинные лучи оказывают лишь тепловой эфект. ИК лучи используют для стерилизации хирургических инструментов и некоторых материалов. УФ лучи можно использовать от любых источников и обрабатывать продукты питания, воздух в закрытых помещениях, поверхности лабораторного оборудования, биологические жидкости и воду в тонком слое. Мощность УФ лучей измеряется в бактак (единица бактерицидного потока частиц с длиной волны 0,254мкм, мощностью 1Вт приходящаяся на площадь 1м2) и выражается соответствующими единицами измерения б/м2 или мкб/м2. Доза УФ излучения губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор) составляет 5 мкб/см2. 90% патогенных микроорганизмов погибают при интенсивности УФ облучения 1,5-5мкб/см2.Губительное действие УФ лучей обусловлено изменением колоидной системы микробной клетки. Чувствительность микроорганизмов к этому облучению зависит от множества факторов: вида культуры и ее физиологического состояния; состава среды в которой они находятся, источника излучения, экспозиции, упаковки стерилизуемого материала и др. Более чувствительным к обработке УФ лучами 20 грамотрицательные микроорганизмы, в лаг фазе роста, кислой среде, при наличии в облученном объекте паров бактерицидных, химических и других веществ и тд. Более устойчивы к облучению споры бактерий и плесеней, туберкулезная палочка, старые культуры и культуры в щелочных условиях при наличии в облучаемом объеме взвешенных частиц пыли и др. 3.2. Радиационная стерилизация Кобальт-60, цезий-137, уран, торий, радий и некоторые другие элементы самопроизвольно непрерывно испускают невидимые лучи, которые подобно рентгеновским, способны проникать через плотные материалы и вызывать ионизацию с образованием активных ионов-радикалов. В магнитном поле пучек радиоактивных лучей разделяется на три части: положительно заряженные альфа- частицы, отрицательно заряженные бета- частицы и нейтральные гаммалучи. Последние обладают способностью проникать через бумагу, дерево, стекло, метал и другие материалы и вызывать ионизацию субстрата жизнедеятельного микроорганизма с образованием активных ионов (радикалов), что нарушает обмен веществ в клетке и приводит к ее гибели. Достоинством источников гамма излучения для стерилизации продуктов питания и медикаментов (выдерживающих и не выдерживающих тепловую обработку) является то, что они обладают высокой проникающей способностью, достаточной мощностью и обеспечивают бактерицидное и стерилизуюшее действие в течении короткого промежутка времени. При этом не возникает наведенной радиоактивности и температура объекта почти не повышается. Это позволяет использовать гамма лучи для стерилизации термолабильных лекарственных и других медицинских препаратов, различных биологически активных веществ. Кроме того точное измерение поглощенной энергии с помощью дозиметров позволяют исключить необходимость проверки на стерильность дорогостоящими микробиологическими методами. 21 Достоинства ионизирующего излучения и наличие мощных установок позволяют осуществлять стерилизацию различных продуктов, в том числе медицинского назначения, и материалов в товарной упаковке, создать конвейрный метод, а также механизировать и автоматизировать процесс. Для радиационной стерилизации принято пользоваться единицей поглощенной энергии радиан (радиационная абсорбционная доза, рад) равной 100 эрг/г вещества или мегарадиан (Мрад). Стерилизующая доза зависит от свойства материала, концентрации вещества, степени обсемененности объекта, вида облучаемого организма, его физиологического состояния. Поэтому для каждого вида вещества необходимо отрабатывать режим стерилизации (дозу, длительность облучения и т.д.). Считают, что доза 2,5 Мрад достаточна для стерилизации антибиотиков. В последнее время опубликованы работы, в которых показано, что в зависимости от контаминации облучаемых веществ эту дозу можно снизить. Резистентность микроорганизмов к ионизирующему излучению зависит от наличия в среде влаги, кислорода и SH- групп рН, и т.д. Она увеличивается в присутствие цитрата натрия, нитритов, спиртов, глицерина, глюкозы, аминокислот, в отсутствии кислорода, при замене воздуха некоторыми инертными газами, снижении температуры и т.д. и снижается в присутствии ионов меди, этилмалеимида и его дериватов, малеинового ангидрида и др. Грамположительные бактерии более резистентны, чем грамотрицательные. Из всех микроорганизмов наиболее устойчивы клетки Bacillus botulinum, наименеевирусы и риккетсии. Ионизирующее излучение можно использовать во многих случаях с большим успехом для стерилизации ряда питательных сред, биологических жидкостей, различных фармацевтических препаратов, полимерных материалов, фармацевтических препаратов, инъекционных растворов, изделий медицинского назначения. 