Генетические основы микробиологии

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ Микроорганизмы – это удивительно совершенные творения природы. Точно регулируемый метаболизм микробной клетки позволяет ей расти и размножаться с огромной скоростью в совершенно различных, часто экстремальных условиях окружающей среды. Вся жизнедеятельность, все механизмы микроорганизмов запрограммированы на безостановочный рост и деление до тех пор, пока окружающая среда дает хотя бы минимальные для этого условия. Если сравнить клетку с машиной, то это очень совершенная машина, имеющая коэффициент полезного действия до 70% (превращение углерода субстрата в углерод клеточной биомассы). Генетический аппарат прокариот Слайд 1. Вся информация о признаках, присущих организму, сосредоточена в его генетическом аппарате. Он обеспечивает сохранение и воспроизведение этих признаков в процессе размножения организмов, так как дочерние особи обнаруживают в большинстве случаев полное сходство с родительскими особями. Генетический аппарат обладает высокой стабильностью и точностью механизмов, обеспечивающих его функционирование. Однако стабильность генетического аппарата не абсолютна, так как это исключало бы всякую возможность его изменений и эволюционных преобразований. Таким образом, генетический аппарат должен быть организован так, чтобы, чтобы, с одной стороны, обеспечивать свою стабильность, с другой – быть достаточно пластичным, т.е. обладать способностью к изменчивости. У прокариот весь генетический материал локализован в одной хромосоме. В определенных условиях (интенсивное деление в логарифмической фазе роста) в клетках бактерий может содержаться по несколько копий хромосомы. Хромосомы – нуклеопротеиды (нуклеиновые кислоты и белки), они являются носителями генов, определяющих наследственные свойства организма. Основной структурой, хранящей информацию и передающей ее по наследству, является ДНК. Лишь у некоторых вирусов эту роль выполняет РНК. Единственная хромосома прокариот фактически является макромолекулой ДНК, организованной в замкнутую структуру – нуклеоид. Ген – это фрагмент молекулы ДНК, контролирующий синтез одного белка или пептида. В генах записана генетическая информация относительно всех признаков, присущих клетке. Гены в хромосоме располагаются в линейном порядке. Общая сумма генов, которыми обладает клетка, называется генотипом. Генотип сохраняет относительное постоянство в любых условиях. Что и дает возможность различать виды 2 микроорганизмов между собой. Хромосомы (нуклеоид) относятся к ядерным генетическим элементам клетки. Наряду с хромосомой генетический материал у бактерий может содержаться в нехромосомных (неядерных) генетических элементах – плазмидах, находящихся или в цитоплазме клетки или в интегрированном с хромосомой состоянии. В свободном состоянии плазмиды – это кольцевые молекулы ДНК, которые стабильно передаются потомству бактериальных клеток независимо от хромосомной ДНК. Особенностью генетической информации, содержащейся в неядерных генетических элементах, является ее необязательность для жизнедеятельности бактерий, т.е. в ее отсутствие бактериальные клетки жизнеспособны. Важная роль нехромосомных генетических элементов заключается в том. Что они расширяют возможности существования вида, обеспечивают обмен генетическим материалом по горизонтали (между клетками), и играют определенную роль в эволюции прокариот. Количество плазмидной ДНК составляет обычно не более нескольких процентов от хромосомной ДНК, а число плазмид колеблется от 1 до 38. Плазмидная ДНК содержит гены, кодирующие лекарственную устойчивость, синтез антибиотиков, способность использовать некоторые сахара. Таким образом, плазмиды делают возможным существование бактерий в более широком диапазоне условий внешней среды, т.е. действуют как фактор адаптации. Наследственность и изменчивость микроорганизмов Слайд 2. Генетический аппарат микробной клетки позволяет передавать видовые признаки от родительской особи к потомкам. Сохранение определенных специфических свойств организма на протяжении ряда поколений называется наследственностью. Однако у каждого последующего поколения имеются какие-то признаки, отличающие его от предыдущего – это изменчивость. Таким образом, изменчивость микроорганизмов - способность клеток изменять видовые признаки и свойства. Признак (свойство) в генетике называют словом фен, а их сочетание в определенной среде обитания – фенотипом. Следовательно, изменчивость – это способность изменять фенотип. При одной и той же наследственной конструкции (генотипе) микроорганизм может иметь несколько