Биофизика

МИНОБРНАУКИ РОССИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «МИРЭА – Российский технологический университет» РТУ МИРЭА Направление подготовки бакалавров 12.03.04 «Биотехнические системы и технологии» Профиль подготовки "Компьютерные системы и технологии обработки медико-биологической и экологической информации" В. Н. Каданцев БИОФИЗИКА Конспект лекций МОСКВА 2 0 21 1 БИОФИЗИКА ВВЕДЕНИЕ В.1 Биотехнические системы и технологии В.2 Биофизика и естествознание В.3 Возможность описания биологических явлений на молекулярном уровне 1. ТЕРМОДИНАМИКА РАВНОВЕСНЫХ СОСТОЯНИЙ 1.1 Термодинамическая система, основные понятия и определения 1.2 Первый закон термодинамики 1.3 Энтальпия. Закон Гесса 1.4 Второй закон термодинамики 1.5 Термодинамические потенциалы. Максимальная полезная работа 1.6 Третий закон термодинамики 1.7 Свойства открытых систем. 2. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 3. ХИМИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ЖИЗНИ. 4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АТОМОВ В МОЛЕКУЛАХ И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В БИОСИСТЕМАХ. 4.1. Дисперсионные или вандерваальсовы взаимодействия. 4.2. Водородные связи между молекулами. 5. ВОДА И ЕЕ РОЛЬ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ. 6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МОЛЕКУЛ И ИОНОВ С ВОДОЙ. 6.1. Гидратация ионов в воде. 6.2 Гидрофобные и гидрофильные взаимодействия. 6.3. Электролиты. 7. БЕЛКИ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ 7.1. Белки 7.2 Структура белков 7.3. Первичная структура белков 7.4. Вторичная и более высокого порядка структуры Б.М. 7.5 Некоторые биологические функции белков 7.6. Аллостерические ферменты. Кооперативность 7.7. Контроль биохимических реакций 7.8. Ферменты, расщепляющих белки 8. ФИЗИКА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БИОСИНТЕЗА БЕЛКА 8.1 Структура нуклеиновых кислот. 2 8.2 Редупликация ДНК. 8.3 Проблема генетического кода. 8.4 Биосинтез белка. 9. БИОЛОГИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ 9.1. Поверхность клетки 9.2. Узнавание клетками друг друга 9.3. Состав и структура клеточных мембран 9.4. Внутренние мембранные белки 9.5. Динамические модели клеточных мембран 9.6. Кооперативные явления в мембранах 9.6. Пассивный транспорт ионов и молекул через мембраны 9.7. Транспорт молекул и ионов через мембраны, разделяющие электролиты 9.8. Пассивный транспорт при участии переносчиков 9.9. Трансмембранная разность потенциалов 10. ПРИНУДИТЕЛЬНЫЙ ТРАНСПОРТ МОЛЕКУЛ И ИОНОВ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ 10.1 Ионные насосы 10.2. Энергетизованное состояние мембраны 10.3. Окислительное фосфорилирование 10.4. Активный транспорт в мембранах бактерий 11. БИОЭНЕРГЕТИКА 11.1. Метаболические реакции в клетке 11.2. Молекула АТФ как универсальный аккумулятор энергии в клетке 11.3. Митохондрии — энергетические фабрики клеток 11.4. Цепь электронного транспорта в митохондриях 12. ФОТОСИНТЕЗ В БИОСИСТЕМАХ 12.1. Механизм фотосинтеза 12.2. Темновая фаза фотосинтеза 13. ПЕРЕДАЧА НЕРВНОГО ИМПУЛЬСА 13.1 Нервная клетка — нейрон 13.2. Немиелинизированные нервные волокна 13.3. Потенциал действия 13.4. Уравнения Ходжкина — Хаксли 13.5. Распространение импульсов по нервным волокнам 13.6. Синаптическая передача 13.7. Нервно-мышечные синапсы 3 14. НЕРАВНОВЕСНАЯ ТЕРМОДИНАМИКА В БИОЛОГИИ. 14.1. Необратимые процессы. 14.2. Энтропия неравновесной системы 14.3. Производство энтропии 14.4. Уравнение баланса массы 14.5. Уравнение сохранения энергии 14.6. Уравнение баланса энтропии 14.7. Термодинамика нелинейных необратимых процессов 14.8. Изменение энтропии в открытых системах 14.9. Скорость продукции энтропии и диссипативная функция 14.10. Основные положения линейной неравновесной термодинамики 14.11. Соотношение взаимности Онзагера 14.12. Принцип симметрии Кюри – Пригожина 14.13. Термодинамика линейных необратимых процессов в биологических мембранах 14.14.Теорема Пригожина 14.15. Устойчивость стационарного состояния 14.16. Нелинейная термодинамика необратимых процессов 14.17. Нелинейная термодинамика и диссипативные структуры ЛИТЕРАТУРА Л.1. Основная литература Л.2. Дополнительная литература 4 ВВЕДЕНИЕ В.1 Биотехнические системы и технологии Область профессиональной деятельности бакалавров включает: - область технических систем и технологий, в структуру которых включены любые живые системы и которые связаны с контролем и управлением состояния живых систем, обеспечением их жизнедеятельности, а также с поддержанием оптимальных условий трудовой деятельности человека. Биотехнологии — самый главный инструмент в осуществлении стремлений человечества использовать природные явления себе во благо. Это понятие сочетает в себе фундаментальную науку с практикой, получение знаний с их практическим применением. Накопление наших знаний о природных явлениях всегда предполагало поиск способов улучшить качество жизни людей, сделать её безопаснее и продуктивнее. Нам надо не только понимать причины болезней, но и уметь лечить их, не только потреблять продукты питания, но и делать их более питательными, не только обнаруживать интересный природный процесс, но и использовать его в промышленности и т.д. Приобретение соответствующих компетенций невозможно без знаний и понимания того, какое место занимают живые системы в «структуре» мироздания и эволюционистике. Этот курс лекций посвящен описанию того, как инертная материя может самоорганизовываться и приобретать свойства, которые обычно приписываются всему живому (эмерджентность). В эволюционистике это выражается в том, как возникновение новых функциональных единиц системы, которые не сводятся к простому суммированию свойств и перестановкам уже имевшихся элементов. Феномен жизни (возникновение и функционирование живых систем) - это один из этапов процесса самоорганизации (эволюции) Вселенной, мироздания. В.2 Биофизика и естествознание Физика и биология. Физика -наука о строении и свойствах конкретных видов материи (вещества и полей) и о формах существования материи пространства-времени). В физике нет разграничения на живую и НЕживую материю. Биология- наука о живой природе. Объекты её исследования неизмеримо сложнее Неживых. Биологическая физика (Биофизика) – физика явлений жизни, изучаемых на всех уровнях, начиная с молекул и клеток и кончая биосферой в целом. Содержание БФ связано не только с применением физических приборов в биологическом эксперименте и биотехнологиях. 5 БФ начинается с физической постановки задачи, относящейся к ЖИВОЙ природе. Задача БФ формулируется исходя из общих законов физики и атомно- молеклярного строения вещества. Задача БФ состоит не только в обосновании теоретической биологии но и в решении многочисленных практических, прикладных проблем. Однако формулировка задач БФ в настоящее время возможна лишь в ограниченном числе случаев из-за недостаточности знаний о живой природе в силу её сложности. Из достижений БФ можно отметить следующие: - знание о строении и свойствах функциональных биомолекул – белков, ДНК и др. - о свойствах и механизмах действия клеточных структур (мембран, биоэнергетических органоидах – митохондриях, механохимических систем и др.) -успешно разрабатываются физико-математические модели биопроцессов вплоть до онтогенеза (т.е. индивидуального развития особи от зарождения до конца жизни) и филогенеза (т.е исторического развития мира живых организмов как в целом, так и отдельных таксономических групп). - успешно разрабатываются общетеоретические подходы к явлениям жизни, основанные на термодинамике, теории информации (кибернетики), теории автоматического регулирования и синергетики. Живая и неживая природа. Живой организм – открытая саморегулируемая, самовоспроизводящаяся и развивающаяся гетерогенная система важнейшими функциональными веществами которой являются белки и нуклеиновые кислоты. Биологическая индивидуальность. Принципиальная особенность живой природы в её многообразии. Известно около 3.106 видов различных живых существ. Кроме того, важнейшей особенностью живых организмов является историчность их жизни. В неживой природе число различных атомов и их изотопов порядка 5000 и порядка 100 элементарных частиц. Химические и молекулярные основы многообразия живого обусловлены макромолекулярным строением генов, белков и собственно биоорганизмов. Задачи и методы биофизики. Курс "биофизика" базируется, главным образом, на молекулярной биофизике. Стремительное развитие биофизики сопровождается проникновением ее в различные области биологии и тесным взаимодействием со смежными дисциплинами - физикой, химией, математикой, кибернетикой. Именно этим определяется вклад биофизики в решение современных проблем биологии и медицины. Широкое внедрение физических методов исследования в биологию позволило изучать биологические явления на молекулярном уровне. Блестящими работами биохимиков, физиологов, биофизиков и кристаллографов установлены молекулярные структуры ряда важнейших 6 биологических объектов. Например, выяснена структура дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) — основного носителя наследственной информации, структура молекул миоглобина, запасающих кислород в мышцах животных, структура молекул гемоглобина, входящих в состав красных кровяных телец и переносящих кислород из легких к тканям, строение поперечнополосатых мышц и белковых молекул, входящих в их состав, структура некоторых ферментов, витаминов и ряда других важных биологических молекул. Тесная связь биологии и физики проявилась уже на ранних этапах развития естествознания. Однако наряду с материалистическим пониманием связи между физикой и биологией долгое время существовала точка зрения, получившая название «витализм». Виталисты утверждали, что живое якобы отделено от неживого непроходимой пропастью и подчинено не природным закономерностям, а «жизненной силе» и поэтому непостижимо для человека. В настоящее время никто не сомневается в том, что жизнь есть особое проявление физических и химических процессов, протекающих в сложных молекулярных системах, взаимодействующих с другими системами путем обмена энергией и веществом. Следует, конечно, иметь в виду, что биологические объекты обладают рядом весьма своеобразных особенностей, отличающих их от тел неживой природы. К этим особенностям прежде всего относится - самовоспроизводство и адаптация к изменяющимся внешним условиям, -тончайшая регуляция и самосогласованность всех биологических процессов, происходящих в живых системах и обеспечивающих их жизнедеятельность. Молекулы, входящие в состав живых организмов, необычайно велики, многообразны и сложны. Самыми сложными и разнообразными из всех молекул, входящих в состав клеток, являются белковые молекулы. Их молекулярные массы варьируют от нескольких десятков тысяч до нескольких миллионов. Величайшее разнообразие биологических организмов не означает чрезвычайного многообразия химических единиц, из которых они построены. Это разнообразие определяется многочисленными комбинациями одних и тех же соединений и атомных групп. Например, все белки состоят в основном из 20 остатков аминокислот. Молекулы ДНК строятся из четырех типов нуклеотидов. При изучении тел неживой природы было установлено, что по мере усложнения атомных систем появляются новые качества. Понятия температуры, энтропии, звуковых волн и других элементарных коллективных возбуждении применимы к системе атомов и молекул, но неприменимы к одному атому. Не может быть сомнения в том, что все своеобразие живых организмов, отличающее их от тел неживой природы, возникает в результате особой организации сложных молекулярных систем, в основе которых лежат те же элементарные законы, которые определяют свойства атомов и молекул и построенных из них тел неживой природы. 7 Широкое развитие биофизики и проникновение ее в различные смежные области биологии и медицины стало возможным главным образом благодаря формированию в биофизике собственной теоретической базы, необходимой для обоснования теоретической биологии, разработке общетеоретических подходов к явлениям жизни, основанных на термодинамике, теории информации, теории автоматического регулирования и др. В настоящее время никто не отрицает применимость законов физики и химии к исследованию биологических явлений. Подавляющее большинство ученых согласны с тем, что все разнообразные проявления жизни в конечном счете можно объяснить на основании тех же физических и химических законов, которым подчиняются неживые системы. Задача курса состоит в выявлении единства в многообразии биологических явлений путем раскрытия общих молекулярных механизмов взаимодействий, которые лежат в основе биологических процессов. Предмет биофизики достаточно сложен и многогранен, его изложение требует привлечения не только материалов из различных разделов биологии, но и широкого использования современных представлений и методов физики, математики, физической химии и др. Для понимания биофизики требуется умение мыслить и "биологически" и "физически". Быстрый темп развития науки, возникновение новых (пограничных) отраслей науки (таких, например, как синергетика) приводят к тому, что запаса конкретных знаний, полученных в вузе, хватает специалисту лишь на весьма ограниченное время. Поэтому основной целью дисциплины является изложение основ (фундаментальных понятий, логических концептуальных схем) биофизики и принципов ее применения в научных исследованиях, что позволит самостоятельно применять и целенаправленно пополнять свои знания. В.3 Возможность описания биологических явлений на молекулярном уровне В настоящее время перед биофизикой стоит задача описания строения, свойств и функционирования простейших биологических систем: ферментов, структурных белков, клеточных и внутриклеточных мембран и органелл, входящих в состав клеток живых организмов. Особый интерес представляет выяснение вопросов хранения и эффективного использования химической энергии, извлекаемой из пищевых продуктов, для построения клеток и их биологической деятельности. Предполагается, что эти задачи могут быть решены на основе знания атомного состава основных биологических элементов при учете внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий и вызываемых ими преобразований и конформационных изменений макромолекул, переносом энергии, электронов и протонов как вдоль молекул, так и между ними. В неживой природе такие задачи решаются методами квантовой механики, статистической физики, равновесной и неравновесной термодинамики. В природе нет полностью изолированных систем. Все реальные системы являются частями больших систем, с которыми они взаимодействуют. 