Биотехнологии

Дисциплина «ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» Лектор: доцент, кандидат технических наук Милентьева Ирина Сергеевна Рекомендуемая литература: Основы биотехнологии: учеб. пособие для студ. вузов всех форм обучения / О. В. Кригер, Г. А. Гореликова. - Кемерово : КемТИПП, 2009. - 116 с. Основы биотехнологии: учеб. пособие для студ. вузов, обуч. по спец. "Биология" / Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина. - 3-е изд., стер. - М. : Академия, 2006. - 208 с. Основы современной пищевой биотехнологии: учебное пособие / Г.А. Гореликова ; КемТИПП. - Кемерово : КемТИПП, 2004. - 100 с. Предмет и задачи биотехнологии Биотехнология — дисциплина, изучающая возможности использования живых организмов, их систем или продуктов их жизнедеятельности для решения технологических задач, а также возможности создания живых организмов с необходимыми свойствами методом генной инженерии. Биотехнология – это наука, которая изучает методы получения полезных для человека веществ и продуктов в управляемых условиях, используя микроорганизмы, клетки животных и растений или изолированные из клеток биологические структуры Современная биотехнология – это наука, возникшая на стыке биологических, химических и технических наук генная инженерия микробиология медицина и ветеринария молекулярная биология БИОТЕНОЛОГИЯ биохимия генетика и селекция Физиология растений Объекты биотехнологии: • микроорганизмы (вирусы, бактерии, дрожжи), • растения, • животные, • изолированные из них клетки и субклеточные структуры (органеллы) Методы, применяемые в биотехнологии, определяются двумя уровнями: клеточным и молекулярным На клеточном уровне имеют дело с: - бактериальными клетками (для получения вакцинных препаратов); - актиномицетами (при получении антибиотиков), - микромицетами ( при получении лимонной кислоты), - животными клетками (при изготовлении противовирусных вакцин), - клетками человека (при изготовлении интерферона) и др. На молекулярном уровне имеют дело с молекулами, например, с нуклеиновыми кислотами. Однако в конечной стадии молекулярный уровень трансформируется в клеточный. Основные задачи биотехнологии: 1. создание новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов для медицины; 2. создание микробиологических средств защиты растений от болезней и вредителей, бактериальных удобрений и регуляторов роста растений; 3. создание новых высокопродуктивных и устойчивых к неблагоприятным факторами внешней среды сортов и гибридов сельскохозяйственных растений; 4. создание ценных кормовых добавок и биологически активных веществ для повышения продуктивности животноводства; 5. создание новых технологий получения хозяйственно ценных продуктов для использования в пищевой, химической, микробиологической и других отраслях промышленности; 6. создание технологий глубокой и эффективной переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов. Основные направления развития биотехнологии Доля России в мировом объеме производства продукции, полученной с использованием биотехнологии Годы Мировой объем (млрд.$) Россия (млрд.$) 250 200 1980 30 1,5 150 1990 95 3,2 100 2000 234 0,4 2010 (прогноз) Свыше 2000 2,5 50 Мировой объем Россия В целях стимулирования развития биотехнологической отрасли 24 апреля 2012 года Правительством была утверждена «Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года» 45 Объем финансирования Комплексной программы развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года (млрд. рублей) 30 Биофармацевтика 70 Биомедицина 367 106 Агробиотехнологии и пищевые биотехнологии Промышленные биотехнологии Биоэнергетика 150 210 200 Природоохранные биотехнологии Лесные биотехнологии Морские биотехнологии «Цветовая» классификация биотехнологии "красная" биотехнология – биотехнология, связанная с обеспечением здоровья человека и потенциальной коррекцией его генома, а также с производством биофармацевтических препаратов (протеинов, ферментов, антител); "зеленая" биотехнология - направлена на разработку и создание генетически модифицированных (ГМ) растений, определяет современные методы ведения сельского и лесного хозяйства; "белая" биотехнология - промышленная биотехнология, объединяющая производство биотоплива, биотехнологии в пищевой, химической и нефтеперерабатывающей промышленности; "серая " биотехнология - связана с природоохранной деятельностью; "синяя" биотехнология – связана с использованием морских организмов и сырьевых ресурсов. Структура мирового производства на рынке биотехнологий Области применения биотехнологии в различных отраслях промышленности и практической деятельности человека  Сельское хозяйство Производство химических веществ и соединений  Контроль за состоянием окружающей среды  Медицина  Энергетика  Материаловедение  Пищевая промышленность зерно крахмал Промышленные ферменты - α-амилаза - глюкоамилаза - протеазы - липазы - целлюлаза - пектиназа и др. - энергетика вода глюкозный сироп фруктозный сироп заменитель сахара биотехнологическая промышленность Витамины рибофлавин (B2) аскорбиновая к-та (C) никотинамид (PP) коболамин (B12) Каротиноиды - β-каротин - астаксантин - ликопин Аминокислоты - L-лизин - L-треонин - L-триптофан В перспективе: - производство кортизона и других стероидов из глюкозы - новые антибиотики и другие продукты Топливный этанол - Антибиотики Биомасса живых клеток - биокатализ в химии - очистка почв, воды и воздуха - Биоудобрения, биопестициды биоинсектициды биофунгициды азотофиксаторы биостимуляторы Химикаты молочная к-та лимонная к-та 1,3 - пропандиол тонкие продукты для фарминдустрии и др. Полисахариды - для технических целей - для пищевой промышленности Понятие о микроорганизмахмикроорганизмах-продуцентах. Требования, предъявляемые к промышленным штаммам Штамм - микроорганизмы одного вида, выращенные в определенных условиях, обладающие определенными свойствами, которые отличаются от других чистых культур данного вида Микроорганизмы-продуценты – микроорганизмы, Микроорганизмыобладающие способностью под воздействием внешних факторов образовывать в больших количествах преимущественно то соединение, которое является главным (целевым) продуктом данного производства Требования, предъявляемые к микроорганизмампродуцентам:  расти на дешевых и доступных питательных средах;  максимально усваивать питательные вещества среды;  обладать высокой скоростью роста биомассы и давать высокий выход целевого продукта;  проявлять активность, направленную в сторону получения желаемого продукта;  образование побочных продуктов должно быть незначительным;  быть стабильными в отношении продуктивности, требований к питательному субстрату и условиям культивирования;  быть устойчивыми к фагам и другой посторонней микрофлоре;  быть безвредными для людей (не обладать патогенными свойствами) и для окружающей среды;  образуемый продукт должен иметь экономическую ценность и легко выделяться. Сверхсинтез – способность микроорганизмов синтезировать определенный продукт в количествах, превосходящих физиологические потребности В промышленности применяют три вида штаммов природные штаммы штаммы, измененные в результате индуцированных мутаций штаммы, полученные методами генной или клеточной инженерии Стадии и кинетика роста микроорганизмов Кривая роста микроорганизмов (зависимость количества клеток от времени культивирования) Этапы роста культуры: I лаг-фаза – сравнительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания; II фаза ускоренного роста – начало деления клеток, увеличение общей массы популяции и постоянное увеличением скорости роста культуры; III экспоненциальная фаза (логарифмическая) бурное деление клеток, максимальная скорость роста культуры IV фаза замедления роста – скорость роста снижается, что связанного с исчерпанием питательной среды и накоплением токсических продуктов метаболизма; V стационарная фаза – прирост клеток равен их убыли; VI и VII фаза отмирания – постепенное снижение числа жизнеспособных клеток Сырье и состав питательных сред в биотехнологическом производстве Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева Ферментация (культивирование) - это совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала (инокулята) до завершения процессов роста и биосинтеза В качестве компонентов питательных сред используются отходы пищевых производств: Свекловичная меласса – отход производства сахара из свеклы, богата органическими и минеральными веществами, необходимыми для развития микроорганизмов. Мелассная барда – отход мелассноспиртового производства Зерно-картофельная барда – отход Зерноспиртового производства. Применяется для получения микробного белка Пшеничные отруби – отход мукомольного производства, используется для приготовления питательных сред при твердофазном способе культивировани Молочная сыворотка - отход производства сыров, творога и казеина Молочная сыворотка очень богата различными биологически активными соединениями Принципы составления питательных сред натуральные (биогенные) среды синтетические среды полусинтетические среды среды, приготовленные с использованием растительных, животных, микробных добавок среды, приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях среды, в состав которых вместе с соединениями химической природы входят биогенные добавки Компонентный состав сред зависит от пищевых потребностей микроорганизмов Вода Вода должна отвечать требованиям ГОСТ (чистая, бесцветная, без привкуса, запаха и осадка) Источники углерода Сахара: глюкоза, сахароза, лактоза; Многоатомные спирты: глицерин, маннит и др. Полисахариды: целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал Источники азота Азот может содержаться в форме неорганических солей или кислот (аминокислоты, мочевина и т.