фенотипов, что зависит от характера питания, аэрации, температуры и других условий культивирования. Смена фенотипов при изменении условий существования может происходить без участия генотипа или же являться следствием его повреждения. Изменчивость, при которой смена фенотипов микробов происходит без изменения генотипа, называют ненаследственной, фенатипической изменчивостью, или модификацией. Эта форма 3 изменчивости рано или поздно утрачивается и микроб вновь приобретает фенотип исходной культуры. Изменчивость, при которой смена фенотипа микроорганизма связана с предшествующим структурным изменением в генотипе, называется наследственной, или генотипической. Эта форма изменчивости передается по наследству и сравнительно редко возвращается к исходному фенотипу. Слайд 3. Наиболее известные формы изменчивости представлены на рисунке. Модификации не сопровождаются изменениями в геноме и быстро утрачиваются. Модификации зависят от условий среды и подразделяются на: - морфологические, при которых изменяются форма, размеры клеток, способность образовывать капсулы и споры. - культуральные – связаны со способностью образовывать пигмент (чудесная палочка), ненаследуемым изменением типа колоний на плотных питательных средах. - физиологические и биохимические, при которых изменяются соответствующие свойства микроорганизмов. Характерный пример – образование бактериями адаптивных ферментов только в присутствии определенного вещества (субстрата). Другой пример – снижение вирулентных свойств бактерий при пересевах на искусственных питательных средах. Достаточно такую культуру провести через организм чувствительного животного, чтобы полностью восстановить её вирулентные свойства. При генотипической изменчивости обязательно происходит изменение генов в хромосоме, передающееся по наследству. Генотипическая изменчивость может возникать в результате мутаций и генетических рекомбинаций. В широком смысле мутацию можно определить как внезапно возникающее наследуемое изменение в генетическом аппарате клетки. С точки зрения генетики мутации – это изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, проявляющиеся наследственно закрепленной утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков. В их основе лежат ошибки копирования наследственной информации. Фенотипическим проявлением мутаций могут быть изменения морфологии бактериальной клетки, чувствительности к температуре, потребности в факторах роста (аминокислотах, витаминах), снижение вирулентности, появление устойчивости к антибиотикам. Мутации у бактерий могут вызывать как утрату функции, так и приобретение новых признаков. Различают мутации цитоплазматические, затрагивающие нехромосомные генетические элементы (плазмиды), и ядерные, или 4 хромосомные, связанные с изменениями в нуклеоиде. Наиболее важные хромосомные перестройки включают: - выпадение участков хромосомы (делеции), - удвоение (дупликация) или умножение (амплификации) числа отдельных генов или групп генов, - вставки участка хромосом в новые места (транспозиции), - обмен участками хромосом (транслокации), - изменение порядка расположения генов на хромосоме (инверсии) Бактерия, имеющая ДНК, отличную от ДНК исходной клетки, называется мутантом. Если возникающая мутация дает преимущество в борьбе за существование, мутанты выживают и имеют многочисленное потомство. Если же мутация не дает преимуществ, то мутант погибает. Слайд 4. По фенотипическому проявлению мутации можно подразделить на морфологические и биохимические. К первым относятся мутации, которые сопровождаются утратой морфологических элементов бактериальной клетки: жгутиков, капсулы, спор, клеточной стенки. Биохимическими считают большинство мутаций, которые проявляются в утрате способности синтезировать ферменты, необходимые для образования первичных или вторичных метаболитов. По фенотипическим последствиям мутации подразделяют на нейтральные, условно летальные и летальные. Нейтральные мутации фенотипически не проявляются какими-либо изменениями признаков. Мутации, приводящие к изменению, но не утрате физиологической активности, называют условно летальные. В зависимости от условий окружающей среды клетки могут сохранять свою жизнеспособность или, наоборот, утрачивать ее. Летальные мутации характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важные для клетки метаболиты (чаще всего ферменты). По протяженности повреждений мутации бывают точечными, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, и протяженными. Хромосомными считают мутации, обусловливающие появление нового признака при изменении двух и более участков хромосомы, и генными, которые обусловлены появлением нового признака при изменении гена. Важной характеристикой мутантов является их способность к реверсии, т.