Микробиологическая биотехнология

Л 5 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ 5.1 Понятие о культивировании микроорганизмов 5.2 Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними 5.3 Приготовление посевной микробной культуры 5.4 Приготовление и стерилизация питательных сред 5.5 Подготовка биореактора к посеву 5.6 Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль за процессом культивирования 5.7 Хемостатная культура, или метод непрерывного культивирования микроорганизмов 5.1 Понятие о культивировании микроорганизмов Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы: ^ культура микроорганизмов; ^ питательная среда; ^ аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций; ^ средства контроля и управления. Внесение микроорганизмов в стерильную среду называетсяпосевом, илиинокуляцией.Посев микроорганизмов требует соблюдения определенных правил, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами. По окончании работы посуду с культурами микроорганизмов, подлежащими выбрасыванию, следует автоклавировать, чтобы убить клетки, и только после этого мыть. Допускается заливать дезинфицирующим раствором поверхность плотных сред. Через сутки среды можно выбрасывать и посуду мыть. Неаккуратное обращение с культурами микроорганизмов приводит к возникновению бактериального аэрозоля. Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов. Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость. В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, такой способ культивирования называют поверхностным. При твердофазном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ (чаще всего основу такой среды составляют пшеничные отруби). При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания. Последний способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве большинства препаратов по следующим причинам: 1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд см3, а с применением принудительной аэрации урожайность, в зависимости от состава питательной среды, достигает 50 - 60 млрд см3. Это объясняется тем, что при аэрации практически отсутствует начальная стационарная фаза, и бактерии сразу начинают интенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу. 2. Процесс легко управляем. При глубинном выращивании имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азотистых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культуральной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не прекращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов. Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов усиливает интенсивность размножения, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов в момент съема их биомассы. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования, что очень важно для достижения максимальной интенсивности размножения. 3. Максимальная технологичность. Так, поверхностный метод менее технологичен и в промышленных условиях применяется в исключительных случаях, когда нельзя воспользоваться глубинным методом. Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах (ферментерах) так же как и при использовании плотных питательных сред, складывается из следующих этапов: 1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними. 2. Приготовление посевной микробной культуры. 3. Приготовление и стерилизация питательных сред. 4. Подготовка биореактора к посеву. 5. Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над процессом культивирования. Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций: > стерилизацию оборудования и коммуникаций; > приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др. Остановимся на каждом из этапов культивирования. 5.2 Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними Эталонные, или референтные, штаммы хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНКЙ ветеринарных препаратов. Эти штаммы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины. При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины - из аттенуированных (ослабленных), авирулентных штаммов. Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфологическими, специфическими и биологическими свойствами. Основными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства. Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроки после введения им микроорганизмов. Иммуногенньхе свойства штаммов определяются по устойчивости привитых животных к заражению возбудителем болезни определенной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражают 50%-ной дозой иммуногенности или по нарастанию титра антител в сыворотке крови. При этом 80% привитых животных должны быть невосприимчивы к инфекции, против которой их вакцинировали. Безвредность (реактогенность) эталонного, производственного штамма проверяют по выраженности реакции у лабораторных и естественно-восприимчивых животных на 5-10-кратное увеличение прививочной дозы. Производственные, эталонные штаммы, должны сохранять генетическую стабильных антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пересевов как invivo, так и invitro. 