д.) Источники фосфора Фосфор входит в состав АТФ (аденозинтрифосфата), АДФ, АМФ и тем самым обеспечивает нормальное течение энергетического обмена в клетке, а также синтез белков, нуклеиновых кислот и другие процессы биосинтеза. Фосфор вносят в среду в виде солей фосфорной кислоты Источники витаминов и микроэлементов Дрожжевой гидролизат, дрожжевой экстракт, сок картофеля, молочную сыворотку, экстракт солодовых ростков и другие продукты Микроэлементы в состав питательных сред вводят в микродозах, в противном случае они оказывают ингибирующее действие на микробные клетки Способы культивирования микроорганизмов Существует два основных типа ферментаций: 1. получение биомассы микроорганизмов 2. получение ценных веществ (метаболитов), возникающих в ходе роста или на последующих стадиях развития культуры Процессы культивирования микроорганизмов: по состоянию питательной среды 1. Поверхностный способ культивирования посевной материал высевают на поверхность жидких и сыпучих питательных сред, распределенных небольшим слоем (около 10 см) в металлических кюветах. Такой способ культивирования не требует больших капиталовложений и позволяет использовать субстрат с высоким содержанием сухих веществ, следствием чего является высокая концентрация продукта 2. Глубинный способ культивирования клетки микроорганизмов развиваются во всем объеме жидкой питательной среды Такой способ позволяет осуществлять полную механизацию и автоматизацию процесса, избегать инфицирования технологического процесса посторонней микрофлорой, не требует больших площадей и большого оборудования по способу действия 3. Периодический способ культивирования Стерильная питательная среда засевается исходной культурой продуцента, далее в этой же емкости микроорганизмы при определенных условиях проходят через все стадии роста и развития популяции. Когда процесс культивирования заканчивается, емкость для выращивания освобождают, и цикл возобновляется, начиная от засева питательной среды исходной культурой продуцента Биотехнологически ценные продукты синтезируются в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, ферменты, витамины – первичные метаболиты) или в стационарной фазе роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. – вторичные метаболиты). 4. Непрерывный способ культивирования микроорганизмы постоянно получают приток свежей стерильной питательной среды, а из аппарата непрерывно отбирается биомасса вместе с образуемыми метаболитами Непрерывная ферментация может проходить в гомогенной системе идеального смешения, системе полного вытеснения или системе твердожидкостного типа 4.1. Гомогенные системы идеального смешения Реакторы непрерывно-проточного действия с интенсивным перемешиванием работают по принципу хемостата и турбидостата. Непрерывное культивирование дает возможность поддерживать постоянные условия роста микроорганизмов за счет лимитирования (ограничения) какого-то одного фактора среды При хемостатном режиме культивирования происходит лимитирование роста культуры одним из компонентов питательной среды При турбидостатном управлении процессом, подача питательной среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую плотность культуры в ферментере 4.2. Системы культивирования полного вытеснения Культура не перемешивается, а представляет собой поток жидкости через трубку Такая культура за время посева до выгрузки проходит через все стадии периодической культуры, то есть фазы роста распределены не во времени, а в пространстве, причем каждой части ферментера в установившемся режиме соответствует определенный отрезок кривой роста 4.3. Системы твердожидкостного типа К системам твердожидкостного типа относят многофазные системы, в которых культура растет на границе разных фаз: жидкость – твердая фаза - газ. В этих системах клетки удерживаются путем прилипания к твердой основе – наполнителю и размножаются на нем, образуя пленку биомассы. В данной системе лимитирующим фактором для аэробных микробов являются кислород и субстрат (питательные вещества) Культивирование микроорганизмов, образующих пленку из биомассы, осуществляется в ферментере типа колонки с наполнителем. В качестве наполнителя может использоваться макроноситель (кокс, прутья, стружка, стеклянные шарики и т.д.) и микроноситель (смолы) 5. Промежуточные способы культивирования 5.1. Продленный периодический процесс, Предусматривает одноразовую загрузку и разгрузку ферментера. Цикл развития микроорганизмов в этом процессе удлиняется либо за счет подпитки (периодического или непрерывного добавления питательной среды), либо за счет длительного удержания клеток в системе (диализная культура) 5.2. Многоциклический процесс культивирования Цикл выращивания культуры повторяется многократно без многократной стерилизации емкости Способы, осуществляемые в одном ферментере, называют одностадийными. Многостадийные многоциклические процессы, основанные на принципе повторного и последовательного периодического культивирования, протекающего в нескольких ферментерах, соединенных в батарею, с целью длительного использования культуры 5.3. В полунепрерывных системах полная загрузка и разгрузка ферментера осуществляются однократно, однако в процессе роста культуры часть культуральной жидкости сливается, а освободившийся объем заливается свежей питательной средой Таким образом, функционирует сливно-доливная система. Различные варианты полунепрерывных систем используются в производстве дрожжей, водорослей, антибиотиков и лимонной кислоты Общая биотехнологическая схема продуктов микробного синтеза Основные стадии: 1. приготовление питательной среды; 2. получение посевного материала; 3. культивирование микроорганизмов; 4. выделение целевого продукта; 5. очистка целевого продукта. 