22 4. ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ Химические методы относят к методам холодной стерилизации. Их достоинством является возможность применения для стерилизации термолабильных компонентов и в некоторых случаях термостойких материалов больших объемов и поверхностей без нагревания (например перчаток которые при стерилизации кипячением или в автоклаве теряют эластичность). 4.1. Стерилизация микробицидными газами Ее обычно проводят в стерильных аппаратах или камерах при определенных температуре, влажности и т.д. Для этих целей пригодны только вещества, обладающие спороцидными свойствами. Наиболее сильным и широким антибактериальным действием обладают хлор, диоксид серы, оксид этилена, формальдегид, глютаральдегид, озон и др. Этот вид стерилизации более сложный в исполнении, чем другие (например стерилизация теплом). При его проведении требуются строгий контроль за температурой, концентрацией газа, давлением, влажностью, экспозицией и другими параметрами. Контакт со стерилизуемым материалом происходит в результате адсорбции пара или газа, конденсации пара либо того и другого на поверхности объекта. С увеличением температуры, давления и влажности эти процессы интенсифицируются. Эффективность стерилизации зависит и от свойств обрабатываемого объекта, а именно, удельной поверхности, шероховатости, пористости, влажности, химического взаимодействия, физиологического состояния культуры микроорганизмов, и др. Газом стерилизуют почти все синтетические материалы: резину, стекло, металл, а также различные изделия медицинского назначения в том числе термолабильные пластмассы, не выдерживающие тепловую стерилизациию и стерилизацию химическими растворами. В качестве упаковочного материала 23 используют бумагу, материю, полиэтиленовые пленки, которые более предпочтительны, так как они прозрачны. Трудно проницаемые для газа пленки из целлофана, поливинилалкоголя, терефталата. Формальдегид и глутаральдегид. В практике пользуются 40%-м водным раствором формальдегида (формалин), в котором в качестве примесей могут быть метиловый спирт, ацетон, муравьиная и уксусная кислоты. Формальдегид легко полимеризуется, параформальдегид или особенно при пароформ. низких При температурах, добавлении образуя спирта (30% формалина+70% спирта) полимеризация уменьшается и смесь становится пригодной для стерилизации. Формальдегид обладает высокими бактерицидными свойствами и широким спектром действия. На его эффективность влияют температура (оптимум 50-60 град С), влажность воздуха (не ниже 75%). Он обладает высокой проникающей способностью, и свойством сильно адсорбироваться. Десорбция из стерилизуемых материалов происходит медленно. Уничтожение вегетативных форм микроорганизмов наблюдается при содержании формалина 75 мл в 1м3, а спор - при 250 мл в 1м3. Пары формальдегида нейтрализуют раствором аммиака. Некоторые уксуснокислые бактерии детоксифицируют формальдегид. Летальная доза формалина для человека 10-15г (35%-й раствор). Большинство культур, засеянных на чашках, при внесении дисков пропитанных формалином, в течении 2ч при температуре 36 град С погибает. Спорицидная активность формальдегида для культур Bac stearothermophilus и Bac subtilis var niger проявляется при концентрации паров формальдегида 2г/м3 , температуре 18-20 град С, относительной влажности воздуха 80% и экспозиции 2ч в условиях принудительной вентиляции. Глутаральдегид менее летуч и обладает более низкими коррозионными свойствами, чем формальдегид. Он также характеризуется высокими 24 бактерицидными и спорицидными свойствами. Глутаральдегид устойчив при температуре 4 град С, лучше проявляет свое действие в слегка щелочных условиях (рН 7, 5-8,5), полимеризуется при рН выше 9. Его применяют в 2%-й концентрации. Пластмассы и резину рекомендуется стерилизовать в течение 30мин. Можно добавлять биокарбонат натрия и 70%-й изопропиловый спирт при одновременном понижение концентрации альдегида до 1%. Действие глутарового альдегида изучено. Его бактерицидное действие обусловлено повреждением транспортных белков цитоплазмотической мембраны и снижением активности дыхательных ферментных систем, что приводит к сокращению поступления энергии в клетку. Оксид этилена. Это вещество применяют в виде газа или жидкости. Оно хорошо растворяется во многих органических растворителях, смешивается с водой