5.3 Приготовление посевной микробной культуры Обычно производственное культивирование микроорганизмов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости, например во флаконы емкостью 100-200 см3, заполненные по 50-150 мл производственной средой. Затем из флаконов делают высевы в большие емкости - бутыли объемом 18-20 литров. При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вносят в реактор и называют посевной (матрацной, матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроорганизмов, исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10 % по объему. Посевные микробные культуры также контролируются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ). 5.4 Приготовление и стерилизация питательных сред Одним из этапов получения биопрепаратов является культивирование микроорганизмов, которое невозможно без достаточного количества разнообразных стандартных, эффективных и недорогих питательных сред (ПС). В этой связи представляется целесообразным рассмотреть основные принципы, лежащие в основе конструирования ПС, к которым относятся: удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов; - выбор сырьевых источников для конструирования ПС; - дифференциация ПС по целевому назначению; - оптимизация ПС; - стандартизация ПС. Удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов Основополагающим принципом конструирования ПС является полноценность, т.е. состав среды должен удовлетворять питательным потребностям культивируемых микроорганизмов. В процессе роста микроорганизмы потребляют из окружающей их питательной среды целый ряд разнообразных химических веществ, составляющих основу энергетического и конструктивного обмена в клетках. Поступление питательных веществ в цитоплазму может осуществляться через всю поверхность клетки и связано с их диффузией, а также с действием специальных транспортных систем. Причем необходимые для роста и жизнедеятельности клетки элементы должны находиться в определенной, легкоусваиваемой форме. К основным компонентам, формирующим клеточное вещество, относятся: углерод, азот, кислород и водород. Содержание этих элементов в различных микроорганизмах практически постоянно. Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны, следовательно, и очень индивидуальны их потребности в источниках питания. Отсюда ясно, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов и клеток не существует. Разнообразие микроорганизмов проявляется, прежде всего, в отношении к источникам углерода и азота. Эти элементы представлены в средах различными веществами, и именно они определяют специфичность сред. В зависимости от формы, в которой микроорганизмы используют необходимые им питательные вещества, их подразделяют на две большие группы: 1. Автотрофы — микроорганизмы, которые могут синтезировать вещества своей протоплазмы из простых неорганических соединений. Например, они ассимилируют углерод из углекислоты воздуха, азот из аммиака. 2. Гетеротрофы - микроорганизмы, для которых источником углерода и азота служат органические вещества. Они усваивают органические углеродсодержащие соединения: углеводы, органические кислоты, спирты и углеводороды. Наиболее доступные из источников углеродного питанияуглеводы, такие как глюкоза, сахароза или мальтоза. В зависимости от типов используемых азотистых соединений микроорганизмы разделяют на две группы: 1. Протеолитические, расщепляющие высокомолекулярные белковые вещества и пептиды; 2. Дезаминирующие, требующие присутствия в среде готовых аминокислот, расщепление которых сопровождается выделением аммиака. Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во многих природных аминокислотах, которые являются универсальными компонентами питания. Они целиком включаются в структуру клетки. Из всех незаменимых аминокислот ключевая роль принадлежит глутамину, а также аргинину, который имеет принципиальное значение для обезвреживания токсичных метаболитов незаменимых аминокислот и аммиака. Неорганические соли, входящие в состав ПС, удовлетворяют потребности микроорганизмов в ионах К+, Mg2+, Мп2+ , Fe2+ или Fe3+, Р043-, S042-. Они же определяют необходимое осмотическое давление среды, величину рН и буферную емкость. В ПС необходимо также наличие некоторых других ионов, в частности, Zn2+ Cu2+ , Co2+ ,Ca2+, СL- и др. Обычно они присутствуют в достаточном количестве в виде примесей в питательных основах, минеральных компонентах среды или содержатся в водопроводной воде, используемой для приготовления ПС. Функция необходимых микроорганизмам и клеткам ионов металлов заключается в том, что они служат активаторами и кофакторамимногих ферментов, кроме того, участвуют в регуляции синтеза белка, являются компонентами белковых комплексов. Считается также, что в ПС должны присутствовать факторы роста, различные по химической природе соединения, главным образом, органические вещества (витамины, аминокислоты, жирные кислоты, пуриновые и пиримидиновые основания), добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микроорганизмов. К факторам роста относят витамины группы В, гемин (фактор X), путресцин, олеиновую кислоту, козимазу (фактор Y) и ее ферменты, пуриновые основания (аденин, гуанин, ксантин, гипоксантин) и пиримидиновые (цитозин, тиамин, урацил), гормоны и др. Функции факторов роста разнообразны. Они участвуют в процессах обмена веществ. Отсутствие или