8 Состояния реальных систем описываются параметрами и физическими величинами, учитывающими взаимодействие данной системы с ее окружением. В этом случае можно говорить только о средних значениях физических величин. Если внешние условия постоянны (температура, давление и др.), то через некоторое время, называемое временем релаксации, устанавливается термодинамическое равновесие данной системы с окружающей средой. В состоянии термодинамического равновесия средние значения физических величин, характеризующих систему, являются однозначными функциями параметров, определяющих внешние условия. В случае биологических систем, в которых происходят химические реакции, такими параметрами являются температура, давление, химический и электрохимический потенциалы и др. Если интересоваться состояниями ферментов, структурных белков, мембран и других биологических объектов в момент, когда они не выполняют «работы», т. е. не подвергаются быстрым, по сравнению с временем релаксации, воздействиям, то эти состояния близки к равновесным. Наиболее существенным свойством функций состояния является то, что их изменение при переходе системы из одного равновесного состояния в другое не зависит от того, по какому пути протекает процесс. Все биологические молекулы и надмолекулярные структуры функционируют в водной среде, взаимодействие с которой часто играет решающую роль. Поэтому, рассматривая химические преобразования молекул и других биологических структур, необходимо учитывать и их водное окружение. Иными словами, говоря о молекулах и молекулярных структурах, мы всегда будем подразумевать и их водное окружение. При оценке результатов химических реакций достаточно знать только начальное и конечное состояния системы. Однако при таких оценках мы ничего не можем сказать о скорости изменения и механизме происходящих явлений. Все процессы, протекающие в живых организмах, относятся, строго говоря, к необратимым процессам. При этом суммарная энтропия системы и окружающей среды всегда возрастает, достигая максимального значения при наступлении равновесия. Закон возрастания энтропии относится именно к сумме энтропии системы и внешней среды. Энтропия системы может и уменьшаться, если это уменьшение компенсируется большим увеличением энтропии окружающей среды. Термодинамика и статистическая физика, определяя направление протекания процессов, не выясняют скорости их протекания и молекулярного механизма. Последнее можно сделать только на основе динамических теорий. Однако, в связи с очень большим числом степеней свободы даже простейших биологических систем, их динамическое описание практически не осуществимо даже при использовании современных вычислительных машин. Многие жизненно важные процессы связаны с изменением выделенных (обычно коллективных) степеней свободы, характеризующихся большим временем релаксации, из-за слабой связи с другими степенями свободы 9 системы. Изменение этой степени свободы относится к существенно неравновесному процессу. В неживой природе хорошим примером таких неравновесных возбуждений являются звуковые волны в газовой, жидкой и твердой среде, которые переносят энергию (сигнал) на большие расстояния (километры), почти не передавая ее другим степеням свободы, связанным с беспорядочным тепловым движением молекул. Именно возможность выделения таких слаборелаксирующих элеменэлементарных возбуждений (фононы, экситоны, плазмоны и др.) позволила объяснить огромное число экспериментальных фактов в твердых телах и других системах. Несомненно, что эффективное использование химической энергии пищевых продуктов живыми организмами для сокращения мышц, создания градиентов кэнцентрации, переноса нервного импульса, синтеза белков и т. д., связано с возбуждением особых слаборелаксирующих степеней свободых. Одной из задач молекулярной биофизики является выяснение основных свойств таких возбуждений и механизма их работы. В дальнейшем мы рассмотрим некоторые возбуждения этого типа. Биофизика, как и физика располагает двумя подходами к изучаемым явлениям, двумя уровнями их исследования. Первый уровень - феноменологический, основанный на изучении наиболее общих закономерностей, но не рассматривающий детальную природу явлений. Второй уровень - атомномолекулярный, позволяющий в конечном счете выявить элементарные основы явлений и определить их количественные характеристики. Термодинамика является общефеноменологической теорией, методы которой с большим успехом могут быть распространены на изучение всей материи и особенно плодотворны при исследовании химических и биохимических процессов. Термодинамический подход оказался одним из наиболее мощных методов исследования макроскопических систем, поскольку он основан на наблюдаемых и измеримых свойствах материи, позволяющий предсказывать те или иные свойства веществ (электрические, магнитные или сродство веществ друг к другу). 1. ТЕРМОДИНАМИКА РАВНОВЕСНЫХ СОСТОЯНИЙ Термодинамика возникла более 200 лет назад и с самого начала своего становления использовала данные теплопродукции мелких животных, получаемые с помощью калориметрии. Классическая термодинамика находит разности энергий и определяет направления возможных изменений. Наиболее серьезное ограничение при использовании классической термодинамики состоит в том, что она исследует равновесные состояния и не рассматривает кинетику процесса. 1.1 Термодинамическая система, основные понятия и определения 10 Термодинамической системой называется конечная область пространства с находящимися в ней физическими объектами макроскопических размеров, ограниченная оболочкой. Область вне оболочки системы представляет собой окружающую среду. В зависимости от того, как термодинамическая система связана с окружающей средой, различают три типа систем: изолированные, замкнутые и открытые. Изолированная термодинамическая система отделена от окружающей среды и полностью защищена от всех внешних воздействий. Если в такой системе протекает процесс, не сопровождающийся теплообменом и обменом вещества, мы имеем дело с адиабатическим процессом. Замкнутая (закрытая) система обменивается энергией, но при этом отсутствует обмен веществом. В открытых термодинамических системах имеет место обмен с окружающей средой и веществом, и энергией. Термодинамическая система характеризуется определенными термодинамическими параметрами. Экстенсивные параметры зависят от общего количества вещества в системе (например, масса m, объем V); интенсивные не зависят от массы системы (давление р, температура Т, молярная концентрация n). Изменение любого из параметров вызывает изменение состояния системы. Переход термодинамической системы из одного состояния в другое происходит в результате различных процессов. Процесс называется обратимым, если при переходе системы из исходного состояния в конечное и возврате ее в исходное (циклический процесс) состояние системы не изменяется. Если же в результате такой последовательности переходов в системе происходят необратимые изменения, то такие процессы называются необратимыми. Реальные процессы в природе всегда проходят как необратимые. Термодинамика базируется на основных принципах - законах (началах) термодинамики. 1.2 Первый закон термодинамики Основная задача термодинамики состоит в том, чтобы найти такие величины, которые однозначно определяют изменение состояния термодинамической системы при ее переходе из одного состояния в другое. Опыт показал, что такой величиной является внутренняя энергия U. Она является функцией состояния системы и зависит от термодинамических параметров: U=f(m,p,V,T). Изменение внутренней энергии ∆U не зависит от пути перехода из одного состояния системы в другое. Внутренняя энергия - это сумма кинетической и потенциальной энергий всех атомов и молекул термодинамической системы. Изменение внутренней энергии ∆U в замкнутой системе можно определить, измеряя поглощенную (выделившуюся) теплоту Q и выполненную работу W. Экспериментально установлено, что изменение внутренней энергии равно U  U 2  U 1  Q  W (1) 11 Какими бы путями этот переход не осуществлялся и как бы не изменялись по величине Q и W, всегда сохраняет постоянное значение их разность: (2) Q'W '  Q"W " Это означает, что в замкнутой системе изменение внутренней энергии ∆U=const. Первый закон термодинамики (закон сохранения энергии) гласит: в изолированной термодинамической системе полный запас энергии - величина постоянная и возможны лишь превращения одного вида энергии в другой в эквивалентных отношениях (3) U  const ; U  0 В замкнутой системе изменение внутренней энергии ∆U при переходе из одного состояния в другое определяется количеством переданной теплоты и величиной выполненной работы (4) U  Q  W Знак (-) означает, что работа выполняется системой против внешних сил, а знак (+) что работа выполняется над системой. В СИ энергия измеряется в джоулях (Дж). 1Дж = 0,239кал = 6,25-1018 эВ. 1.3 Энтальпия. Закон Гесса При фиксированном давлении р можно ввести вместо внутренней энергии U новую функцию состояния, которая хорошо описывает термодинамическую систему в этом случае. Так как работа по изменению объема V при постоянном давлении определяется выражением (5) W p  pV то первый закон термодинамики можно записать в виде (6) Q  U  pV  (U  pV )  H где введена новая функция состояния - энтальпия (Н) (7) H  U  pV Энтальпию называют теплосодержанием системы; она важна для изучения химических реакций в живой клетке, протекающих при постоянном давлении. Изменение энтальпии определяется законом Гесса: тепловой эффект химической реакции Q не зависит от пути реакции (от исходных продуктов к продуктам реакции), а определяется лишь разностью энтальпий конечных и исходных веществ Q  H Закон Гесса прямое следствие первого закона термодинамики. Отметим важное свойство энтальпии: так как изменение теплосодержания системы (энтальпии) соответствует величине поглощенной или выделенной теплоты, то ее можно точно определить с помощью калориметра. Попытки проверить опытным путем справедливость первого закона термодинамики для биологических объектов предпринимались уже давно. Так, Лавуазье и Лаплас (1780г. ) измеряли в ледяном калориметре количество теплоты и углекислого газа СО2, выделяемых организмом морской свинки, а 12 затем сравнивали полученные величины с тепловым эффектом реакции сжигания исходных продуктов питания до СО2- Эти и последующие измерения показали, что потребление 1л О2 и выделение 1л СО2 при прямом сжигании или окислении в организме продуктов сопровождается выделением 21,2 кДж теплоты. Совпадение тепловых эффектов в обоих случаях свидетельствует о том, что пути превращения продуктов питания в метаболических процессах и химических реакциях вне живой клетки эквивалентны с точки зрения суммарных тепловых эффектов. Иными словами, для процессов метаболизма также справедлив закон Гесса, как и в физической химии. Это дает возможность рассчитать тепловые эффекты сложных биохимических циклов, если известны лишь их начальные и конечные продукты. Прямые эксперименты на людях показали, что количество энергии, поглощенной за сутки человеческим организмом вместе с продуктами питания, равно выделенной за это же время теплоте, что подтверждает справедливость для всех живых организмов первого закона термодинамики. Следовательно, сам по себе живой организм не является независимым источником какой - либо новой формы энергии. 1.4 Второй закон термодинамики Этот закон устанавливает критерий, отражающий одностороннюю направленность необратимых процессов независимо от их конкретной природы. Согласно второму закону, состояние термодинамической системы может быть описано особой функцией состояния - энтропией S. Изменение энтропии dS определяется суммарным значением поглощенных системой приведенных те-плот Q/T. При бесконечно малом изменении состояния системы изменение энтропии dS равно (если процесс равновесный) или больше (если процесс неравновесный) значения поглощенной системой элементарной приведенной теплоты δQ/T dS  Q T (8) Для системы, которая не обменивается теплом с внешней средой, δQ=0 и уравнение (8) принимает вид (9) dS  0 Следовательно, в изолированной системе энтропия остается неизменной в равновесных процессах и возрастает в неравновесных. Это и является критерием направленности превращений в изолированной системе. Таким образом, протекающий в изолированной системе самопроизвольный неравновесный процесс всегда вызывает увеличение энтропии до ее максимальных значений при окончании процесса и установлении термодинамического равновесия. Энтропия измеряется в Дж/К или в энтропийных еденицах (э.ед). В качестве примера приведем абсолютные значения энтропии 1 М воды (Н2О) в различных агрегатных состояниях: - в твердом состоянии (лед): S = 41кДж/К (9,8э.ед); 13 - в жидком состоянии: S = 70кДж/К (16,7э.ед); - в газообразном состоянии (при давлении 1 атм): S = 189кДж/К (45,1э.ед). Приведенные данные хорошо показывают корреляцию энтропии с неупорядоченностью системы: чем более неупорядоченная система (газообразное состояние), тем больше ее энтропия. Это обстоятельство не является случайным и находит свое объяснение при трактовке энтропии с помощью понятий статистической физики, данной впервые Л. Больцманом. Энтропия, согласно трактовке Больцмана, является мерой неупорядоченности системы. В результате самопроизвольных процессов изолированная система переходит в состояние термодинамического равновесия, которое характеризуется максимальной энтропией (рис.1). Следовательно, в изолированной системе энтропия остается неизменной и возрастает в неравновесных процессах. Это и является критерием направленности превращений в изолированных системах. Таким образом, протекающий в изолированной системе самопроизвольный неравновесный процесс всегда вызывает увеличение энтропии до её максимального значения при окончании процесса и установлении термодинамического равновесия. Рис. 1. Установление термодинамического равновесия. При равновесии происходят флуктуации, вызывающие локальное уменьшение энтропии dS < 0. Но в системе возникают такие процессы, которые возвращают ее назад в равновесное состояние с максимальной энтропией и максимальной разупорядоченностью. Следовательно, стремление энтропии к максимальному значению является главным эволюционным принципом изолированной термодинамической системы. 14 Рис. 2. Изменение энтропии 5 изолированной системы при достижении состояния термодинамического равновесия. 