е. обратному мутированию в исходный фенотип. Мутанты, которые появляются в результате реверсии, называются ревертантами. Слайд 5. Мутации возникают в популяции особей всегда, часто без видимых воздействий на популяцию. Такие мутации, причины возникновения которых неизвестны, называют спонтанными, или неконтролируемыми. Они могут обусловливать как благоприятные, так и 5 неблагоприятные генетические изменения. Спонтанные мутации возникают с низкой частотой (10-8). Содержание мутантов в микробной популяции можно резко повысить, если подвергнуть их мутагенезу, т.е. воздействию факторов физической, химической или биологической природы, способных вызывать мутации. Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами, а мутации, вызванные мутагенами, называются индуцированными. К физическим мутагенам относят ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, магнитные поля, температуру. Среди химических веществ наиболее сильными мутагенами являются органические пероксиды, акридиновые красители, этиленамины, алкилирующие соединения, азотная кислота, аналоги азотистых оснований и др. Наибольшей эффективностью отличается нитрозогуанидин и нитрозометилмочевина. К биологическим мутагенам можно отнести фаги, антибиотики, фитонциды. Под влиянием мутагенов частота мутаций возрастает до 100 тыс. раз. Слайд 6. Ко второму типу наследственной изменчивости относятся изменения, возникающие у прокариот в результате рекомбинации генетического материала, при котором происходит взаимодействие между двумя геномами, приводящее к образованию рекомбинаций ДНК и формированию дочернего генома, сочетающего гены обоих родителей. То есть в процессе генетической рекомбинации происходит объединение генов из двух разных клеток. Известны три основных способа, приводящие к рекомбинации генетического материала прокариот: конъюгация, трансформация и трансдукция. При этом из донорской клетки в реципиентную переносится часть генетического материала. При конъюгации происходит перенос генетического материала путем прямого контакта между двумя клетками. При этом между двумя бактериями образуется мостик и генетический материал (обычно плазмидная ДНК) переходит из одной клетки в другую. Трансформация – это передача генетической информации через выделенную из клетки-донора ДНК. Трансформация бактерий может происходить при передаче ДНК из одной клетки в другую при выращивании культуры бактерий на средах, содержащих мёртвые клетки, фильтраты или экстракты других культур (или чистых препаратов ДНК). В этих случаях бактерии приобретают признаки тех микроорганизмов, с которыми они были выращены, а затем передают эти свойства потомству. Однако включить ДНК в генетический аппарат клетки могут только близкородственные микроорганизмы. При трансдукции перенос генов от одной клетки к другой происходит с помощью бактериофага (бактериального вируса). При этом небольшой 6 участок бактериальной хромосомы включается в фаговую частицу. Когда эта частица заражает новую бактерию, она вводит в неё генетический материал предыдущего хозяина (клетки-донора). Таким образом, клеткареципиент становится носителем генетической информации клетки-донора. При генетических рекомбинациях молекула ДНК не разрушается, а лишь модифицируется, поэтому перестройка генетических структур в отличие от мутаций не вызывает летальных эффектов, а фенотипическое выражение нового признака обнаруживается сразу же после интеграции экзогенной ДНК. Частота рекомбинаций различна (10-1 – 10-9) и зависит от эффективности передачи ДНК. Методы генетического конструирования микроорганизмов Слайд 7. Генетическое конструирование – это совокупность приемов, с помощью которых сознательно изменяют генетическую программу микроорганизмов. Это делается для того, чтобы направить биосинтетический потенциал клетки на производства необходимого продукта. Вопросами совершенствования микроорганизмов занимаются микробиологи – селекционеры. Стратегия селекционной работы заключается в поиске пригодных форм, обладающих полезными для человека свойствами, и в последующем их улучшении, создании на их основе промышленных штаммов. Генетическое конструирование осуществляется двумя способами: 1. Получение мутантов и генетических рекомбинантов; 2. Применение методов генной инженерии, которая предполагает манипуляции на выделенной из организмов ДНК. Выделение мутантов Получение спонтанных и индуцированных мутантов было рассмотрено ранее. Одной из основных задач генетико-селекционной работы является выделение из многочисленной популяции микроорганизмов клонов, обладающих наиболее выраженными полезными свойствами. Методы селекционного выделения разрабатываются на основе всестороннего анализа возможных последствий интересующей мутации на клеточный метаболизм и тщательного изучения фенотипа мутанта. Одним из методов селекции является прямой отбор мутантов на искусственных питательных средах, например, бактерий, вырабатывающих рибофлавин (витамин В2). В том случае, когда невозможно провести прямой отбор мутантов, используют метод определения интересующего метаболита в культуральной среде после выращивания в ней мутантных клеток. 