недостаток их в среде приводит к бактериостатическому эффекту. Выбор сырьевых источников для конструирования питательных сред Другим наиболее важным принципом конструирования ПС является выбор сырьевых источников. Качество ПС во многом определяется полноценностью состава питательных субстратов и исходного сырья, используемого для их приготовления. Большое разнообразие видов сырьевых источников ставит сложную задачу выбора наиболее перспективных, пригодных для конструирования ПС требуемого качества. Определяющую роль в данном вопросе играют, прежде всего, биохимические показатели состава сырья, от которых зависит выбор способа и режимов его переработки с целью наиболее полного и эффективного использования содержащихся в нем питательных веществ. Для получения ПС с особо ценными свойствами применяют прежде всего традиционные источники белка животного происхождения, а именно мясо крупного рогатого скота (КРС), казеин, рыбу и продукты ее переработки. Наиболее полно разработаны и широко применяются ПС на основе мяса КРС. Учитывая дефицит кильки каспийской, широко применяемой в недалеком прошлом, для получения рыбных питательных основ стала использоваться более дешевая и доступная непищевая продукция рыбной промышленности сухой криль, отходы переработки мяса криля, филетированный минтай и его перезрелую икру. Наибольшее же распространение получила рыбная кормовая мука (РКМ), удовлетворяющая требованиям биологической ценности, доступности и относительной стандартности. Довольно широкое распространение получили ПС на основе казеина, который содержит все компоненты, имеющиеся в молоке: жир, лактозу, витамины, ферменты и соли. Однако необходимо отметить, что в связи с удорожанием продуктов переработки молока, а также повышением спроса на казеин на мировом рынке, применение его носит несколько ограниченный характер. Из непищевых источников белка животного происхождения в качестве сырья для конструирования полноценных ПС необходимо выделить кровь убойных животных, которая богата биологически активными веществами и микроэлементами и, кроме того, содержит продукты клеточного и тканевого обмена. Гидролизаты крови сельскохозяйственных животных используются в качестве заменителей пептона в дифференциально-диагностических питательных средах. К другим видам белоксодержащего сырья животного происхождения, которые могут быть использованы для конструирования ПС, относятся: плацента и селезенка КРС, сухой белковый концентрат - продукт переработки мясных отходов, спилковаяобрезь, получаемая при обработке кожи, эмбрионы домашних птиц - отход вакцинного производства, кровезаменители с истекшим сроком годности, творожная сыворотка, мягкие ткани моллюсков и ластоногих. Перспективно использование тушек пушных зверей из зверо-хозяйств, крови КРС, получаемой на мясокомбинате, обезжиренного молока и молочной сыворотки (отходы маслозаводов). В целом же ПС, приготовленные из сырья животного происхождения, имеют высокое содержание основных питательных компонентов, являются полноценными и сбалансированными по аминокислотному составу и достаточно хорошо изучены. Из продуктов растительного происхождения в качестве белкового субстрата для ПС возможно использование кукурузы, сои, гороха, картофеля, люпина и др. Однако, растительное сельскохозяйственное сырье содержит белок, несбалансированный состав которого зависит от условий выращивания культур, а также липиды в больших количествах, чем продукты животного происхождения. Обширную группу составляют ПС, изготавливаемые из белкового сырья микробного происхождения (дрожжи, бактерии и т.д.). Аминокислотный состав микроорганизмов, служащих субстратом для приготовления ПС, хорошо изучен, а биомасса используемых микроорганизмов является полноценной по составу питательных веществ и характеризуется повышенным содержанием лизина и треонина. Разработан целый ряд ПС комбинированного состава из белковых субстратов различного происхождения. К ним относятся дрожжевая казеиновая питательная среда, дрожжевая мясная и т.д. Основой большинства известных ПС являются гидролизаты казеина, мяса КРС и рыбы (до 80%). Удельный же вес непищевого сырья в технологии конструирования ПС составляет всего 15% и в дальнейшем требует увеличения. Используемое для получения питательной основы (ПС) непищевое сырье должно удовлетворять определенным требованиям, а именно быть: ^ полноценным (количественный и качественный состав сырья должен, в основном, удовлетворять питательным потребностям микроорганизмов и клеток, для которых разрабатываются ПС); ^доступным (иметь достаточно обширную сырьевую базу); ^ технологичным (затраты на внедрение в производство должны осуществляться с использованием имеющегося оборудования или существующей технологии); ^экономичным (затраты на внедрение технологии при переходе на новое сырье и его переработку не должны превосходить нормы затрат для получения целевого продукта); ^стандартным (иметь длительные сроки хранения без изменения физико-химических свойств и питательной ценности). Дифференциация питательных сред по целевому назначению Прежде чем приступить к разработке ПС, необходимо решить вопрос о предназначении будущей среды. Следовательно, дифференциация ПС по целевому