1.5 Термодинамические потенциалы. Максимальная полезная работа Второй закон термодинамики позволяет установить направленность процессов в термодинамической системе, однако по изменению термодинамических функций ∆U и ∆S нельзя оценить величину производимой работы. Максимальная полезная работа δАmax, сопровождающая всевозможные химические превращения, связана с другими термодинамическими функциями состояния системы: свободной энергии (10) F  U  TS и полного термодинамического потенциала (11) G  U  pV  TS которые вводятся на основании первого и второго законов и зависят от переменных F=F(T,V), G=G(T,p) соответственно. Если процессы осуществляются при постоянных температуре (Т = const) и объеме (V = const), то максимальная полезная работа в системе выполняется за счет изменения свободной энергии Гелъмголъца (F - изохорно-изотермический потенциал). В этом случае pdV=0 и  Аmax  d (U  TS )  TdS  dU  (dF )T ,V Если Т = const и p=const, то максимальная полезная работа производится за счет изменения свободной энергии Гиббса (G - изобарно-изотермический потенциал) : Amax  d (U  pV  TS )  TdS  dU  pdV  (dG) T , p , где знак “ < ” соответствует необратимым процессам. Таким образом, по величине и знаку изменения термодинамического потенциала можно судить о направленности процессов. Если в результате определенных процессов термодинамические потенциалы понижаются (dF < 0 или dG < 0), такие процессы являются самопроизвольными. Они происходят с выделением энергии и называются экзергоническими. Процессы, которые идут с увеличением термодинамических потенциалов (dF > 0 или dG > 0), не являются самопроизвольными и сопровождаются поглощением дополнительной энергии из внешней среды. Такие процессы называют эндергоническими. При достижении равновесия в системе термодинамические потенциалы стремятся к минимальным значениям F  min, dF  0; G  min, dG  0. В биологических системах процессы обычно происходят при р = const, поэтому в термодинамических оценках преимущественно используется потенциал G. 15 Состояние системы является функцией числа молей ni составляющих ее веществ. При этом следует помнить, что в закрытой системе при протекании химических реакций все ni - независимые переменные. Изменение химической энергии системы пропорционально изменению числа молей соответствующих компонентов системы dni. Обычно этот коэффициент пропорциональности обозначают μi и называют его химическим потенциалом. Химический потенциал представляет собой изменение любой термодинамической функции U,H,F,G, отнесенное к изменению количества молей  U   H   F   G   S             T    i    ni   ni   ni  T ,V  ni  T , p  ni  С помощью химического потенциала изменение внутренней энергии системы в зависимости от изменения ее состава определяется уравнением Гиббса: dU  TdS  pdV    i dni i Таким образом, на основании второго закона термодинамики можно вычислять изменения свободной энергии F или полного термодинамического потенциала G, которые сопровождают биохимические превращения в живых системах. Кроме того, подходы равновесной термодинамики могут быть использованы при решении вопросов, связанных с переносом заряженных и нейтральных веществ через клеточные мембраны. Различные способы расчетов изменения свободной энергии достаточно полно освещены в курсах биохимии; их рассмотрение выходит за рамки настоящего пособия. Все они основаны на обычных представлениях классической термодинамики, согласно которым полное изменение свободной энергии в системе сопоставляют с достижением равновесного конечного состояния в соответствующей биохимической реакции. При этом не учитывается характер самого изменения свободной энергии во времени. 1.6 Третий закон термодинамики Смысл третьего закона, который также известен как тепловой закон Нернста, состоит в том, что энтропия любой системы при абсолютном нуле равна нулю. 1.7 Свойства открытых систем. Второй закон термодинамики в открытых системах. Непосредственное применение второго закона термодинамики к открытым системам, в которых протекают неравновесные процессы, встречает ряд трудностей. Действительно, критерием направления самопроизвольных изменений в изолированной системе служит увеличение S . а конечное состояние - состояние равновесия. В то же время, такие открытые системы как БО прекращают свое существование как таковые в состоянии равновесия. В целом, поддержание 16 неравновесных состояний в открытых системах возможно лишь за счет создания в них соответствующих потоков вещества и энергии. Изменение энтропии открытых систем может происходить либо за счет процессов обмена системы с внешней средой (deS) . либо за счет возникновения энтропии в самой системе вследствие внутренних необратимых изменений (diS) ( каталитические химические реакции …..) Постулируется, что общее изменение энтропии открытой системы dS складывается из двух независимых частей: dS  de S  di S В этом состоит исходное положение термодинамики необратимых процессов. Для изолированных систем de S = 0 и dS = di S > 0 , что соответствует классической формулировке второго закона термодинамики для изолированных систем. Если в каком либо участке открытой системы dS de S di S   - скорость изменения энтропии системы dt dt dt dS / dt равна скорости обмена энтропией между системой и окружающей средой + скорость производства энтропии внутри системы, то dS / dt - может быть > или < 0 , так что при di S/ dt ≥ 0 общая энтропия системы может как возрастать , так и убывать. Возможны следующие случаи (при di S / dt ≥ 0) : 1. dS / dt > 0 , если de S / dt > 0 или de S / dt < 0 но |de S / dt | < |di S / dt | 2. dS / dt < 0 , если de S / dt < 0, и |de S / dt | >di S / dt 3. dS / dt = 0 , если de S / dt < 0 и |de S / dt | = |di S / dt | Случай 3 соответствует установлению стационарного (не равновесного!) состояния в системе. Анализ общих свойств биосистем на основе разделения dS на diS и deS помог объяснить кажущееся внешнее противоречие между поведением организмов вторым законом классической термодинамики. Действительно рост и развитие организма сопровождается усложнением его организации, что с точки зрения классической термодинамики выглядит как самопроизвольное уменьшение энтропии живых систем, что явно противоречит второму закону. Но противоречие это кажущееся, так как dS > 0 всегда справедливо только для изолированных систем. 2. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 17 Из известных физикам четырех типов взаимодействий (ядерное, или «сильное», электромагнитное, «слабое» и гравитационное) только электромагнитное взаимодействие ответственно за электронное строение атомов и молекул и взаимодействия между ними. Ядерное и «слабое» ваимодействия обладают очень малым радиусом действия: соответственно 10-13 и 10-14 см. на характерных для молекулярных систем расстояниях (примерно l0-8 см) их действие не проявляется. Ядерные силы определяют свойства атомных ядер, имеющих размеры приблизительно 10-13 см и состоящих из протонов и нейтронов. «Слабые» взаимодействия характеризуют процессы взаимопревращений протонов и нейтронов и других элементарных частиц. Они слабее ядерных примерно в 10 12 раз. Энергия гравитационного возаимодействия двух тел так же, как и электромагнитных взаимодействий тел, имеющих электрические заряды, убывает обратно пропорционально расстоянию между ними. Величина гравитационного взаимодействия пропорциональна произведению масс взаимодействующих тел. Однако коэффициент пропорциональности G имеет исключительно малое значение (приблизительно 6,67 • 10 -8 см3/г • с2). Поэтому гравитационное взаимодействие существенно, когда в нем участвуют тела очень большой массы (притяжение тел к Земле, взаимодействие планет и Солнца, взаимодействие между звездами и галактиками). Отношение гравитационного притяжения между электронами к их электростатическому отталкиванию равно 2,5 • 10 -43, а гравитационное притяжение электрона к протону в атоме водорода составляет только 8 -87 • 10 часть их кулоновского взаимодействия. Движущиеся электрические заряды кроме электрического поля создают магнитное поле, которое действует на другие движущиеся заряды. При этом отношение магнитного взаимодействия к электростатическому пропорционально квадрату отношения их относительной скорости v к скорости света с. Соотношение между магнитной и электрической силой: Fm  v  ~  Fe  c  2 В атомах и молекулах это отношение очень мало, поэтому главное значение имеет электростатическое взаимодействие. Кроме электрического заряда электроны и некоторые атомные ядра обладают малыми магнитными моментами. Прямое магнитное взаимодействие между этими магнитными моментами также составляет ничтожную долю электростатического взаимодействия. Более существенное значение имеет спин (механический момент) электронов. Характер движения электронов и, следовательно, среднее электростатическое взаимодействие между ними зависит от относительной ориентации их спинов. Основными элементарными единицами, из которых строятся все живые организмы, являются атомы и молекулы. Атомы и молекулы, в свою очередь, 18 состоят из отрицательно заряженных электронов и положительно заряженных атомных ядер, между которыми действуют электрические силы. 3. ХИМИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ ЖИЗНИ. Основные элементарные единицы, из которых строятся все живые организмы - это атомы и молекулы. Молекулы, входящие в состав живых организмов (белки, нуклеиновые кислоты и др.) отличаются от молекул неживой природы прежде всего большими размерами. Например, молекулярная масса молекулы миозина, входящая в состав мышечных волокон ~ 500 000 а.е.м. Шесть легких элементов периодической системы Менделеева: водород (1Н ), углерод (6С), азот (7N) , кислород (8О), фосфор (15Р) и сера (16S) играют совершенно исключительную роль в биосистемах. Из Н, С, О строятся углеводы и липиды, входящие в состав клеточных и внутриклеточных мембран. В состав белков входят: H, C, O, N, S. В состав нуклеиновых кислот: H, C, O, N. P. Фосфор входит также в состав жизненно важных молекул, переносящих энергию в БС. Кроме указанных выше элементов, составляющих основу живой материи, в живых организмах играют существенную роль небольшое количество положительных ( катионы ) и отрицательных ( анионы) ионов атомов других элементов : кальций ( 20Са ), составляющий ~ 2 % веса человеческого тела, калий ( 19К ) ~ 0, 35 % , натрий ( 11Nа ) ~ 0, 1 % , магний ( 12M g ) ~ 0, 06 % . Они играют важную роль при регулировании мембранной и мышечной активности, проводимости нервного импульса и других явлениях. Другие катионы - железо (26Fe ), медь (29Сu), цинк (30Zn), кобальт (27Со), марганец (25Мn), молибден (42Мо) - содержатся в ничтожных количествах ( менее 0, 001 %). Но и они играют большую роль как активаторы многих ферментов. Из простых анионов важную роль играет хлор - он составная часть всех биологических растворов. Ничтожные количества йода, брома и фтора также необходимы живым организмам. 4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АТОМОВ В МОЛЕКУЛАХ И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В БИОСИСТЕМАХ. 4.1. Дисперсионные или вандерваальсовы взаимодействия. Атомы и нейтральные молекулы притягиваются на больших расстояниях и отталкиваются на малых. Такие силы притяжения, не приводящие к образованию химических соединений, называют силами Ван – дер – Ваальса. Потенциальная энергия межмолекулярных взаимодействий как функция расстояния между 19 центрами молекул может быть аппроксимирована название потенциала Леннарда - Джонса : U функцией, получившей A D  r12 r 6 , где. А и D - величины, зависящие от свойств молекул. Первый член соответствует силам отталкивания, а второй - силам притяжения. Силы отталкивания быстро нарастают при проникновении электронных оболочек взаимодействующих атомов. Рис. Зависимость потенциала U(r) межмолекулярного взаимодействия Леннарда-Джонса от расстояния r между молекулами. Расстояние r = σ — наименьшее возможное расстояние между неподвижными молекулами, ε — глубина «потенциальной ямы» (энергия связи молекул). Рис. Взаимодействие неполярных молекул При взаимодействии неполярных молекул их притяжение на больших расстояниях вызывается малой взаимной деформацией электронных оболочек. Взаимодействия между электронами и ядрами приводит к взаимной поляризации молекул (смещению отрицательных зарядов относительно положительных): 20 Рис. Поляризация. Возникающие наведенные электрические дипольные моменты ориентированы так, что вызывают притяжение, пропорциональное произведению коэффициентов поляризуемости αi молекул. Так возникают дисперсионные силы (термин связан с тем, что коэффициенты  i определяют оптическую дисперсию - показатель преломления n ). В случае полярных молекул в энергию вандерваальсового взаимодействия вносит вклад также ориентационное взаимодействие (эффект Кеезома), энергия которого так же убывает, как ~ r -6. Притяжение между электрическими диполями наибольшее, когда их противоположные концы обращены друг к другу. Согласно расчетам Кеезома (с учетом тепловых флуктуаций ориентации диполей ) вклад ориентационного взаимодействия молекул «а» и «b» в коэффициент D при не очень низкой температуре : d a2 d b2 D 3kT где da и db - эл. дипольные моменты , kТ - энергия теплового движения. Кроме взаимодействия постоянных диполей, вклад в D будет давать взаимодействие постоянного диполя одной молекулы с индуцированным им дипольным моментом другой молекулы. Такой поляризационный эффект (эффект Дебая) будет пропорционален произведению поляризуемостей на квадрат дипольных моментов, т.е. D   a d b2   b d a2 Основную роль при вандерваальсовом взаимодействии молекул играют дисперсионные силы и лишь в случае молекул, обладающих большими дипольными моментами (> 2 Д), ориентационное взаимодействие может вносить заметный вклад. Поляризационное взаимодействие, как правило, незначительно: Dдисп > Dориент > Dполяр . Ван-дер-Ваальсово взаимодействие является наиболее общим межмолекулярным взаимодействием. Оно играет очень большую роль в биосистемах. Вандерваальсово взаимодействие относится к типу слабых. При сближении молекул за счет вандерваальсовых сил выделяется энергия (7 100) х 10-3 эв. В то время как при образовании химической связи ~ 1 эв. Если молекула находится в возбужденном дипольном состоянии (колебательное или электронное возбуждение с переменным электрическим дипольным моментом), то возникает дополнительное взаимодействие с такой же невозбужденной молекулой с помощью резонансного взаимодействия. Величина этого взаимодействия: db2 E ~ 3, r 21 т.е. оно более дальнодействующее (до 50 - 100 Å ), чем вандерваальсовы силы (~ r -6 ). Поэтому резонансное взаимодействие играет очень большую роль в органических системах, вызывая перемещение энергии и другие эффекты. 