в любых соотношениях, образуя с ней малоядовитый для человека этиленгликоль. В смеси с воздухом (75-1440г/м3) легко воспламеняется. Оксид этилена взрывоопасен и весьма ядовит (предельно допустимая доза в помещении 0,001мг/л), легко полимеризуется. Газообразный оксид этилена вызывает гемолиз эритролитов, инактивацию комплемента и некоторых антибиотиков (например стрептомицин инактивируется на 35%). Не оказывает сильного воздействия на споры, но считается перспективным для стерилизации биотканей. Пары оксида этилена обладают бакцерицидными, фунгицидными, вирусоцидными и овоцидными свойствами. Споры микроорганизмов (всего в несколько раз) устойчивее, чем вегетативные формы к парам оксида этилена. Оксид этилена легко проникает через различные ткани и материалы, не повреждает бумагу, ткани, металл, не изменяет прочности пластмасс и быстро выделяется из стерилизуемых объектов. Стерилизацию им проводят в специальных автоклавах при контроле влажности температуры давления и т.п. Важным фактором при стерилизации этим газом является его 25 концентрация внутри камеры (при экспозиции 6-16ч она должна составлять 450г/см3). Концентрация паров, обеспечивающая стерилизацию различных объектов, находится в пределах 450-850мг/л для вегетативных культур и 8501250мг/л для споровых. В связи с тем, что оксид этилена легко воспламеняется и взрывоопасен, его часто используют в смеси с инертными газами (диоксидом углерода, фреонами, метилмуравьиным эфиром). Смесью оксида этилена с диоксидом углерода и фреонами стерилизуют резиновые изделия, пластмассовые материалы (некоторые пластмассы портятся), приборы и инструменты, питательные среды, лекарства. Для сохранения действия оксида этилена в жидком виде к нему добавляют воду, метиловый спирт, оксид пропилена и др. В жидком виде оксид этилена трудно применять, так как десорбция его идет очень медленно и при его воздействии происходит набухание резины. Жидкий оксид этилена в концентрации 0,5-2% рекомендуется для стерилизации питательных сред, углеводов, ферментов, зерна, бульона, молока, крови и т.д., а при двукратном воздействии в течении 6ч - земли. Обычно среды стерилизуют в чашках Петри при концентрации газа 1200мг/л в камере при 55 град С. Такую же концентрацию можно использовать для стерилизации сухих сред. Для контроля стерилизации предложены различные химические (материалы изменяющие окраску в зависимости от концентрации оксида этилена или пропитанные веществами, изменяющими окраску в присутствии этого газа. С этой же целью используют индикаторную жидкость (вода 1л, MgCl2*6H2O – 680 г, соль бромфенолового синего-1 г, соляная кислота от 3 до 30г, загуститель - 26г). При стерилизации устанавливается щелочная среда, что фиксируется индикатором) и биологические индикаторы. Оксид пропилена. Это жидкость с эфирным запахом. Ее бактерицидные свойства примерно в два раза слабее, чем оксида этилена. Используют его 26 главным образом в растворах. С оксидом этилена он проявляет синергическое действие. Оксид пропилена применяют для стерилизации агаризованных питательных сред. Озон Это сильный окислитель с высокими бактерицидными свойствами. Озон в основном используют для дезинфекции воды. В высоких дозах токсичен. Диоксид углерода. В определенных условиях можно проводить эффективную стерилизацию этим газом дрожжей, и нект. других культур. β-Пропиолактон (БПЛ). При нормальной температуре и давлении это летучая бесцветная жидкость со сладковатым раздражающим запахом. При температуре 37 град С испаряется в виде газа, обладающего сильным слезоточивым и раздражающим кожу действием. При температуре выше 25 град С БПЛ гидролизуется. Водные растворы БПЛ нестойки, поэтому более надежными для стерилизации являются его пары (на воздухе могут воспламеняться). БПЛ смешивается с большинством органических растворителей и водой. Для его растворения рекомендуется использовать физиологический раствор или слабо щелочной фосфатный буфер. Активность БПЛ проявляется во время ионных реакций в фазе гидролиза, поэтому для длительной экспозиции со стерилизуемым продуктом (что не опасно) в конечном счете образуются малотоксичные вещества, в частности, βпропионовая кислота. БПЛ легко реагирует со многими веществамигидроксилами, карбоксилами, сульфидридами, аминными и феноловыми группами. Следует учесть, что после полного гидролиза БПЛ питательная среда, как и любой стерильный продукт может инфицироваться. БПЛ обладает очень высокими бактериостатическими (1:5000), бактерицидными (1:1000), вирусоцидными и фунгицидными свойствами и очень малой