назначению также является одним из основных принципов их конструирования. В соответствии с этим принципом среды подразделяют: • на микробиологические (предназначенные для культивирования бактерий, дрожжей, грибов); • среды для культур клеток, часть из которых относят также к вирусологическим средам. По физическому состоянию ПС классифицируются на: > жидкие > жидкие концентрированные > полужидкие > твердые (плотные) > сухие. Жидкие среды лучше обогащать кислородом, в них легче изучить влияние на культуру различных факторов, определить бактериальную массу, образование веществ и побочных продуктов. Жидкие среды используют для проведения более точных исследований, их составом проще варьировать. Полужидкие среды получают путем добавления к жидким концентрирующих примесей, например 0,5% агара, и используют, в частности, для культивирования анаэробных микроорганизмов или при диагностике вирусов в чувствительных тканевых культурах. Для культивирования клеток широко применяются жидкие концентрированные среды, выпускаемые фирмами в виде 10-, 50- и 100-кратных концентратов. К плотным ПС обычно относят агаризованные среды, но в качестве уплотняющих веществ могут использоваться желатина, силикагель, карбоксилметилцеллюлоза и другие. К ним можно отнести свернутую сыворотку, свернутый яичный белок, картофель, ломтики моркови, зерна, пшено, рис и отруби. Плотные ПС, в отличие от жидких, более удобны в транспортировке. На них легче проводить микроскопическое изучение культур, легче выявить заражение посторонней микрофлорой и выделить чистую культуру из отдельных колоний. Кроме того, для хранения микроорганизмов, как правило, применяются именно плотные ПС. Однако, поскольку плотные среды получают, главным образом, включением в их состав агара, то вместе с ним могут быть внесены в качестве примесей различные катионы, питательные вещества и ростовые факторы в количестве, достаточном для проявления роста некоторых нежелательных культур. Очень удобны в работе и перспективны в использовании сухие ПС. Они стандартны, хорошо хранятся и транспортируются, быстро растворяются в воде при комнатной температуре. Их широко используют для получения диагностических ПС. Дифференциация ПС проводится также по сложности. По этому признаку среда подразделяются на: < простые, или обычные (пептонная вода, мясопептонный бульон, мясо-пептонныйагар, питательная желатина и др.); их иногда называют универсальными; <сложные, политропные, или специальные (кровяной агар, асцитический агар и бульон, мясо-пептонный сахарный бульон, сывороточный агар и бульон, свернутая сыворотка, кровяной бульон). По происхождению и природе составных элементов среды подразделяются на: > естественные (натуральные, комплексные); > полусинтетические; > синтетические. Натуральные ПС - это природные, комплексные органические среды неизвестного или неопределенного состава, которые включают продукты животного или растительного происхождения.К ним относятся пептоны, кровь, отвары и экстракты, полученные из природных субстратов (мясо, рыба, навоз, почва, крупы), овощные или фруктовые соки, сусло, молоко, ткани и сыворотка животных, картофель, соевые бобы и др. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, т.к. в них имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития. Но они имеют сложный непостоянный химический состав, т.е. нестандартны, что является их очевидным недостатком. И поэтому мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, т.к. не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и образование продуктов обмена по ходу развития. Полусинтетические среды, кроме органических и неорганических веществ известного состава, содержат в незначительных количествах продукты природного происхождения. Эти ПС также отличаются нестандартностью (хотя и более стандартны, чем натуральные). Примером могут быть: картофельная среда с глюкозой, состав которой зависит от сорта и возраста картофеля; дрожжевая среда; мясопептонный бульон и др. Синтетические ПС готовят из точно определённых количеств органических и неорганических химических соединений известного состава и воды. Преимущество синтетических сред — постоянный состав и воспроизводимость. Однако, как правило, в них требуется вносить различные добавки, в частности факторы роста. Следует отметить, что среды, содержащие агар, нельзя рассматривать как синтетические из-за сложности и недостаточной определённости состава агара. Возможность менять состав среды в нужном направлении делает синтетические среды весьма пригодными для систематического изучения физиологии микроорганизмов путем широкого синтеза питательных веществ из определённых составных частей. Отдельные штаммы одного и того же вида бактерий поразному относятся к различным химическим соединениям, и в связи с этим он получил практическое приложение в вопросах дифференциации отдельных штаммов внутри групп. По набору питательных веществ выделяют: • минимальные среды, которые содержат лишь источники питания, достаточные для роста; • богатые среды, в состав которых входят многие дополнительные вещества. В зависимости от назначения ПС различают: • дифференциально-диагностические • элективные • селективные • ингибиторные • среды для