4.2. Водородные связи между молекулами. Исключительно большое значение в биосистемах имеет особый тип межмолекулярного взаимодействия - водородная связь , которая осуществляется между атомами водорода, химически соединенными в одной молекуле и электроотрицательными атомами F, O, N, Cl, S , принадлежащими другой молекуле. Примеры: молекула пиридина. H H С Н С H H C N С H C H N С C C H C H H C H Рис. Молекула пиридина Атом азота N в пиридине имеет два внешних электрона с антипараллельными спинами, не участвующими в образовании химической связи. Эта «свободная» или «не поделенная» пара электронов будет притягивать протон, и образовывать с ним химическую связь. При этом молекула пиридина перейдет в ионное состояние (С5 N H6)+. Если имеются две пиридиновые молекулы, то они будут соревноваться в захвате протона, в результате образуется соединение, в котором тремя точками обозначен новый тип межмолекулярного взаимодействия, называемый водородной связью. В таком соединении протон находится ближе к одному из атомов азота (либо левому, либо правому, с одинаковой вероятностью). Следовательно, потенциальная энергия протона как функция расстояния до правого или левого атома при фиксированном расстоянии между ними (~ 3.10 А) должно изображаться кривой с двумя минимумами. Причиной связи является вызываемое протоном перестроение электронной плотности между атомами азота. Энергия типичных водородных связей варьируется в пределах от 0,13 до 0,31 эВ. Она на порядок меньше энергии химических (ковалентных) связей, но на порядок больше BдB – взаимодействий. 22 Рис. Потенциальная кривая энергии протона в зависимости от расстояния между атомами азота двух пиридиновых молекул.(Квантовомеханический расчет Рейн и Харрис). 2,76 А -0,017 Н О Н -0,017 Н + 0,022 -0,036 О +0,038 Н +0,09 Рис. Распределение электронной плотности между атомами в димере воды. Roo ~ 2.76 Å < 2 RВдВ ~ 3.86 Å . RВдВ соответствует радиусу молекулы в плотно упакованном молекулярном кристалле. С помощью водородной связи образуется димер воды (Н2О)2 с энергией связи ~0,2 эВ. (Рис.) При образовании водородных связей меняется электронная плотность на всех атомах. О роли всех атомов в установлении водородных связей в комплексе можно судить также по взаимному влиянию двух водородных связей между азотистыми основаниями входящими в состав двойной спирали молекулы ДНК. 23 Рис. Водородная связь между азотистыми основаниями. Наряду с обычной (слабой) водородной связью, образование которой сопровождается слабыми энрговыделениями ( <1 эВ) и характеризующаяся потенциальной энергией с двумя минимумами, водород образует некоторые комплексы с большим энерговыделением (> 1 эВ). Образуемый при этом тип (связи) взаимодействия называется сильной водородной связью. При этом потенциальная энергия протона имеет один сравнительно плоский минимум, расположенный примерно в центре связи. Слабая водородная связь (в отличие от сильной) имеет решающее значение во всех живых организмах. Исключительно большая роль водородной (слабой) связи в БС обусловлена, прежде всего, тем, что она определяет вторичную структуру белков, имеющих основное значение для всех жизненных процессов; с помощью водородных связей удерживаются пары в основании ДНК и обеспечивается их устойчивая структура в виде двойных спиралей. Наконец, водородная связь ответственна за весьма необычные свойства воды, важные для существования живых систем. 5. ВОДА И ЕЕ РОЛЬ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ. Вода – один из главных компонентов всего живого. Организмы животных почти на 2/3 состоят из воды. Человеческий эмбрион в течение 1-го месяца жизни содержит ~ 93% воды. Без воды не было бы жизни. Вода служит основной средой, в которой происходят биохимические реакции в клетке. Она образует исходную часть крови и лимфы. Расщепление углеводов, белков и жиров происходит с присоединением молекул воды, поэтому вода необходима для пищеварения. Физические свойства биополимеров и многих надмолекулярных структур (в том числе и клеточных мембран) весьма существенно зависят от их взаимодействия с водой. Рассмотрим некоторые свойства воды. Каждая молекула воды обладает большим электрическим моментом. Вследствие большой электроотрицательности атомов кислорода молекула воды может образовывать водородные связи с одной, двумя, тремя и четырьмя другими молекулами воды. В результате образуются сравнительно устойчивые димеры и другие полимерные комплексы. В среднем каждая молекула в жидкой воде имеет 4-е соседа. Состояние и структура надмолекулярных комплексов зависят от температуры воды.  = 110о =0о 24 а. в. Рис. Ориентация водородной связи в а) димере и б) линейной молекуле В жидкой воде имеются линейные и циклические димеры и другие комплексы, содержащие 3, 4, 5, 6 и более молекул. Существенно, что в зависимости от числа молекул в цикле меняется угол , образованный между связью ОН и водородной связью Оказывается, что наибольшая энергия одной водородной связи соответствует углу  = 0. Вообще же качественная зависимость энергии водородной связи от угла  имеет вид: Рис. Качественная зависимость энергии водородной связи от угла  Наличием водородных связей обусловлены уникальные свойства многих веществ, в том числе воды. Трехатомная молекула Н 2О образует четыре водородные связи. В их образовании принимают участие оба атома водорода, а атом кислорода, имеющий две неподеленные электронные пары, образует две водородные связи с атомами водорода соседних молекул воды. Если бы не было водородных связей, то температуры плавления и кипения воды были бы существенно ниже, как это наблюдается у других водородных соединений неметаллов. 25 Рис. Водородные связи между молекулами воды Сильные водородные связи между молекулами воды препятствуют ее плавлению и испарению. Водородные связи являются причиной и другого уникального свойства воды при плавлении ее плотность возрастает. В структуре льда каждый атом кислорода связан через атомы водорода с четырьмя другими атомами кислорода - из других молекул воды. В результате образуется очень рыхлая "ажурная" структура. Вот почему лед такой легкий. При плавлении льда около 10% водородных связей разрушается, и молекулы воды немного сближаются. Поэтому плотность жидкой воды при температуре плавления выше, чем плотность льда. Дальнейшее нагревание, с одной стороны, должно вызывать увеличение объема воды. Это происходит со всеми веществами. Но, с другой стороны, водородные связи продолжают разрушаться, а это должно приводить к уменьшению объема воды. В результате плотность воды изменяется неравномерно. Наибольшее значение (1,00 г/мл) она имеет при температуре 4 oС. Такова зимняя температура вблизи дна пресноводных водоемов, где скапливается вода с максимальной плотностью. При замерзании вода расширяется и занимает больший объем. Плотность льда (0,92 г/мл) - меньше, чем плотность жидкой воды. Поэтому лед плавает на поверхности воды. Если бы у льда была более высокая плотность, по мере замерзания он опускался бы на дно, что сделало бы жизнь в водоемах зимой невозможной. Наличие водородных связей влияет и на кислотные свойства многих веществ. Фтороводородная кислота, в отличие от других галогеноводородных кислот является слабой так как атомы водорода связаны сразу с двумя атомами фтора, что препятствует их отщеплению (по той же причине большинство карбоновых кислот являются слабыми). Благодаря особо прочным водородным связям фтороводородная кислота - единственная одноосновная кислота, способная образовывать кислые соли, например NaHF2. 26 Вследствие дипольного характера молекул воды и большой роли водородных связей, исключительно важную роль играют взаимодействия молекул воды с ионами и нейтронами молекул в живых организмах. 6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МОЛЕКУЛ И ИОНОВ С ВОДОЙ. 6.1. Гидратация ионов в воде. Электрические дипольные моменты воды обуславливают е высокую диэлектрическую проницаемость (ε = 79). В электрическом поле иона полярные молекулы воды частично «выстраиваются» так, что в значительной мере экранируют это поле. Такой процесс образования ориентированного окружения вокруг иона получило название гидратации или сольватации. Полному «выстраиванию» дипольных моментов воды в поле иона препятствуют водородные связи между молекулами и тепловое движение. При сравнительно простом электростатическом расчете энергии гидратации на основе учета взаимодействия иона с диполями молекул воды получаем: U  rH2O 127,2 ri  rH 2O  p 2 , где ri -кристаллографический радиус иона; ≈ 1.93 Ả; p = 0.25 для катионов и анионов. 6.2 Гидрофобные и гидрофильные взаимодействия. «Поведение» полярных и неполярных молекул в воде различно. Это объясняется тем что контакт между неполярными (большими) молекулами и водой определяется повышением свободной энергии и термодинамически невыгоден. Взаимодействия между молекулами воды и большими нейтральными молекулами значительно слабее, чем взаимодействие молекул воды между собой, обусловленных водородными связями. Внедрение больших молекул в воду должно приводить к разрыву водородных связей, поэтому эти молекулы выталкиваются (подобно маслу) из воды. Говорят, что они выталкиваются под влиянием гидрофобных взаимодействий. Главной причиной гидрофобных взаимодействий является относительно большое количество водородных связей между молекулами воды (это не относится к малым неполярным молекулам, которые могут размещаться в «пустых» промежутках между большими ассоциатами молекул воды, понижая при этом свободную энергию за счет ВqВ - взаимодействий и повышения энтропии смешивания.) Полярные молекулы сравнительно легко растворяются в воде. Растворимость в этом случае обусловлена выигрышем свободной энергии при ориентации молекул воды в электрическом поле полярных молекул. При этом говорят, что проявляется гидрофильное взаимодействие. Во многих случаях крупные биологические молекулы (например, липиды) имеют гидрофобные и гидрофильнае участки . При очень малой концентрации такие молекулы растворяются в воде. Однако, начиная с некоторой концентрации, 27 они образуют скопления мицеллы, в которых гидрофильные участки группируются на поверхности, а гидрофобные остаются внутрь. 6.3. Электролиты. Вследствие явления гидратации полярные молекулы в воде диссоциируют на ионы, так - как уменьшение свободной энергии при образовании ионами гидратных оболочек больше энергии связи ионов в молекуле. Так в чистой воде происходит диссоциация. H 2O  H   OH   (В этой реакции вода – кислота) При 25о С концентрация этих ионов очень мала H   OH    10   7 моль / л Обычно ион водорода (протон) в воде находится в виде иона гидроксония (Н3О)+: (В этой реакции вода основание)  H 2O  H   H 3 O   Для характеристики степени диссоциации указывают значение отрицательного десятичного логарифма концентрации протонов. Эта величина обозначается буквами рН. Для воды:  1  pH  lg    7  H    7. БЕЛКИ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ 7.1. Белки Белковые молекулы (Б.М.) являются самыми крупными, самыми сложными и разнообразными из всех молекул, входящих в состав клеток живых организмов. Молекулярные массы Б.М. варьируют от нескольких десятков тысяч до нескольких миллионов дальтонов. По мере усложнения атомных систем они приобретают новые качества: понятия температуры, энтропии, звуковых волн (фононов) и других элементарных коллективных возбуждений применимы к системе атомов и молекул, но не применимы к одному атому. Также и Б.М. обладают рядом свойств, присущих всей молекуле в целом и её окружению. Б.М. тесно связаны с основными проявлениями жизни. Некоторые белки – кератин, коллаген и другие являются важными, хотя и инертными компонентами живых организмов. Они входят в состав структурных и соединительных тканей – кожи, волос, шерсти, рогов, перьев, костей и др. и обеспечивают взаимосвязь 28 различных органов живых организмов, их механическую целостность и защиту от внешних влияний. Все химические процессы в клетке осуществляются при участии белков – ферментов. Белки осуществляют также контроль всех процессов жизнедеятельности любых живых организмов от простейших бактерий до человека. Ферменты являются основными участниками расщепления белков, поступающих в организм в виде пищи, на более мелкие структурные единицы аминокислоты и построения из аминокислот новых белков, необходимых организму. Белки ответственны за клеточные и внутриклеточные движения. Сократительные белки - миозин, актин, тропомиозин и тропонин - входят в состав мышечных волокон, жгутиков и ресничек (у низших животных). Они осуществляют превращения химической энергии в механическую энергию разнообразных форм движения живых организмов. Б.М. в комплексе с липидами клеточных и внутриклеточных мембран обеспечивают активный транспорт веществ в клетку и из неё. Они участвуют в процессе дыхания, обеспечивающем окисление пищи с целью обеспечения энергией всех потребностей живого организма. Б.М. гемоглобина переносят кислород к клеткам. Некоторые специальные белковые молекулы защищают организм от чужеродных белков, выполняя важную иммунологическую функцию. Все рецепторы органов чувств (зрения, слуха, обоняния, вкуса и т.д.) являются белками. Все биологические процессы ускоряются и замедляются в живых системах под влиянием универсального механизма контроля, зависящего от способности белковых молекул переходить из одной формы в другую под влиянием слабых внешних воздействий. 7.2 Структура белков Аминокислоты. Белки являются полимерными молекулами. Все поистине бесконечные в своем разнообразии белки, входящие в состав живых организмов на Земле построены из небольшого числа (~ 20) аминокислотных остатков. Молекулы аминокислот (кроме глицина), оптически активны. Они вращают плоскость поляризации света влево и поэтому называются левыми (L - изомер, энантиомер). Каждая аминокислота состоит из аминогруппы (NH2) и карбоксильной группы (СООН), присоединённых к атому углерода, который называется С  - углеродом. К С  присоединен также атом водорода и одна из 20 групп атомов, которыми аминокислоты отличаются друг от друга. Эту группу принято обозначать R и называть боковой цепью или радикалом. Центральный атом углерода С  , связанный одинарными связями с четырьмя атомами или группами атомов называют асимметричным атомом углерода. Химическую формулу аминокислоты можно записать в виде: 29 R NH2 С H COOH R R | С С | NH2 H COOH | | | | H NH2 HООС зеркало L - изомер D -изомер Рис. Зеркальные изомеры – энантиомеры аминокилот Аминокислоты и их обозначения (русские и международные). А. Нейтральные 1. (Гли)цин (GLY); 2. (Ала)нин (ALA) 3. (Вал)ин (VAL) 4. (Лей)цин (LEU) 5. (Изолей)цин (ILE) 6. (Фен)илаланин (PHE) 7. (Три)птофан (TRY) 8. (Сер)ин (SER) 9. (Тре)онин (THR) 10. (Мети)онин (MET) 11. (Цис)теин (CYS) 12. Глутамин (глутаминил) (GLN) 13. Аспаргин (Аспн) (ASN) A. 14. 