7 Широко распространен метод индикаторных сред, который дает возможность различать мутанты по цвету колоний и проводить тестирование разнообразных фенотипов в больших популяциях. Такие среды могут содержать индикатор, выявляющий различия в рН между теми колониями, которые используют или не используют определенные углеводы. Так, на среде с трифенилтетразолием не сбраживающие лактозу колонии приобретают ярко-красный цвет, а колонии, утилизирующие ее, остаются неокрашенными. При тестировании некоторых ферментов в составе сред используются субстраты, распадающиеся при их гидролизе с образованием красителя. Иногда в среду вносят субстраты, изменяющие прозрачность сред, и наблюдают образование вокруг колоний мутантов зоны просветления. В селекционной работе для выделения мутантов можно использовать метод тест-культур. С этой целью применяют штаммы, дающие рост в присутствии метаболита, выделяемого мутантом, а также чувствительные культуры, рост которых подавляется, если мутант продуцирует антибиотик. В этом случаепо зоне роста или зоне подавления роста тест-культуры, можно судить о продуктивности мутанта. В 1952 году для непрямого отбора мутантов был введен метод отпечатков или реплик.Для этого на плотную питательную среду в чашку Петри высевают 50-200 колоний микроорганизмов.Стерильный бархат или фильтровальную бумагу натягивают на металлический или деревянный цилиндр и закрепляют кольцом. Чашки с колониями прикладывают к бархату, на который отпечатываются колонии. Затем к бархату прикладывают чистые чашки с различными средами. После инкубации на них вырастают колонии в том же расположении, что и на исходной чашке. Модификации этого метода широко используются для выделения мутантов с различными питательными потребностями, а также мутантов,чувствительных к различным физическим, химическим и биологическим агентам (температуре, антибиотикам, фагам и т.д.). Непрямой отбор спонтанных мутантов – чрезвычайно трудоемкий метод, т.к. приходится просматривать десятки и сотни тысяч колоний. В связи с этим при отборе мутантов селекционеры используют индуцированный мутагенез с помощью мутагенных факторов. При этом обработанную мутагеном культуру рассевают на плотные питательные среды с таким расчетом, чтобы получить отдельные колонии, а затем исследуют каждый клон на продуктивность. Выделив более продуктивный вариант, процедуру мутагенеза и отбора повторяют, т.е. проводят ступенчатый отбор. Применяя ступенчатый отбор, можно ничего не знать о путях биосинтеза целевого продукта и его регуляции, т.е. селекция на повышение 8 активности штамма ведется на основе оприорного представления, что ч помощью мутаций можно увеличить его продуктивность. Действительно, в процессетмутагенеза и отбора могут быть последовательно получены мутации, ведущие к повышенному синтезу соответствующих продуктов. Именно поэтому ступенчатый отбор дает замечательные результаты в селекции, например, продуцентов антибиотиков, где с его помощью удалось повысить в десятки и сотни раз продуктивность штаммов. Основной недостаток ступенчатого отбора – его колоссальная трудоемкость. Работа по созданию активного штамма этим методом иногда занимает многие годы. Кроме того, в процессе многократного мутагенеза помимо мутаций, повышающих продуктивность, в геноме продуцента накапливаются вредные мутации. Таким образом, на протяжении длительного времени и в наши дни для недостаточно изученных с точки зрения генетики микроорганизмов единственным способом их улучшения является индуцированный мутагенез и ступенчатый отбор лучших вариантов (штаммов). Задача создания высокопродуктивных культур намного упрощается, если экспериментатор имеет достаточно знаний о путях биосинтеза того или иного метаболита и имеется способ генетического обмена у наследуемого микроорганизма. Это позволяет собрать в одном штамме все полезные мутации и ликвидировать все вредные. Данным направлением исследований занимается генная инженерия.