поддержания культуры • накопительные (насыщения, обогащения) • консервирующие • контрольные. Дифференциально-диагностические - это сложные среды, на которых микроорганизмы разных видов растут по-разному, в зависимости от биохимических свойств культуры. Они предназначены для идентификации видовой принадлежности микроорганизмов, широко используются в клинической бактериологии и проведении генетических исследований. Селективные, ингибиторные и элективные ПС предназначены для выращивания строго определенного вида микроорганизма. Эти среды служат для выделения бактерий из смешанных популяций и дифференцирования их от сходных видов. В их состав добавляют различные вещества, подавляющие рост одних видов и не влияющие на рост других. Например, для выделения грамотрицательных бактерий рода Brucella из зараженной почвы или навоза применяют питательный агар с добавлением некоторых антибиотиков и кристаллвиолета, которые подавляют большинство патогенных грибов и бактерий, но не влияют на рост бруцелл. В больших концентрациях хлорид натрия подавляет рост многих бактерий, но хорошо переносится стафилококками. Для достижения избирательности употребляют также азид, цитрат, теллурит, лаурилсульфат и селенит натрия, йод и фенилэтанол. Для этих же целей используют натуральную желчь, очищенные желчные соли и их заменители. Среду можно сделать селективной за счет величины рН. Примерами является среда Сабуро для культивирования дрожжей с низким рН, а также среды с рН от 8 до 9 для выделения холерного вибриона. В последнее время в качестве веществ, придающих средам селективный характер, применяют антимикробные агенты, такие как антибиотики и другие химиотерапевтические вещества. Элективные ПС нашли широкое применение при выделении возбудителей кишечных инфекций. При добавлении малахитовой или бриллиантовой зелени, солей желчных кислот (в частности, таурохолево-кислого натрия), значительного количества хлорида натрия или лимоннокислых солей подавляется рост кишечной палочки, но рост патогенных бактерий кишечной группы не ухудшается. Некоторые элективные среды готовят с добавлением антибиотиков. Среды для поддержания культуры составляют так, чтобы в них не было селективных веществ, способных вызывать изменчивость культур. Накопительные ПС (обогащения, насыщения) — это среды, на которых определенные виды культур или группы культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих. При культивировании на этих средах обычно не применяются ингибиторные вещества, а, наоборот, создают благоприятные условия для определенного присутствующего в смеси вида. Основой сред накопления являются желчь и ее соли, тетратионат натрия, различные красители, селенитовые соли, антибиотики и др. Консервирующие среды служат для первичного посева и транспортировки исследуемого материала. Выделяют также контрольные ПС, которые применяют для контроля стерильности и общей бактериальной обсемененности антибиотиков. По масштабам использования ПС подразделяются на: > производственные (технологические); > среды для научных исследований с ограниченным по объему применением. Производственные ПС должны быть доступными, экономичными, удобными в приготовлении и использовании для крупномасштабного культивирования. Среды для научных исследований, как правило, бывают синтетическими и богатыми по набору питательных веществ. Прописи применяемых в настоящее время ПС очень многообразны. Особенно вариабельны по составу, как наиболее многокомпонентные системы, прописи для клеточных культур, которые могут включать более шестидесяти компонентов. Оптимизация многокомпонентного состава питательной среды Несмотря на наличие большого количества работ, посвященных вопросам питания микроорганизмов, не всегда с достоверной точностью удается определить количественные и качественные характеристики необходимых для развития и метаболизма клеток питательных веществ. Поэтому при конструировании новых ПС необходимо проведение широких исследований по выбору ПС и оптимизации качественных и количественных компонентов среды с целью получения наиболее желаемого результата при ее использовании. Культивирование микроорганизмов неразрывно связано с целесообразностью выявления оптимальных условий ведения процесса. При этом приходится иметь дело с задачами определения оптимальных параметров процесса в зависимости от выбранного критерия оптимизации. Их решение связано с необходимостью максимизации продуктивности процесса по бактериальной массе и минимизации затрат. Процессы культивирования микроорганизмов можно оптимизировать методами, которые разделяются на две группы. К первой группе относятся методы оптимизации по экспериментальным данным. Они не требуют привлечения сложных математических расчетов, но связаны со значительными затратами времени, возникающими из-за необходимости проведения большого количества экспериментальных исследований. Ко второй группе относятся методы с применением математических моделей. В свою очередь последние подразделяются на две отличающиеся по сложности исполнения и точности описания реального процесса подгруппы. К первой следует отнести методы, основанные на построении математической зависимости (уравнения регрессии) протекания ограниченных