1. Приготовление питательной среды Принцип составления питательных сред Потребность микроорганизма в тех или иных соединениях определяется физиологическими особенностями данного вида микроба, но во всех случаях среда должна быть водным раствором этих веществ и обеспечивать в определенном количестве их приток в клетку Важнейшим условием приготовления питательных сред является соблюдение правил асептики (обеззараживание) химическое воздействие (дезинфекция) физические факторы (ультразвук, ультрафиолетовые лучи, ультрафильтрация) термические методы (автоклавирование, стерилизацию, кипячение и др. 2. Получение посевного материала Приготовление посевного материала состоит из следующих стадий: 1. Получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории 2. Выращивание микроорганизмов в малом посевном аппарате 3. Выращивание микроорганизмов в большом посевном аппарате 4. Накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере 3. Ферментация (культивирование) Это самый важный и продолжительный этап биотехнологического производства Для культивирования микроорганизмов в промышленных масштабах применяют ферментеры (или ферментаторы) – реакционные емкости, в которых при определенных условиях находятся микроорганизмы Основное назначение ферментатора Своевременно обеспечить микробные клетки необходимыми питательными веществами и кислородом (при необходимости) и отвести продукты обмена веществ, создать однородный состав среды при условии слабого потока культуральной жидкости (при непрерывном культивировании) 4. Выделение целевого продукта Разделение биомассы и культуральной жидкости сепарация - осуществляется несколькими методами Если целевым продуктом является биомасса клеток, применяют следующие методы выделения: отстаивание, фильтрация, флотирование, сепарирование и т.д. (механические способы); выпаривание и сушка (физические способы) Фильтрация – процесс разделения твердых частиц и жидкости, скорость которого зависит от пористости фильтрующего материала и давления Флотирование (применимо для выделения дрожжевых клеток) - процесс осуществляется путем вспенивания культуральной жидкости Вместе с пеной из культуральной жидкости удаляется и основная масса клеток Сепарирование осуществляют в сепараторах, в которых на клетки действует центробежная сила, отбрасывающая клетки к периферии сосуда, а культуральная жидкость будет собираться в центре сепаратора Выпаривание — это метод химико-технологической обработки для выделения растворителя из раствора, концентрирования раствора, кристаллизации растворенных веществ Сушка — процесс принудительного удаления жидкости из веществ и материалов Если целевой продукт содержится в самих клетках, то проводят разрушение клеток - дезинтеграцию – физическими, химическими и ферментативными методами К физическим методам можно отнести: -разрушение клеток под действие ультразвука, -замораживания-оттаивания, - баллистическая дезинтеграция (измельчение, раздробление, разложение на составные части) К химическим методам дезинтеграции относят: разрушение клеток с помощью толуола, бутанола и других химических соединений К ферментативной дезинтеграции клеток используют ферменты, способные разрушать определенные структурные компоненты клеточных стенок микроорганизмов Выделение продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции, кристаллизации или сорбции Осаждение в виде нерастворимых солей производят путем добавления химического осадителя. Применяют при получении лимонной, молочной кислоты. Экстракция – добавление к раствору экстрагента (растворителя), который поглощает целевой продукт. Затем эмульсию разделяют и выделяют целевое вещество. Используют при получении витаминов, антибиотиков. Кристаллизация – после предварительной обработки культуральной жидкости и выпаривания при охлаждении осуществляют кристаллизацию. Используется при получении глутаминовой, итаконовой и других кислот Центрифугирование – расслоение раствора с частицами бόльшей плотности на осадок и надосадочную жидкость при воздействии центробежной силы Ультрафильтрация – обработка раствора на мембранных фильтрах с определенным размером пор (то есть разделение веществ на фракции по размерам их молекул). Применяется для ферментов и других белков 5. Очистка целевого продукта Эта стадия необходима при получении очищенного целевого продукта, например, ферментных препаратов Сорбция (связывание) – это процесс связывания каолином, трифосфатом кальция, гидроксидом алюминия и другими адсорбентами Таким образом проводят сорбцию либо фермента, либо балластных белков, которые затем разделяют центрифугированием На последнем этапе продукт отделяют от примесей, концентрируют и стабилизируют. После стабилизации продукта в зависимости от того, каким должен быть конечный продукт: сухим или жидким, его обезвоживают или сразу упаковывают и отправляют на хранение и далее потребителю.