15. 16. Кислотные Аспаргиновая кислота (Асп) (ASP) Глутаминовая кислота (Глу) (GLU) (Тир)озин (TYR) B. 17. Щелочные (Гис)тидин (HIS) 30 18. 19. (Лиз)ин (LYS) (Арг)нин (ARG) В некоторых случаях в состав белковых молекул могут входить вместо аминокислот иминокаслота - (Про)лин, отличающийся от аминокислот тем, что у нее к азоту присоединен только один атом водорода. Химическая формула пролина - Про(PRO ) имеет вид: H2C CH2 H2C NH Cα H COO СООH В водном растворе при некотором значении pH аминокислоты находятся в состоянии биполярного иона (цвиттериона): NH3+ R Cα H COO- При образовании цвиттериона протон отщепляется от карбоксильной группы, а протон из раствора присоединяется к аминогруппе. Молекула сохраняет электронейтральность, однако приобретает большой электрический дипольный момент. NH3+ R Cα H COOH Значение pH, при котором аминокислоты находятся в состоянии цвиттериона, называется изоэлектрической точкой. При понижении pH (добавлении в раствор кислоты) протон из раствора присоединяется к группе COO - и молекула становится положительным ионом. При повышении pH (добавлении в раствор щелочи) происходит отрыв протона от аминогруппы и молекула приобретает отрицательный заряд: R NH2 Cα 31 H COO- Изменение pH может переводить и некоторые радикалы R в ионные состояния за счет присоединения или отщепления протона (при добавлении щелочи или кислоты). 7.3. Первичная структура белков Живая материя строится из огромного количества разнообразных по величине, составу и форме белковых молекул. Так в организме человека содержится более 105 различных белков. Как отмечалось выше, все белки состоят из 20 более простых единиц, называемых аминокислотными остатками. Образование белков из аминокислот происходит в клетках живых организмов путем последовательной полимеризации аминокислот в присутствии катализаторов. При каждом присоединении новой аминокислоты тратится от 0.14 до 0.21 эВ. Полимеризация двух аминокислот сопровождается образованием молекулы воды при отщеплении водорода от аминогруппы и гидроксила OH от карбоксильной группы другой. При этом азот и углерод аминокислотных остатков соединяются между собой, образуя пептидную связь. Возникающий димер имеет на одном конце аминогруппу, а на другом карбоксильную группу и может таким же образом присоединять к себе другие аминокислоты. Этот процесс полимеризации при наличии катализаторов и энергии может повториться многократно. Полимерные цепи, содержащие менее 100 аминокислотных остатков, называются полипептидами. Образованные в биосистемах полимерные цепи, содержащие более 100 аминокислотных остатков, называются белками. Некоторые белки содержат сотни тысяч аминокислотных остатков. Названия аминокислотных остатков, входящих в состав белков, образуются из названий соответствующих аминокислот путем добавления окончания "ил": аспаргин - аспаргинил; глутамин - глутаминил и т.д. Специфичность полипептидов и белков определяется составом и последовательностью расположения аминокислотных остатков. Эта последовательность называется первичной структурой белка. Так как все аминокислотные остатки отличаются только радикалами, то белки являются квазипериодическими структурами. 32 H R H O NH2 COOH N C C  C C N C   H R O H H R Рис. Полипептидная цепь с двумя пептидными группами. Четыре атома HNCO, входящие в БМ в виде повторяющихся структур, называют пептидной группой (ПГ). Рис. Пептидная (или амиднаяй) группа. Белок, состоящий из n аминокислотных остатков, содержит (n-1) пептидную группу ПГ. Все атомы входящие в ПГ лежат в одной плоскости. Распределение плотности заряда около атомов ПГ (на Рис), показывает, что ПГ обладает дипольным электрическим моментом ≈ 3,5-4D. Одним из замечательных свойств клеток организмов является то, что они создают или поглощают аминокислоты и связывают их в нужной последовательности в БМ. Некоторые одноклеточные организмы (например, бактерии) способны синтезировать все необходимые им аминокислоты из простейшей пищи. Высшие животные утратили способность создавать некоторые аминокислоты (триптофан, лизин и др). Эти аминокислоты являются (их называют) незаменимыми. Они должны быть получены с пищей. Человеку требуется ≈ 1 г. в день незаменимых аминокислот. Их организм получает путем расщепления (переваривания) белков нужного состава с пищей. Расщепление происходит с помощью ферментов. Все белки в воде находятся в метастабильном состоянии. Их гидролиз распад с присоединением молекул воды происходит с выделением свободной 33 энергии Гиббса, так как свободная энергия продуктов меньше свободной энергии расщепления белков. Из-за очень большого потенциального барьера такой энергетически допустимый распад происходит крайне медленно. Без ферментов переваривание пищи происходило бы крайне медленно - в течении нескольких лет. С помощью ферментов расщепление белков осуществляется очень быстро в "обход" потенциального барьера. Характерной особенностью пептидных групп (ПГ) является их способность образовывать водородные связи друг с другом, с молекулами воды и с другими молекулами, содержащими электроотрицательные атомы O, N... Вследствие наличия простых одинарных связей каждой ПГ с соседними атомами углерода Cα плоскости ПГ могут поворачиваться вокруг этой связи относительно друг друга. Ограничение на (вращение) повороты оказывает только взаимодействие между соседними радикалами (стерические препятсвия). Благодаря возможности вращения вокруг одинарных связей С- Сαα и СN (Рис) пептидная цепь оказывается весьма гибкой структурой. В растворе устанавливается форма, которая соответствует минимуму свободной энергии Гиббса, обусловленной внутримолекулярным взаимодействием с окружением. Образующаяся конфигурация БМ называется вторичной структурой. 7.4. Вторичная и более высокого порядка структуры Б.М. Биосинтез белковых молекул происходит в рибосомах клеток путем последовательного соединения пептидной связью аминокислотных остатков. Последовотельность их расположения определяется молекулами ДНК, м-РНК и другими, несущими наследственную информацию. По мере синтеза полипептидная связь как бы «выползает» из маленькой рибосомы в цитоплазму. В цитоплазме гибкая молекула белка принимает ту или иную форму – конформацию, или вторичную структуру, при сохранении всех ковалентных связей, обусловленных ее первичной структурой. Сравнительная гибкость больших Б.М. проявляется в наличии многих возможных конформаций, переходящих одна в другую при изменении внешних условий. Этим Б.М. существенно отличаются от малых органических молекул. Одной из наиболее важных вторичных структур Б.М. является αспиральная структура (Полинг, Кори, 1953). Она возникает под действием внутримолекулярных водородных связей между ПГ белка. Сворачивание пептидной цепи в спираль (α-спиральная структура) обусловлена тремя цепочками водородных связей между ПГ. Первая цепь связывает водород первой ПГ (1.Н) с кислородом четвертой (4.О); (4.Н) с (7.О) и т.д. Вторая цепь водородных связей осуществляется между: (2.Н) – (5.О); (5.Н) – (8.О) и т.д. 34 Третья цепь: (3.Н) – (6.О); (6.Н) – (9.О). В результате образуется правая спираль с шагом 5.6 А0 и диаметром 4.56 А0 . период спирали 28 А0 . На пять оборотов спирали приходится 18 остатков аминокислот. Все радикалы располагаются с наружной стороны спирали. Рис. α-спиральная структура Энергия образования одной водородной связи между ПГ эВ. Следовательно, эта водородная связь относится к типу слабых. Связь С=О В ПГ характеризуется частотой колебаний (Амид-1) 1660 см-1. Колебание Амид-1 имеет энергию, равную 0.21 эВ и большой электрический дипольный момент 0.29D. Он направлен вдоль связи С=О. Количественный анализ (вторичной структуры) белков в водных растворах и кристаллах может быть основан на измерениях поляризации и интенсивности полосы поглощения, обусловленной колебаниями Амид-1. Большинство белков при физиологическом значении pH несет суммарный отрицательный заряд. (7-7.5). При изгибах полипептидной цепи и последующем сближении отдельных ее участков возможно образование поперечных водородных связей между ПГ, а не продольных (как в α - спиралях). В этом случае оба участка полимерной цепи выстраиваются параллельно или антипараллельно друг другу. Такой тип водородных связей называется β-формой: Рис. β-формой В образовании стабильной формы белковой молекулы с нарушенными участками α-спиральной структуры существенную роль играют ее гидрофобные и гидрофильные взаимодействия с водой. Эти взаимодействия приводят к тому, что молекула сворачивается в клубок – глобулу, у которой на поверхности в основном располагаются участки с гидрофильными радикалами (глутамин, тирозин и др), а внутри гидрофобными радикалами (лейцин, аланин, фенилаланин и др). В общем случае вторичные (вторичная, третичная) структуры БМ обусловлены ее первичной структурой, т. е. Составом и расположением 35 аминокислотных остатков вдоль ее полипептидной цепи. Другими словами: в одинаковых внешних условиях белки с разной первичной структурой имеют разные вторичнуые (вторичную и третичную) структуры – конформации. Такая конформация соответствует минимуму свободной гиббсовской энергии системы, состоящей из белковой молекулы ее окружения. Поскольку форма Б.М. существенно зависит от ее взаимодействия с внешней средой (вода, другие молекулы), то один и тот же белок может иметь различную конформацию в разных внешних условиях. В некоторых случаях несколько пептидных цепей объединяются за счет дисульфидных мостиков (химическая связь, возникающая между атомами серы двух радикалов (S-S), водородных, ионных связей и вандерваальсовых взаимодействий в единую молекулу. Таковы, например, молекулы гемоглобина Hb, входящие в состав красных кровяных телец (эритроцитов) крови, которые состоят из четырех пептидных цепей. В этом случае говорят о четвертичной структуре белка. К молекулам, обладающим такой структурой относятся многие ферменты, катализирующие биологические реакции в клетках. Наличие у белков четверичной структуры исключительно важно для их физиологической активности. Белковые молекулы объединяются иногда в более сложные структуры. Например, α-спиральные структуры часто скручиваются попарно во вторичные спирали. Глобульные БМ могут сами образовывать спиральные структуры. Такова, например, структура активных нитей в мышечных волокнах. Вторичные и более высокого уровня структуры обусловлены слабыми водородными связями, гидрофобными, гидрофильными и ВдВ – взаимодействиями. Поэтому так же структуры нарушаются при нагревании до 60-700 С. Для разрушения первичной струкуры без участия ферментов необходимы более высокие температуры. Процесс разрушения вторичной и более высокого уровня структур, при сохранении первичной структуры БМ, называется денатурацией белков. Вареная или жареная пища содержит денатурированные беки. Денатурация может происходить при облучении УФ и др., воздействии солей тяжелых металлов и некоторых органических соединений. При денатурации белок утрачивает свои биологические функции. 7.5 Некоторые биологические функции белков. Белки, запасающие и переносящие кислород.У высших животных с помощью кровеносной системы кислород доставляется ко всем тканям, где требуется использовать химическую энергию окисления для выполнения различных физиологических функций. Кислород переносится красными кровяными тельцами крови (эритроцитами) от легких ко всем видам ткани. Один эритроцит крови содержит около 280 миллионов (2.8*10 8) белковых молекул (БМ) гемоглобина. Относительная молекулярная масса такой БМ около 65500 Дальтон. В состав одной БМ входит 9512 атомов: Fe4 C3032 H4816 O872 N780 S8. Каждый из четырех атомов железа лежит в центре 36 группы атомов, называется гемом. Гем придает крови красную окраску. Гем входит в состав белковой цепи называется глобином. Четыре цепи глобинов состоят из двух тождественных пар. Две из них называются -цепями, а две другие  -цепями. Все четыре цепи содержат 574 аминокислотных остатков и располагаются в виде тетраэдра. Из-за небольшого различия - и -цепей этот тетраэдр не вполне правильный. Молекула гемоглобина обладает почти сферической формой с размерами 64х55х50 А0. Гемы имеют плоскую структуру и лежат в отдельных «карманах», немного выступая на поверхность молекулы. В красных мышцах позвоночных содержится более простая молекула – миоглобин, состоящая только из одной полипептидной цепи с одним гемом, содержащим атом железа. Миоглобин присоединяет и обратимо отдает молекулу кислорода, выполняя функцию резерва – хранителя кислорода. Этот кислород используется мышцами при резком увеличении мышечной деятельности запасается в свободном состоянии мышцы. Атомы, входящие в состав гема имеют плоскую структуру и лежат, погруженные в складку белковой цепи (глобина) (Рис). Рис. Молекула миглобина Миоглобин человека, тюленя, лошади, рогатого скота имеют одинаковую структуру. Гем прадставляет собой ферропорфирин – порфириновый комплекс двухвалентного (или ферро) иона жнлнза. Ион Fe2+ имеют шесть d-электронов и находятся недалеко от центра плоского пофиринового кольца. В порфириновом кольце ион Fe2+ удерживается (координационными) связями с четырьмя атомами азота. Пятая (координационная) связь направлена перпендикулярно плоскости кольца, связывая ион железа с атомом азота аминокислотного остатка – гистидила белковой группы молекулы. Шестая связь (координационная) либо свободна, либо связывает молекулу кислорода. 