процессов с использованием традиционного метода планирования эксперимента Бокса-Уилсона. Он позволяет строить поисковые модели, когда исследователь, не располагая сведениями о механизме соблюдаемого явления, имеет лишь информацию о реакции системы на возмущение. Ко второй подгруппе относятся методы, основанные на построении моделей, базисом которых являются законы, описывающие протекание фундаментальных процессов микробиологии (например, процесс размножения и отмирания микроорганизмов). В этом случае принимается за основу положение, что комплекс всех изменений, происходящих в культуральной жидкости (изменение содержания компонентов ПС, образование и расходование промежуточных продуктов биосинтеза, выделение метаболитов и катаболитов, трансформация органических соединений) - это следствие процессов самовоспроизведения, а также результат реакций, связанных с адаптацией и саморегуляцией микробной популяции. Оптимизация процессов микробиологического синтеза, основанная на использовании методов второй подгруппы, является наиболее глубокой и точной, хотя и более трудоемка и длинна, т.к. требует основательного изучения законов протекания элементарного акта на лабораторном уровне с целью последующего создания математической модели в форме кинетических уравнений. На основе этой модели идет дальнейшая балансировка состава ПС, а также поиск оптимума основных режимов ведения процесса. Задача оптимизации управляемого периодического процесса культивирования по максимизации бактериальной массы или целевого продукта в общем виде выглядит следующим образом: определяется наиболее рациональный состав исходной ПС, а затем профили изменения основных технологических параметров, обеспечивающих значение выбранного критерия эффективности при заданных ограничениях. Важнейшим элементом оптимизации технологического процесса является выбор критерия эффективности. В качестве критериев используют такие показатели, как концентрация живых микробных клеток, съем целевого продукта с единицы объема среды и т.д. Обычно оптимизация процесса культивирования начинается с выбора ПС, обеспечивающей питательные потребности популяции микробов или синтез максимального количества продуктов метаболизма. Количество компонентов, входящих в ПС для выращивания микроорганизмов, может превышать десяток элементов. Биологической роли каждого элемента, влияющего в целом ряде случаев в микродозах на активность метаболических превращений в клетке, посвящено большое число исследований. Сложность выбора определяется еще и тем, что на рост микроорганизмов влияет также взаимное соотношение компонентов. Большое количество и взаимосвязь составляющих ПС ингредиентов обуславливает выбор методов экспериментального исследования. Обычно используемые методы однофакторного планирования в этих условиях малоэффективны. Использование же математических методов многофакторного планирования экспериментов позволяет установить необходимые концентрации компонентов питания с учетом их совместного влияния на скорость роста, качество биомассы и количество целевого продукта. Высоко объективным является и метод балансировки состава ПС, в основу которого заложено использование уравнения ассимиляции микробной популяции, где учитываются такие показатели: > концентрация потребляемого субстрата; > время потребления; > концентрация биомассы; > коэффициент метаболизма; > константы скорости образования и отмирания микроорганизмов; > концентрация субстрата в начальный момент культивирования. Обычно при периодическом процессе культивирования большинство важных параметров, в том числе и концентрация питательных веществ в культуральной жидкости, изменяется в течение времени. Вместе с тем, профили их изменения не всегда близки к оптимальным. Поэтому при подборе ПС для периодического культивирования возникает противоречие между необходимостью внесения в нее достаточно большого количества субстратов и ингибирующим влиянием высоких концентраций одного или нескольких элементов питания на рост микробной клетки и(или) биосинтез целевого продукта. Снижение концентрации таких субстратов в исходной ПС с последующим их добавлением в ферментер, по определенной программе, позволяет исключить ингибирование процесса в начальной фазе роста и в то же время не допустить его лимитирования в последующий период размножения микробов. 5.5Подготовка биореактора к посеву Современные биореакторы изготавливаются из нержавеющей стали и представляют собой довольно сложный аппарат, в который осуществляют закачку соответствующей для культивируемого микроба питательной cреды. Реактор имеет рубашку для нагревания паром и охлаждения водой с соответствующей запорной фурнитурой. Внутри реактора имеется турбинная механическая или электромагнитная мешалка со скоростью 150-200 об/мин и трубка для подачи воздуха. На крышке реактора имеются отверстия для подающей и отводящей трубок, смотровое окно, окно для освещения и отверстие для вставления четырёх сифонов, служащих для внесения посевного материала, взятия проб, внесения пеногасителя, глюкозы и других питательных веществ, а при необходимости и факторов роста. Современные реакторы оснащены различными измерительными приборами. Регулирование температуры осуществляется автоматически. Регистрация её, а также измерения рН осуществляется с помощью электронного потенциометра. При первичной установке реакторов в цехах и при их последующей эксплуатации важной инженерно-технической проблемой является технологическая обвязка биореакторов трубопроводами. К комплексу наиболее важных проблем технологической обвязки относятся: 1. Стерилизация внутренней полости реактора текучим паром. 