токсичностью. Его можно применять для стерилизации вакцин, сывороток, крови, плазмы, тканей и других биологических субстратов, которые нельзя стерилизовать другими методами, так как белки под воздействием БПЛ 27 не коагулируют. Большинство вегетативных и споровых организмов погибают при концентрации БПЛ 0,5-2% в течение 10 мин. В таких же концентрациях БПЛ подавляет функции многих ферментов, на чем основан механизм его действия. Стерилизация растворов достигается при конечной концентрации реактива в среде 0,2-0,5% (например, 20%-й раствор сахара стерилизуют 0,2% БПЛ при 37 град С в течение 2ч при периодическом перемешивании). Жидкую среду при стерилизации БПЛ готовят обычным способом и добавляют реактив в концентрации 0,2% об/об. Продукты гидролиза обычно снижают рН, поэтому его необходимо корректировать. Установлено, что стерилизующая доза БПЛ для вегетативных форм микроорганизмов составила 0,25%, а для споровых форм - 0,5% . Продукты его гидролиза, добавленные к этим же средам в концентрации 0,2-1%, не обладали бактерицидными свойствами. 1%-й водный раствор БПЛ можно применять для стерилизации пшеничных отрубей увлажненных водой или свекловичным жомом, ферментных вытяжек из грибов рода Aspergillus при температуре 37 градС и экспозиции 3ч. Для стерилизации пластмасс рекомендуется применять 1-2%-е водные растворы БПЛ при экспозиции 6ч. В газообразном состоянии, наиболее неблагоприятном для бактериальных спор, БПЛ в 25 раз активнее формальдегида и в сотни раз активнее оксида этилена и бромистого метила. Однако его проникновение в объекты меньше, чем оксида этилена. Токсичность газообразного БПЛ невелика, он не обладает разъедающими свойствами и не конденсируются на поверхности. Имеются сведения о канцерогенности БПЛ. Стерилизацию с помощью БПЛ, как и с оксидом этилена, проводят в закрытых камерах при контроле температуры и влажности. Оптимальные условия стерилизации: относительная влажность 70-80% температура 25 градС, конечная концентрация БПЛ в воздухе, 2-4мг/л экспозиция 2-3ч. 28 4.2. Стерилизация дезинфицирующими веществами Ни одно дезинфицирующие средство не оказывает моментального действия и нужно время для контакта и взаимодействия его с клеткой. Действие дезинфицирующих веществ зависит от концентрации, температуры, вида и состава популяции, ее чувствительности к агенту, возраста и физиологического состояния, рН и состава среды, наличия белков- антагонистов, смачиваемости и т.д. Вещества, снижающие поверхностное натяжение (мыла и др.), повышают эффективность дезинфицирующих веществ. Эффективность дизинфицирующих веществ оценивается по многим показателям: действию на микроорганизмы, порче материала поверхностей, активности, стоимости и условиями применения (в жидком или газообразном виде), стабильности, запаху и др. Для определения и сравнения эффективности дезинфицирующих веществ пользуются фенольным коэффициентом, т.е. сравнивают с эффективностью чистого фенола в стандартизированных условиях. При изучении дезинфицирующих веществ следует иметь в виду устойчивость к ним микроорганизмов, наличие устойчивых мутантов и появление штаммов, которые развиваются только в присутствие этих веществ. Галлоиды. Из галлоидов используют хлор, йод и их производные. Бактерицидные свойства хлоросодержащих препаратов определяются содержанием активного хлора. При добавлении солей аммония или снижения рН их бактерицидная активность повышается. Все они в той или иной мере растворяются в воде, вызывают коррозию, а некоторые обесцвечивают ткани. Хлор ядовит, имеет неприятный запах, как и йод легко инактивируется в присутствии органических веществ. Йод - более сильное бакцерицидное вещество, но он дорог и плохо растворим в воде. Хлорную известь добавляли к ферментационным средам стрептомицина и пенициллина. Для удаления хлора вносили гипосульфит. При этом образование антибиотиков на соево-глюкозо29 гидрольной и некоторых других средах не снижалось. Хлор быстро и прочно связывается с поверхностными слоями клетки и только небольшая часть его действует на протоплазму. Йод проникает в клетку и является эффективным бактерицидным веществом. Из соединений йода наиболее широко применяют йодофоры- комплекс йода с поверхностно активными соединениями, в том числе полимерами. Эти соединения обладают бактерицидными и моющими свойствами, не токсичны, не имеют запаха, не окрашивают среды. Их бактерицидное действие примерно в 8 раз выше чем у хлора. Фенолы. Эти вещества имеют слабокислый характер и действуют длительно. Эффективны против микобактерий и грибов, но