37 Рис. Ферропорфирин – порфириновый комплекс двухвалентного иона железа, входящий в состав гемов гемоглобина и миоглобина. Двухвалентный ион железа Fe2+ приобретает способность удерживать молекулу кислорода O2, когда он входит в состав гема и глобина. Один гем не присоединяет кислород. Только специфическое окружение белком – глобином – делает такое обратимое присоединение возможным. Процесс обратимого присоединения молекулы кислорода называется оксигенацией. Она не является процессом окисления, который обусловлен отрывом электрона и переходом двухвалентного иона Fe2+ в трехвалентное состояние Fe3+. (Такое истинного окисление происходит при извлечении иона Fe2+ из гема и соприкосновения его с воздухом). При оксигенации ион Fe2+ смещается в плоскость порфиринового кольца. При освобождении кислорода ион Fe2+ выступает из плоскости кольца на 0.8 А0 в направлении азота гистидила. Степень оксигенации как функция парциального давления молекулярного кислорода описывается простой гиперболической кривой. p Y ( p)  kp Вначале количество присоединенного кислорода увеличиваются линейно с ростом давления. А затем скорость нарастания присоединенного кислорода уменьшается, так как часть миоглобина уже присоединила кислород. Наконец наступает насыщение – все молекулы Мb захватили кислород. (->MbO2). В этом случае Y(p)=100%. Гемоглобин в составе эритроцитов переносит кислород от легких ко всем тканям и частично участвует в переносе углекислого газа. Если бы не было гемоглобина, то литр артериальной крови мог растворить и перенести не более миллилитра кислорода. Присутствие гемов увеличивает это количество в 100 раз. 38 Рис. Зависимость оксигенации 1-миоглобина; 2-гемоглобина от парциального давления p кислорода. В гемоглобине (Hb) четыре гема присоединены к четырем полипептидным цепям, каждая из которых похожа (но не тождественна) миоглобину (Mb). Присоединение молекулы кислорда происходит к каждому из четырех гемов. Реакция присоединения кислорода сопровождается изменением цвета крови. Гемоглобин, содержащий, кислород называют оксигемоглобином (HbO2). Он придает крови ярко-алый цвет. Гемоглобин без кислорода имеет более темный цвет. При присоединении к гему O2 образует шестую (координационную) связь с ионом железа. Одновременно изменяется структура гемоглобина. В α-цепях Hb полость между спиральными участками, в которых помещается диск гема, достаточно широка, и молекула O2 может присоединяться к иону железа без препятствий. В  -цепях полости, в которых находятся гемы, недостаточно широки для беспрепятственного вхождения O2. Присоединение О2 в этом случае осуществляется только после конформационного изменения молекулы Hb, вызванного присоединением кислорода к α-цепи. Рентгенографическим исследованиями установлено, что при присоединении трех молекул О 2 к гемоглобину происходит разрыв связей (мостиков), соединяющих α -цепи и смещение обеих цепей друг относительно друга. Изменение четвертичной структуры молекулы Hb при присоединении трех молекул О 2 увеличивает вероятность присоединения четвертой молекулы в 70 раз по сравнению с вероятностью присоединения первой молекулы. Это замечательное свойство молекулы Hb отражает взаймосвязь (кооперативность) четырех структурных единиц. В результате такой взаимосвязи физиологическая активность молекулы Hb носит положительный кооперативный характер. Положительная кооперетивность проявляется в том, что зависимость степени окисления от парциального давления p кислорода является не гиперболической функцией (как у Mb), а функцией: 39 Y  ( p)  p k  p где α = 2,8 (уравнение Хилла), которая имеет на графике s-образную форму. Особенность этой функции в том, что в некоторой области значений р она имеет перегиб. В этой области незначительные изменения р приводят к очень большим изменениям Y+(p). Такая особенность оксигенации гемоглобина имеет важное физиологическое значение: для изменения степени оксигенации Mb (миоглобина, без кооперативности) с 10% до 90% (от величены насыщения) необходимо 81-кратное изменение давления кислорода, а для Hb (есть положительная кооперативность) в таком случае необходимо только 3-х кратное увеличение давления. Положительная кооперативность гемоглобина позволяет ему взять полную нагрузку кислорода в легких, перенести и отдать его почти целиком тканям даже в том случае, когда давление кислорода различается незначительно. Потеря положительной кооперативности мутантным гемоглобоном сопряжена с очень тяжелым заболеванием. Кроме структурных изменений при присоединении молекулы кислорода к гему происходит отщепление протонов от гистидилов, расположенных в контакте с гемом. Это явление называется эффектом Бора. Поскольку вероятность отщепления протонов от гистидилов зависит от концентрации протонов в растворе – pH, то сродство гемоглобина кислороду так же зависит от pH среды. Оно максимально при pH ≈9 и минимально при pH≈ 6. Гемоглобин также участвует в переносе углекислого газа CO2 от тканей обратно в легкие. Парциальное давление CO2 в тканях равно ≈ 60 мм. рт. ст., а в легких оно ≈ 47 мм.рт.ст. Молекулы CО2 свободно проникают через клеточные мембраны. Биокатализаторы – ферменты. Одно из наиболее важных свойств живых организмов (бактерий, растений и животных) состоит в способности в обмену веществ обменом веществ или метаболизмом, называют химическую деятельность клеток, обеспечивающую их существование, рост, возбудимость, подвижность, воспроизведение, приспособление к изменяющимся условиям (жизнь). Омен веществ у всех живых организмов осуществляется при помощи особых молекул – биологических катализаторов. Катализом называется явления ускорения химической реакции без изменения ее общего результата Биологические катализаторы синтезируются клетками и называются ферментами. Некоторые ферменты состоят из белка, обычно свернутого в глобулу. Многие другие ферменты состоят из двух компонентов: 1)основная непременная компонента состоит из полипептидных цепей (белок) и называетя аноферментом; 2) Вторая компонента состоит из органических молекул меньших размеров и называется коферментом. В этом случае каталитическое действие проявляет только совместная система: анофермент+кофермент. Часто в состав коферментов входят ионы некоторых элементов (магний, железо, кобальт, медь идр.). Тогда их называют 40 просте__ческими группами. Каталитическое действие ряда ферментов проявляется только а присутствии некоторых ферментов (Ca2+ Mg2+ Cl- и др.). Молекулы, подвергающиеся действию ферментов называются субстратами. Образующиеся в резултате каталитической реакции вещества назыв продуктами. Назвение фермента связывается с реакцией, которую он катализирует. Обычно фермент называется именем субстрата, на который действует фермент, с прибавлением суффикса «аза». Например, фермент, расщепляющий сахарозу на глюкозу и фруктозу, называется сахаразой. Ферменты отличаются от обычных катализаторов в неживой природе исключительно высокой эффективностю и большой спецефичностью. Во многих случаях фермент катализирует только одну вполне определенную реакцию. Клетка средних размеров содержит около 3*10 3 различных ферментов. Каждый из них катализирует отдельную химическую реакцию. Многие ферментативные процессы представляют собой последовательность несвольких реакций, в которых образуются промежуточные продукты. Субстрат образует связь с небольшим вполне определенным участком поверхности фермента, который называется активным центром. Однако за каталитические свойства ответственна вся огромная молекула фермента. Белки-ферменты имеют относительную молекулярную массу от 10 до 100 тысяч (или более). Субстратами обычно являются соединения с молекулярной массой от 100 до 1000. Иногда ферменты действуют на очень большие молекулы ДНК, целлюлоза и т.д. при этом только малая часть этих молекул присоединяется к активному центру фермента. При связи фермента с субстратом образуется промежуточный комплекс (ФСК), который затем распадается на первоначальный фермент и продукты реакции (фермент сохраняется и его количество). Ферментативная активность является одной из наиболее важных биологических функций белков (глобулярных). Контролируемые ферментами реакции лежат в основе всех явлений жизни: рост, дыхание, мышечные сокращения, проведение нервного возбуждения, пищеварения, фотосинтеза и т.д. Ферменты регулируют (ускоряют или замедляют) все биологические процессы: биосинтез других молекул и самих ферментов; процесс запасания и использования химической энергии; процесс перемещения ионов через мембраны в сторону увеличения концентрации и т.д. Фермент не может вызывать новых реакций. Он лишь ускоряет те реакции, которые возможны и без участия фермента, однако без фермента они происходят исключительно медленно из-за очень больших энергетических барьеров. Комплекс фермет+субстрат существует временно – порядка нескольких миллисекунд (≈ 10-3 с). Он не влияет на равновесие реакции межу начальным и конечным продуктом, определяемое только разностью их свободных энергий. Однако благодаря образованию комплекса фермента с субстратом скорость протекания реакции увеличивается во много раз. Например: гидролиз мочевины. 41 Хотя и сопровождается с выделением энергии ≈ 0.6 эВ, в обычных условиях происходит крайне медленно, т.к. требует болшой энергии активации. Ферменты уреаза ускоряет эту реакцию в107 раз. Обычно эффективность фермента с повышением температуры возрастает, а затем резко падает, т.к. происходит денатурация белка. Для температур ниже температуры денатурации зависимость константы скорости реакции от температуры выражается эмпирической формулой (закон Аррениуса) E* k  A * exp(  ) (1) RT Где Е* - энергетическая активация одного моля субстрата, или энергетический барьер реакции; R – газовая постоянная; T – абсолютная температура. Согласно закону Аррениуса каталитическое действия фермента на химическую реакцию сводится формально к уменьшению энергии активации – снижению энергии (высоты) потенциального барьера. Это весьма условное определение действия фермента. Оно не отражает молекулярного механизма протекания процесса ферментативного катализа, как и любое другое рассмотрение, использующее термодинамическое описание с помощью параметров равновесных состояний. Полное понимание (процессов) явления возможно только на пути объединения термодинамического описания с описанием на молекулярном уровне структурных преобразований, происходящих с молекулами фермента, субстрата и продуктов реакции. Согласно законам термодинамики, при постоянном давлении и температуре в химической реакции (С→А+В) распад молекулы С на молекулы А и В устанавливаются равновесные молярные концентрации [C]p, [A]p, [B]p, определяемые изменением стандартной (гиббсовской) свободной энергии (т.е. относящейся к стандартным словиям: t≈250C, p=760 мм.рт.ст. G0  G0 ( A  B)  G0 (C) С помощью соотношений: (2) К К К K [ A] p [ B] p [C ] p  exp(  G0 ) RT где К – константа равновесия реакции. При отрицательном значении ∆G0 распад молекулы С энергетически невыгоден. 42 Энергетическая схема реакции С→А+В при отрицательном изменении стандартной гиббсовской свободной энергии G0 и энергетическом барьере Е*. Если первоначальные концентрации не удовлетворяют равенству (2), то реакции происходит до тех пор пока равенство не установится. Однако, закон термодинамики не могут определить время установления равенства в системе. В ряде случаев из-за большого потенциального барьера реакции с большим отрицательным изменением стандартной свободной энергии годами и десятилетиями не могут достигнуть равновесия. Если бы не было энергии активации, то все химические реакции в живых организмах немедленно пришли бы в равновесие. Все белковые молекулы распались бы на аминокислоты, и живые существа деградировали бы с переходом в наиболее вероятное состояние, соответствующее минимуму свободной энергии. Ферменты необходимы для регулирования как скорости реакции так и последовательности их осуществления. Как отмечалось ферменты могут ускорят только энергетически возможные реакции, т.е. реакции, протекающие при постоянном давлении и температуре с уменьшением свободной энергии. Большое значение в живой природе имеет контролируемые ферментами реакции с повышением свободной энергии, если они сопрягаются с другими реакциями компенсирующими повышение свободной энергии в реакциях первого типа. Если реакция не может протекать самопроизвольно, то подключение новой реакции с большим выделением свободной энергии может вызвать эту реакцию, если обе реакции имеют общий промежуточный компонент. Скорость течения таких реакций определяется соответствующими ферментами. При осуществлении энергетически невыгодных реакций в клетках используется сопряжение их с реакцией гидролиза АТФ: АТФ+Н2О АДФ+фосфат (3) Изменением свободной энергии ∆G0= -0.32 эВ, необходимость для компенсации увеличения свободной энергии в сопряженных реакциях. Сопряженная реакция (3) с другими осуществляется путем передачи фосфатной группы. Такой процесс называется фосфорилированием. Процесс фосфорилирования – перенос фосфатной группы – играет важную роль в сопряжении химических реакций типа сборки макромолекул из мономеров. 43 Для объячнения специфики работы ферментов предлагались различные гипотезы и механизмы: 1. Фишер, 1894г. Гипотеза жестких шаблонов, или статической системы «ключ-замок», согласно которой фермент может выполнять каталитическое действие только втом случае, когда форма субстракта точно соответствует форме реакционного центра фермента. Однако эта гипотеза не может объяснять многие особенности ферментативных реакций. 2. Эринг, Ламри, Спайкс, 1954г. Механизм «дыбы». Процесс разрыва некоторых связей в молекуле субстрата они объясняют натяжением, возникающим в субстрате при его одновременном присоединении в нескольких местахфермента. При этом трудно объяснить освобождение продуктов реакции, поскольку для разрыва связей путем натяжения необходимо прочное присоединение субстрата к ферменту. Для понимания ферментативной активности необходимо рассматривать конформационное поведение макромолекулы белка. Конформационная лабильность белка обеспечивает возможность его специфического взаимодействия с субстратами и другими лигандами. в некоторых конформациях белок более эффективно связывает субстрат. Одновременно происходит отбор конформаций субстрата. В ФСК отбираются те конформации белка и субстрата, которые находятся в структурном соответствии друг с другом, обеспечивающем оптимальное значение свободной энергии взаимодействия. При образовании ФСК происходит взаимная "подгонка" конформации белка и субстрата, т.