2. Подача стерильного воздуха во внутреннюю полость реактора при культивировании, либо при удалении готового продукта из неё на последующую обработку. Решение этих проблем позволяет получать более стабильные результаты по стерильности и накоплению микробной массы при реакторном способе культивирования микроорганизмов. 5.6 Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль за процессом культивирования Рассмотрим примеры особенностей культивирования некоторых микроорганизмов с применением: 1. Активной аэрации микробных культур. 2. В покоящемся состоянии без применения механических мешалок (без аэрации). 3. В состоянии анаэробиоза. Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации Процесс осуществляют в реакторах объёмом от 0,01 до 100 м3, как правило, в асептических условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор подают простерилизованную в УНСиохлажденную до 25-35°С питательную среду, вносят посевной материал в количестве 5-10% объёма питательной среды (0,2-0,4 млрд. живых микробных клеток в 1 мл по оптической концентрации), включают систему аэрации и перемешивающее устройство. Так, например, для листерий и сальмонелл скорость вращения механической мешалки составляет 150-180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до 37°С очищенным, стерильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора обычно 0,5-0,8. Превышение этой величины может привести к значительному уносу пены с отходящим воздухом и нарушению асептических условий. Температуру культивирования поддерживают путём подачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппарата. Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С. Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культивирования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, кислоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов. Процесс культивирования контролируют по показателям приборов - изменение температуры, рН, расход воздуха, частота вращения мешалки, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса). В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта метаболизма, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микрофлоры. Периодическое культивирование микроорганизмов В периодическом состоянии динамика роста и размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм и других про- и эукариот. При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого в свою очередь условиями разнообразных факторов среды, в которой развиваются популяция того или иного организма. Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количественные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде. В простой гомогенной периодической культуре микроорганизмов выделяют от 4 до 8, и даже до 16 фаз. 1. Исходная фаза (лаг-фаза или индукционный период) является фазой задержки роста, когда размножения микробных клеток не происходит. Эта фаза характеризуется отсутствием роста клеток. В этот период посевная культура приспосабливается к изменившимся внешним условиям и вырабатывает ферменты, необходимые для роста на данной питательной среде. В лаг-фазе в клетках культуры происходят значительные качественные изменения: возрастет количество нуклеиновых кислот, в первую очередь РНК, активизируются одни ферменты и синтезируются другие. Продолжительность лаг-фазы зависит от следующих факторов: - от состава питательной среды - если питательная среда по составу мало отличается от среды, на которой росла посевная культура, лаг-фаза может практически отсутствовать; - от качества посевного материала ~ количества в нем жизнеспособных клеток, их возраста, способа хранения; - от посевной дозы. 2. Период положительного ускорения роста. Длительность этого периода для большинства микроорганизмов составляет 2 часа, и она зависит от температуры, состава питательной среды, качества посевного материала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число клеток остаётся постоянным из-за отсутствия в этот период клеточного деления. Общее состояние микробных клеток характеризуется как состояние приспособления к питательной среде. В этот период усиливается синтез веществ, клеток, они увеличиваются в размере, в них образуется большое количество индуцибельных ферментов. 