неспороцидны!!!! Растворяются в воде слабо, активность снижается в присутствии органических веществ и повышаются в сочетании с мылами. Кислоты. Действие их зависит от многих факторов, прежде всего от рН и наличия диссоциированных малекул. Из органических кислот наибольшего внимания заслуживают надуксусная (паруксусная) и надмуравьиная кислоты. Антимикробное действие надуксусной кислоты в 5 раз выше уксусной. Механизм ее действия схож с действием пероксида водорода. При хранении надуксусная кислота не очень стойкая. Эта кислота является высокоэффективным дезинфицирующим агентом, образующиеся при её разложении продукты низкотоксичны. Надуксусную кислоту использовали для стерилизации резиновых, пластмассовых и других изделий, аппаратов, а также сыворотки. Борная кислота в концентрации 0,5-5% является надежным консервантом различных культур в биологических продуктах. Синтетические детергенты. Большую популярность получили для дезинфекции синтетическии детергенты. Это четвертичные органические соединения аммония, обладающие в концентрациях 0,1-2% высокими 30 поверхностно-активными, бактеристатическими, бактерицидными, фунгицидными (но не спороцидными!) и моющими свойствами. Они не оказывают разъедающего и обесцвечивающего действия, обладают хорошей смачиваемостью, растворимостью, стабильностью и дешевизной. Наиболее эффективны соединения в которых радикал состоит из 12-16 атомов углерода. Различают катионные, анионные и неионные четвертичные соединения аммония (соответственно органический радикал является катионом, анионом или не ионизируется). Катионные соединения наиболее эффективны, как дезинфицирующие вещества. Известны следующие растворы для стерилизации: - смешивают неионное поверхностно-активное соединение, содержащее 412 молей оксида этилена и 1 моль неионного поверхностно-активного соединения; - 1-1,5 моля глутаральдегида и 1-1,5 моля триэтиленгликоля. Смесь выдерживают при комнатной температуре, через 20-30 мин после смешивания компонентов раствор может быть использован для стерилизации. В качестве химического средства стерилизации питательных сред для культивирования грамотрицательных бактерий можно использовать додецилбензосульфонат натрия и сульфонол. Спирты. Бактерицидные свойства спиртов увеличиваются по мере возрастания малекулярной массы: метиловый спирт уступает этиловому, этиловый - пропиловому и т.д. Спирты не обладают спорицидными свойствами, их действие усиливается в сочетании с различными веществами (йодом, формалином, мылами, фенолами, бриллиантовой зеленью и др.). Окислители. Перманганат калия обладает поверхностным действием, не действует на споры и микобактерии. Пероксид водорода –жидкость, смешивающаяся с водой и легко разлагающаяся. Для стабилизации к ней добавляют веронал (0,1%), борную 31 кислоту (0,3%) или ацетанилид (0,15%). Бактерицидные концентрации пероксида водорода составляют 1-3%, а при добавлении 1%-й муравьиной кислоты (особенно к 6%-му раствору), пероксид водорода оказывает спороцидное действие. Действие пероксида водорода усиливается при добавлении гидроксила натрия, аммония, солей меди или железа, поверхностно-активных веществ. Он не действует на пластмассы, но разрушает резину. Пластмассы можно стерилизовать 10%-м раствором пероксида водорода при 55 град С в течении 18ч. При концентрации пероксида водорода 0,1% происходит полная стерилизация ферментационной среды через 7ч выдержки при 45 град С и через 24ч при 30 град С. Колебания рН в пределах 4-8 несущественно влияют на результаты. Хлороформ. Убивает вегетативные формы микроорганизмов довольно быстро (как толуол, ксилол, ацетон и эфир), действуют на фаги. Пары хлороформа также обладают бактерицидными свойствами. Пластмассы в нем растворяются. Конечная концентрация в жидких питательных средах составляет 0,5-2%. 32 Контрольные вопросы: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Основные виды термической стерилизации Достоинства и недостатки термической стерилизации Правила стерилизации в автоклаве Виды, механизм действия, достоинства и недостатки стерилизации ионизирующим излучением Факторы, влияющие на эффективность стерилизации Основные химические агенты, применяемые для химической стерилизации Достоинства, недостатки и возможности применения химической стерилизации Биологические и химические индикаторы и их роль в контроле эффективности стерилизации 33 Список использованной литературы: 1. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Потехина Т.С. – Дезинфекция и асептика в промышленности и медицине. СПб., Фолиант. - 2004 – 95с. 34