е. их специфический отбор. Широкое применение физических методов исследования – флуоресцентных и стековых меток – позволили установить, что присоединение субстрата к активному центру фермента может существенно изменить окружение метки, присоединенной в другом месте фермента. Доказано, что локальные микрохимические изменения белковой молекулы, вызванные присоединением низкомолекулярного лиганда, способны приводить к существенным конформационным изменениям (перестройкам) биополимеров. Гипотеза не статического, а индуцированного структурного соответствия между ферментом и субстратом развивалась Кошландом: соответствие фермента и субстрата является динамическим, а не статическим. Согласно гипотезе о конформационном преобразовании ферментов, должны существовать "регуляторные" молекулы, которые, не участвуя в химической реакции, могут контролировать активность ферментов, изменяя их форму. В биологических системах наиболее важной группой таких молекул являются гормоны. Выделяясь в малых количествах, они играют исключительную роль в процессах регуляции в клетке. Поскольку гормоны не расходуются, то они могут оказывать действие снова и снова. Все гормоны – органические вещества. Некоторые из них – белки, другие – более простые соединения (аминокислоты и стероиды). Гормоны синтезируются в клетках некоторых органов (эндокринные железы) живого организма. Путем диффузии или с потоком крови они переносятся к другим 44 частям организма, где регулируют и координируют действие клеток даже при ничтожно малых концентрациях. Таким образом, гормоны обеспечивают химическую координацию во всем организме, дополняя координацию, осуществляемую нервной системой. В отличие от быстрой регуляции со стороны нервной системы, регуляция гормонами осуществляется медленно и длительно. Некоторые молекулы, присоединяясь к ферментам, изменяют их форму так, что нарушается либо каталитическая функция, либо функция присоединения. Такие молекулы называются ингибиторами. В некоторых случаях ингибитор прекращает каталитическую функцию фермента путем присоединения к активному центру. В этом случае говорят, происходит конкурентное ингибирование. Если место активного центра и место присоединения ингибитора расположены на разных участках поверхности фермента – неконкурентное ингибирование. Место на поверхности фермента, к которому присоединяется регулирующая молекула – активатор, или неконкурентный ингибитор, называется регулирующим, или аллостерическим центром. Конформационное изменение аллостерического центра при присоединении регулирующей молекулы вызывает изменение активного центра. В ряде случаев такие изменения (и другие изменения формы) передаются вдоль белковой молекулы на расстояние  40  60 Ǻ. Существенно, что в глобулярном ферменте передача изменения формы направлена в определенную область (активный центр), при этом другие области остаются неизменными. Величина смещений атомов в активном центре  1 10 Ǻ. По-видимому, рецепторные белковые молекулы, входящие в органы чувств (зрение, обоняние, вкус, слух и др.), также меняют свою конформацию под влиянием внешних воздействий (свет, молекулы, звуковые колебания и др.), что приводит к возникновению соответствующих нервных импульсов. 7.6. Аллостерические ферменты. Кооперативность Среди ферментов особое место занимают ферменты, обладающие четвертичной структурой, то есть состоящие из несколький субъединиц (протомеров), каждая из которых может проявлять каталитическое действие. В этом случае присоединение субстрата к одной или нескольким субъединицам изменяет свойства активных центров других субъединиц (гемоглобин). Следовательно, сами молекулы субстрата оказывают регулирующее (аллостерическое) действие на молекулу фермента. Такие ферменты называются аллостерическими. Аллостерический эффект представляет собой важнейший механизм обратной связи на молекулярном уровне. Возможно, аллостерическими свойствами обладают функциональные белки биомембран и сократительные белки. Согласно современным представлениям в основе аллостерических эффектов лежит возможность передачи конформационных изменений вдоль белковых молекул. Выяснение на молекулярном уровне характера таких изменений и возможностей их передачи без нарушения со стороны теплового 45 движения молекул является одной из центральных задач биофизических исследований. Гемоглобин – классический пример аллостерического изменения при присоединении лиганов. Аллостерический эффект обычно связан с кооперативностью каталитического действия фермента. Известно три типа конформационных изменений фермента при присоединении субстрата: 1. Первая молекула субстрата изменяет субъединицу фермента,к которой она присоединена, но не изменяет других субъединиц, поэтому они присоединяют субстрат так же, как и первая. В этом случае отсутствует кооперативность. Зависимость числа N(C) катализируемых субстратов от их концентрации [C] изображается гиперболическим законом: N C   C  K  C  2. Первая молекула субстрата, изменяя конформацию первой субъединицы, изменяет и конформацию соседних так, что они становятся более восприимчивыми к присоединению и катализу субстрата, чем первая. Присоединение второго субстрата еще более усиливает такую восприимчивость и т.д. в зависимоти от числа субъединиц в ферменте. В этом случае зависимость числа катализируемых субстатов N(C) от [C] изображается S-образной кривой: c , N C   K  c    1  Следовательно, фермент проявляет положительную кооперативность. 3. Первая молекула субстрата, присоединяясь к одной из субъединиц фермента, вызывает конформационное изменение, которое индуцирует в других субъединицах изменение активных центров, делающих их менее привлекательными для субстатов. Следовательно, присоединение других молекул субстрата менее благоприятно, чем первой молекулы. Зависимость числа катализируемых субстратов от их концентрации описывается соотношением: c ,   1 N C   K  c    В этом случае говорят, кооперативностью. что фермент обладает отрицательной Отрицательная кооперативность впервые была обнаружена Конвеем и Кошландом в 1968 году при исследовании фермента глицеральдегид-3фосфатдегидроденазы. Позднее отрицательная кооперативность была обнаружена и у других ферментов. 46 N+ N N Рис. Три типа кооперативность; кооперативность; кооперативности ферментов: N  – N – нет кооперативности; N  – положит. отрицат. На рис. изображены три кривые, характеризующие процент насыщения N ферментов субстратами в зависимости от их концентрации. Из рисунка следует, что при изменении концентрации в два раза (от 1 до 2) в случае положительной кооперативности полное насыщение фермента изменяется от 12 до 78%, при отрицательной кооперативности — от 48 до 60%, а при отсутствии кооперативности — от 40 до 68%. Особенно большой положительной кооперативностью обладает фермент, преобразующий уридинтрифосфат (УТФ) в цитидинтрифосфат (ЦТФ). Он состоит из четырех субъединиц. Изменение концентрации субстрата в 1,5 раза изменяет его уровень активности от 10 до 90%. С другой стороны, ферменты с отрицательной кооперативностью весьма мало чувствительны к изменению окружающей среды. В нескольких случаях фермент обладает несколькими активными центрами для катализа разных субстратов. Так, например, исслеисследуя фермент СТР-синтетазу, Ливитский и Сталлкан в КалифорнийКалифорнийском университете обнаружили, что каждая его субъединица имеет активные центры для присоединения трех субстратов: уридинтрифосфата (УТФ), аденозинтрифосфата (АТФ) и глюмина. Кроме того, имеется также место для присоединения активатора — молекулы гуанозинтрифосфата (ГТФ). Молекула ГТФ активирует фермент путем повышения эффективности реакционного центра глютамина на той же субъединице. Одновременно происходит дезактивация ГТФ активного центра на другой субъединице. При этом активные центры для субстратов АТФ и УТФ своей субъединицы остаются неизменными. Таким образом, эффект присоединения глютамина проявляется на расстояниях 40—60 Д и не вызывает изменения расположенных на расстоянии 4—5 А других активных центров. Фермент ЦТФ-синтетаза проявляет большую положительную кооперативность по отношению к субстратам АТФ и УТФ. Присоединение первой молекулы АТФ изменяет форму молекулы так, что последующие молекулы АТФ присоединяются очень быстро. В связи с этим можно 47 обнаружить только свободные ферменты и ферменты, присоединившие четыре молекулы АТФ. Эта положительная кооперативность указывает, что фермент очень чувствителен к малым изменениям количества молекул АТФ. Наоборот, активатор — молекула ГТФ — вызывает конформационные изменения, приводящие к отрицательной кооперативности. Следовательно, фермент мало чувствителен к большим флуктуациям концентраций ГТФ в окружающей среде. Полная нечувствительность могла бы привести к синтезу молекул ЦТФ в отсутствии активатора ГТФ. Это нежелательно, так как обе молекулы ЦТФ и ГТФ необходимы для синтеза молекул РНК. Таким образом, свойство кооперативности позволяет повысить и понизить чувствительность ферментов по отношению к некоторым субстратам, активаторам и ингибиторам. Таким образом, свойство кооперативности позволяет повысить или понизить чувствительность фермента по отношению к некоторым субстратам, активаторам и ингибиторам. Имеет место параллелизм между активаторами и ингибиторами и положительной и отрицательной кооперативностью. Однако это не должно заслонять их дополнительную роль. Активатор включает действие фермента, ингибитор его выключает. Кооперативность же повышает или ослабляет чувствительность фермента, в том числе и к изменению числа этих регуляторов. Все виды контроля в биосистемах осуществляются ферментами, антителами, рецепторами и другими молекулами, в состав которых входят белки. Во всех этих случаях процесс регуляции непосредственно связан с конформационными изменениями молекул. Несмотря на исключительную важность ферментативного катализа, аллостерического эффекта и явления кооперативности в биологических процессах, теоретическое описание этих процессов на молекулярном уровне еще отсутствует. В большинстве современных моделей, рассматривающих взаимодействия белков с лигандами, используется феноменологическое термодинамическое описание. Оно относится только к равновесным состояниям и не объясняет явлений на молекулярном уровне. Используемое в теории статистическое описание требует отказа от индивидуализации элементов ансамбля. При этом, однако, теряется возможность исследования многих физиологических свойств биологических систем, которые, как правило, весьма гетерогенны. Их биологические функции существенно зависят от состава и пространственного расположения отдельных элементов, между которыми действуют весьма разнообразные силы. Скорость реакций, катализируемых ферментами, зависит от концентрации фермента, субстрата и необходимых регуляторов (кофакторов). Для повышения скорости катализа в клетке высокая концентрация метаболитов поддерживается не во всей клетке, а в отдельных ее отсеках, где происходят реакции. Если несколько ферментов катализируют цепь реакций, в которой продукт первой реакции служит субстратом для второй и т. д., то говорят, что эти ферменты образуют мультиферментную систему. В этом случае 48 повышение скорости катализа обеспечивается тем, что ферменты присоединяются к мембране на возможно меньшем расстоянии. К мультиферментам относятся различные системы транспорта электронов (цепь дыхательных ферментов, цепь ферментов, осуществляющих перенос электронов при фотосинтезе, ферменты, осуществляющие биосинтез некоторых липидов и т. д.). Пространственная близость соседних компонентов мультиферментных систем имеет особое значение в тех случаях, когда в реакциях образуются нестабильные промежуточные продукты. Например, в процессе транспорта электронов по ыхательной цепи митохондрий образуются свободные радикалы, такие как семихиноны. В свободном виде в растворе семихиноны существуют очень малое время, поэтому уменьшение расстояния, проходимого при их диффузии, крайне важно. Многие ферменты связаны с внутренней или внешней поверхностью .мембраны. Они катализируют реакции, целиком протекающие по одну сторону мембраны. Имеются также ферменты, проходящие через всю толщу мембраны. Они принимают субстрат на одной стороне мембраны и выделяют продукт на противоположной стороне. Такие ферменты называются векторными. Вследствие ограниченной проницаемости мембраны векторные ферменты обеспечивают образование концентрационных градиентов. Примером такой системы является (Na+ + К+) -АТФаза плазматических мембран, вызывающая векторное движение ионов Na+ и К+ в противоположных направлениях, если на внутренней стороне мембраны имеются ионы Mg+2, АТФ и Na+, а на наружной поверхности мембраны К+. Уабаин ингибирует эту реакцию только со стороны внешней поверхности мембраны. 7.7. Контроль биохимических реакций Поведение живых организмов отличается большой приспособляемостью к изменяющимся окружающим условиям. Эта приспособляемость обусловлена саморегуляцией интенсивности протекающих в них биохимических реакций. В ответ на повышенную необходимость в расходовании кислорода при интенсивной работе сердце увеличивает частоту сокращений; при приеме пищи увеличивается интенсивность выделения пищеварительных ферментов; повышение количества сахара в крови вызывает увеличение секреции инсулина поджелудочной железой; порез кровеносного сосуда вызывает преобразование протромбина в тромбин, который приводит к созданию тромба в месте пореза и т. д. Способностью к саморегуляции обладает не только организм в целом, но и его отдельные клетки. Каждая клетка является автоматической саморегулирующейся системой. Она экономно извлекает из внешней среды нужные химические вещества и освобождается от переработанных продуктов. В клетке синтезируются белки, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, в клетке же происходят химические преобразования, обеспечивающие ее энергией. Различные процессы, происходящие в клетке, взаимосвязаны и требуют тщательной регулировки. Такая регулировка осуществляется посылкой 49 определенных сигналов, которые воспринимаются особыми приемниками, преобразующими сигналы в активные действия. В биологических системах интенсивность химических реакций определяется наличием соответствующих ферментов. При этом процесс регуляции деятельности ферментов может осуществляться двумя путями: изменением концентрации ферментов и изменением активности ферментов (активация и ингибирование). Моно с сотрудниками [197] в Пастеровском институте в Париже открыл явление подавления активности ферментов при повышении концентрации продуктов реакции выше некоторого уровня. Они как бы посылают сигналы ферментам о том, что дальнейшее повышение их концентрации не нужно. Было обнаружено, что когда среда, в которой культивировались бактерии E-coli, содержала избыток аминокислоты триптофана, клетки прекращали синтез фермента триптофансинтетазы, который участвует в синтезе этой аминокислоты. Такой же эффект наблюдался при исследовании Умбергером и его сотрудниками синтеза бактерией E-coli аминокислоты изолейцина ILEU. Молекулы ILEU, меченые радиоактивными атомами, добавлялись в среду, в которой культивировались бактерии. Оказалось, что при увеличении концентрации молекул ILEU выше некоторой предельной бактерии прекращают синтез этих молекул. Таким образом, концентрация молекул ILEU являлась сигналом, контролирующим их синтез. Умбергер с сотрудниками показал, что