3. Фаза логарифмического (лог-фаза) или экспоненциального (показательного) роста. Она характеризуется постоянной и максимальной скоростью роста клеток. Рост микробов в эту фазу происходит в геометрической прогрессии. Продолжительность этой фазы зависит: - от запаса питательных веществ в среде; - от условий аэрации; - от перемешивания и др. факторов. Для описания процессов роста микроорганизмов используют такие характеристики, как общая и удельная скорости роста биомассы (или числа клеток). Другой важной характеристикой роста культуры является время генерации, за которое биомасса культуры удваивается. Время генерации из разных культур микроорганизмов сильно различается. Наиболее быстрорастущие бактерии при благоприятных условиях генерации имеют период генерации - 20-25 мин. Продолжительность генерации в лог-фазе у разных микроорганизмов не одинакова. Так, для сальмонелл она равна 20-30 мин., для стрептококков и стафилококков - 25-35 мин., для эшерихий - 15-17 мин. На продолжительность генераций влияют температура, рН среды, состав среды и т. д. Высокая скорость развития микроорганизмов сохраняется на всей экспоненциальной стадии. Однако эта зависимость наблюдается в течение ограниченного времени. По мере роста культуры в среде постепенно потребляются питательные вещества, накапливаются продукты обмена, затрудняется транспорт питательных веществ (в первую очередь кислорода) и метаболитов вследствие увеличения плотности популяции. 4. Фаза отрицательного ускорения. В эту фазу скорость размножения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление микробной массы в единице объёма. 5. Стационарная фаза роста, или максимума, на протяжении которой численность микробной популяции не уменьшается. В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в эту фазу достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе сама биомасса микроорганизмов и продукты их биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической ценностью. 6. Фаза отмирания микробной популяции. Любая микробная популяция, растущая в сосуде с несменяемой средой, вступает после фазы стационарного роста в стадию отмирания. По скорости отмирания вначале устанавливают фазу ускоренного отмирания (VI), затем фазу постоянной скорости отмирания (VII) и фазу замедленной скорости отмирания (VIII). Причинами отмирания микробной популяции являются истощение среды и накопление в ней большого количества токсических продуктов метаболизма. В период стадии отмирания общее количество биомассы уменьшается, что чаще всего происходит за счет аутолиза. Продолжительность стадии отмирания у различных микроорганизмов не одинакова: у пневмококка она составляет 2-3 суток, у эшерихий — несколько месяцев. В этот период в культуре находят значительное уменьшение клеток. У них уменьшается биохимическая и антигенная активность. Учитывая это для изготовления ряда биопрепаратов отбирают культуры микроорганизмов чаще всего в фазе отрицательного ускорения роста, или в начале стационарной фазы роста, когда концентрация живых микробных клеток приближается или равна М-концентрации. 5.7 Хемостатная культура, или метод непрерывного культивирования микроорганизмов Хемостатная, или непрерывная, культура представляет собой прочную культуру тех или иных микроорганизмов. В таком случае возможность продления жизни микробной популяции поддерживается с помощью непрерывной подачи свежей среды и постоянного отбора микробной биомассы или образовавшихся продуктов метаболизма, т.е. можно культуру микроорганизма как бы зафиксировать в одной, например стационарной, фазе роста и получать нужные продукты обмена или биомассу во времени столько, сколько требуется. Таким образом, максимальная производительность в хемостатной культуре всегда выше, чем максимальная производительность в периодической культуре. Нужно сказать, что до 50-х годов для культивирования микроорганизмов с целью их всестороннего изучения служила простая периодическая культура. Только с переходом к методу хемостатного культивирования обнаружился недостаток периодической культуры, которая не даёт полного представления обо всех изменениях, происходящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на протекающие в ней процессы. Развитие хемостатного культивирования открыло возможность управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганизмов, а при необходимости вмешиваться в этот процесс, изменяя скорость роста до задаваемых пределов путём воздействия на такую культуру внешними факторами. В настоящее время интерес к непрерывному культивированию растёт как в нашей стране, так и за рубежом. Однако, несмотря на преимущества хемостатных культур, в биологической промышленности при производстве вакцин они не получили ещё достаточного применения по следующим причинам: 1. Технические трудности, в первую очередь связанные с созданием асептических условий. 2. Не во всех случаях непрерывный процесс предпочтительнее периодического, поскольку при низкой удельной скорости роста биомассы периодический процесс по эффективности не уступает непрерывному и более выгоден, т. к. его проще осуществить. 3. Интенсивный биосинтез многих продуктов метаболизма происходит при медленном росте биомассы, поэтому в периодических процессах концентрация целевого продукта в культуральной жидкости обычно выше, чем внепрерывных, что существенно повышает эффективность стадий выделения и очистки продукта. Всё это свидетельствует о том, что периодические процессы в будущем будут применяться. Вопросы для самоконтроля 1 Дайте общее представление о культивировании микроорганизмов. 2 Каково отношение микроорганизмов к молекулярному кислороду? 2 Перечислите способы культивирования аэробных микроорганизмов. 3 Перечислите способы культивирования анаэробных микроорганизмов.