присутствие избытка аминокислоты проявляется в двух процессах: 1) подавляется активность ферментов, участвующих в синтезе аминокислоты; 2) прекращается синтез самих ферментов. Выяснилось также, что эти два механизма регуляции действуют совершенно независимо. Влияние концентрации молекул на процесс их синтеза клетками обнаружен не только у бактерий, но и у клеток других организмов. Иногда повышение концентрации некоторых молекул вызывает не подавление, а повышение активности ферментов. Например, избыточное количество глюкозы приводит к повышению активности ферментов, участвующих в образовании запасов гликогена. Ферменты синтезируются на бактериальных хромосомах. Моно Жакоб в Пастеровском институте показали, что скорость синтеза фермента контролируется «регуляторным геном» хромосомы, а его структура — «структурным геном». Оба гена пространственно разделены в хромосоме. Парди, Жакоб и Моно далее показали, что процесс контроля скорости синтеза фермента осуществляется регуляторным геном путем синтеза «репрессивных» молекул, которые контролируют эффективность структурных генов. Действие репрессивных молекул на структурный ген не прямое. Они присоединяются к особому месту хромосомы — «оператору». После присоединения репрессивной молекулы к оператору, он выключает действие структурного гена и, следовательно, прекращает синтез фермента. Процесс повышения скорости синтеза ферментов сводится к подавлению активности репрессора. Зависимость активности ферментов от концентрации продуктов реакции была отмечена еще в 1950 г. сотрудниками Чикагского университета Новиком и 50 Сцилардом. Они показали, что избыток триптофана в бактерии E-coli немедленно останавливает его синтез. Следовательно, сигнал о избытке триптофана подавляет активность уже имеющихся ферментов. Умбергер показал, что при увеличении концентрации молекул изолейцина выше определенного уровня они ингибируют первый фермент в цепи синтеза. Оказалось, что процесс ингибирования не требует затраты энергии. Контролирующая система может не только подавлять, но и повышать активность ферментов. Примером «положительного» контроля является запасание и использование клеткой животного крахмала — гликогена. Клетки животных запасают энергию п форме гликогена. Гликоген синтезируетя от его предшественника — глюкоза-6-фосфата с помощью трех ферментов. Вначале глюкоза-6-фосфат преобразуется в глюкозу-1-фосфат, затем глюкоза-1фосфат преобразуется в уридиндифосфатглюкозу. Наконец, последний преобразуется в гликоген. Когда клетка хорошо снабжается пищевыми продуктами, она производит много глюкоза-6-фосфата. Большое количество этих молекул служит сигналом для стимулирования синтеза гликогена. Этот сигнал действует на третью ступень процесса — активирует фермент, преобразующий уридиндифосфатглюкозу в гликоген. С другой стороны, когда снабжение клетки пищевыми продуктами падает, возникает необходимость использования запасенного гликогена. Это осуществляется путем активации фермента гликогенфосфорилазы, который расщепляет гликоген. Фермент активизируется молекулами аденозинмонофосфата (АМФ). Молекулы АМФ являются продуктами гидролиза молекул аденозинтрифосфата АТФ при совершении клеткой какой-либо работы. Накопление молекул АМФ указывает, что клетка использовала энергетический источник в виде молекул АТФ. Молекула АМФ активирует гидролиз гликогена, выделяемая энергия используется для синтеза молекул АТФ. В некоторых случаях ингибирование и активация осуществляется одновременно. Например, при синтезе нуклеиновых кислот используется строго одинаковое число пуриновых и пиримидиновых оснований. Гергарт и Парди показали, что, хотя эти основания синтезируются при участии разных ферментов, они действуют согласованно. Повышение концентрации пуриновых оснований подавляет активность ферментов, участвующих в их синтезе, и активирует ферменты, участвующие в синтезе пиримидиновых оснований. Повышение концентрации пиримидиновых оснований вызывает обратный эффект. Как правило, ферменты, участвующие в процессах регуляции, относятся к типу аллостерических, т. е. проявляют свойства кооперативности. На основании анализа экспериментальных данных Моно, Жакоб и Шанже пришли к заключению, что передача сигнала от регулирующей молекулы к ферменту (активация или ингибирование) осуществляется с помощью непрямого (аллостерического) эффекта. Места присоединения регулирующей молекулы и субстрата пространственно разделены. «Передача сообщения» от регулирующей молекулы к ферменту сводится к его конформационному изменению. В качестве подтверждения этого заключения Шанже [97] 51 указывает на эксперименты Герхарта, которые показали, что фермент транскарбомилазы имеет места присоединения для субстрата и ингибитора на разных субъединицах молекулы. После разъединения субъединиц одна из них может присоединить только субстрат, а другая — только ингибитор. 7.8. Ферменты, расщепляющих белки В процессе жизнедеятельности в протоплазме клеток даже у нерастущих организмов происходит разрушение и синтез белков из аминокислот. Для синтеза белка определенного типа клетка должна иметь все аминокислоты, входящие в состав белка. Часть этих аминокислот синтезируется самой клеткой, некоторые же (незаменимые) должны извлекаться из пищи. Во время пищеварения белки, поступающие в организм, расщепляются на отдельные аминокислоты, из которых клетка синтезирует нужные ей белки. Процесс расщепления белков осуществляется различными ферментами, каждый из которых действует на пептидные связи, граничащие с определенными боковыми цепями аминокислот. У всех животных, от самых низших до наиболее сложно организованных, химия пищеварения и участвующие в ней ферменты очень сходны. Эти ферменты синтезируются клетками. У простейпростейших организмов (состоящих из одной клетки) синтез ферментов и пищеварение происходят в пределах этой же клетки. У многоклеточных животных синтез ферментов осуществляется внутри клеток, а пищеварение происходит в особой пищеварительной системе. При расщеплении белков на каждую пептидную связь затрачивается молекула воды. Водород присоединяется к азоту одной части, а группа ОН - к углероду другой части, в результате образуются две пептидные цепи с аминогруппой и карбоксильной группой на концах. Поскольку процесс расщепления белка связан с поглощением молекул воды, он называется гидролизом. Расщепление пептидных белков не требует затраты энергии, но требует обязательного участия ферментов. Ферменты — экзопептидааы — расщепляют только пептидные связи, соединяющие концевые аминокислоты с остальной пептидной цепью. Из них карбоксипептидаза отщепляет аминокислоту от свободной концевой карбоксильной группы, а аминопептидаза отщепляет аминокислоту от свободной концевой аминогруппы. Ферменты — эндопептидази — расщепляют только пептид-пептидные связи внутри пептидных цепей. К этим ферментам относятотносятся: пепсин, трипсин, химотрипсин и эластаза. Пепсин проявляет наибольшую активность в кислой среде (рН≈2). Он расщепляет пептидные связи, примыкающие к гидрофобным аминокислотным остаткам TYR и РНЕ, содержащим ароматические кольца. Химотрипсин расщепляет пептидные связи, примыкающие к большим гидрофобным боковым цепям аминокислотных остатков (TYR, РНЕ, MET, LEU,...). Эластаза расщепляет только пептидные связи, примыкающие к малым гидрофобным боковым це пям аминокислот GLY, ALA и SER. Наиболее селективным пищеварительным ферментом является трипсин. Он разрывает только связи, соседние с лизином или аргинином. Боковые цепи этих аминокислот сравнительно велики, 52 гидрофильны и несут положительный электрический заряд в щелочной среде. Трипсин и химотрипсин проявляют наибольшую активность в щелочной среде рН ≈ 8. Пепсин выделяется в желудок слизистой оболочкой желудка, а трипсин и химотрипсин выделяются в двенадцатиперстную кишку поджелудочной железой. Однако для предотвращения переваривания белков клеток, в которых они синтезируются, пищеварительные ферменты синтезируются и выделяются не в готовом виде, а в форме неактивных предшественников — пепсиногена, трипсиногена и химотрипсиногена. В пищеварительном тракте от предшественников пищеварительных ферментов отщепляются небольшие пептидные цепи, и они превращаются в активные ферменты. Пепсиноген с относительной молекулярной массой 42 500 превращается в пепсин с молекулярной массой 34 500 под действием имеющейся в желудке соляной кислоты, а также самого пепсина. Превращение трипсиногена в трипсин катализируется ферментом энтерокиназой. Этот фермент выделяется в очень малых количествах слизистой оболочкой желудка. Его функция состоит только в активации нескольких молекул трипсиногена. Образующиеся молекулы трипсина сами активируют другие молекулы трипсиногена и кимотрипсиногена. Из трех эндопептидаз — трипсина, химотрипсина и эластазы — пространственная структура фермента химотрипсина была определена первой. Это удалось сделать с помощью рентгеноструктурного анализа Блоу и его сотрудникам в Кембриджском университете. Затем группой Ватсона в Бристольском универуниверситете была определена пространственная структура фермента эластазы. Строуд, Кей и Дикерсон в Калифорнийском технологическом институте установили [234, 181] трехмерную структуру фермента трипсина. Исследование трехмерной структуры трипсина было особенно трудным из-за исключительной активности фермента. В щелочной среде в течение нескольких минут молекулы трипсина расщепляют друг друга. Пространственное строение всех трех ферментов в основных чертах одинаково. Каждая глобула стабилизируется шестью дисульфидвыми связями, водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. Еще до выяснения трехмерной структуры этих ферментов было установлено, что они теряют активность, если каким-либо образом изменить аминокислотные остатки: серии 195 и гистидин 57. Следовательно, можно было думать, что они входят в состав активного центра фермента. Молекула трипсина состоит из 223 аминокислотных единиц. По причине, которая будет указана ниже, нумерация аминокислот в полипептидной цепи фермента начинается от концевой аминогруппы, которой приписывается номер 16. После определения трехмерной структуры химотрипсина выяснилось, что и аспарагиновая кислота 102 также входит в состав активного центра фермента. Эти три аминокислотных остатка расположены сравнительно далеко друг от друга (на 57, 102 и 195-м местах) вдоль полипептидной цепи. Однако в ферментах, вследствие сворачивания полипептидных цепей, они оказываются соседними и действуют совместно при расщеплении субстратов. Каталитическое действие ферментов проявляется при вполне определенном расположении 53 фермента и субстрата. Это достигается присоединением субстрата к нескольким точкам поверхности фермента, включающим и его активный центр. Такая область фермента ответственна за «узнавание» своего субстрата. При исследовании пространственной структуры химотрипсина было найдено, что вблизи активного центра имеется глубокий гидрофобный «карман» на поверхности фермента. Блоу и его сотрудники предположили, что именно в этот карман входят большие гидрофобные боковые цепи субстратов, на которые действует фермент. Закрепление боковой цепи в кармане и взаимодействие с соседними местами активного центра обеспечивает точное расположение субстрата. Таким образом, глубокий гидрофобный карман на поверхности фермента отбирает для катализа только определенные места в полипептидной цепи. Аналогичное место «узнавания» имеется и у двух других эндопептидаз. В ферменте эластазы такой карман частично блокирован боковыми цепями аминокислотных остатков с номерами 216 и 226. Поэтому он может присоединить нужным образом гидрофобные боковые цепи аминокислотных остатков GLY, ALA и SER, имеющих малые размеры. В трипсине приемный карман не блокирован, но на его дне имеется боковая цепь аспарагиновой аминокислоты, несущая отрицательный электрический заряд. Поэтому трипсин катализирует только пептидные цепи, соседние с лизином или аргинином, боковые цепи которых имеют положительный электрический заряд. Исследование характера присоединения субстрата к ферменту кристаллографическими методами невозможно, так как комплекс фермент + субстрат сохраняется только в течение сотых долей секунды. В связи с этим проводится исследование стабильных комплексов ферментов с соответствующими ингибиторами — малыми пептидными молекулами, присоединяющимися к активному центру. 54 Рис. Механизм каталитического разрыва ферментом пептидной связи N-С (по Строуду). Согласно Строуду [234], механизм работы фермента трипсина можнр описать следующим образом. На первой стадии полипептидная цепь субстрата присоединяется к ферменту так, что боковая цепь аминокислотного остатка ARG или LYS с положительным зарядом входит в карман фермента с отрицательным зарядом. При этом соседняя пептидная группа HNCO присоединяется к активному центру, ¦ образованному аминокислотными остатками SER 195 и HIS 57 (рис.). Гидролиз пептидной связи начинается, когда кислород гидроксильной группы SER 195 образует химическую связь с углеродом пептидной группы субстрата. При этом двойная связь С=О в пептидной группе превращается в одинарную и углерод переходит в состояние тетраэдрической валентности с отрицательным зарядом на кислороде. Протон гидроксильной группы SER 195 образует химическую связь с правым атомом азота HIS 57, что приводит к перестройке водородной связи левого атома азота HIS 57 с атомом кислорода ASP 102 (рис. ). Образовавшееся промежуточное состояние неустойчиво. Водород от азота HIS 57 переходит к азоту пептидной цепи. Пептидная связь разрывается. Двойная связь между углеродом и кислородом снова восстанавливается. Остатки HIS 57 и ASP 102 возвращаются к первоначальному состоянию (рис. ), и первый фрагмент пептидной цепи с образовавшейся концевой аминогруппой NH2 удаляется от фермента. На этой стадии в реакцию вступает молекула воды из окружающей среды (рис. ). Ее протон связывается с правым атомом азота HIS 57 с одновременным преобразованием водородной связи между ASP 102 и левым атомом азота HIS 57. Гидроксильный ион ОН— молекулы воды присоединяется к углероду субстрата, который снова переходит в тетраэдрическое состояние с преобразованием двойной связи С=О в одинарную С—О~ (рис. ). Далее связь Н—О разрывается с освобождением водорода. Разрывается также связь С—О между оставшейся частью субстрата и SER 195. Протон от азота HIS 57 смещается к кислороду SER 195, вызывая перестройку водородной связи между HIS 57 и ASP 102 (рис.). Электростатическое отталкивание между отрицательными электрическими зарядами ASP 102 и образовавшимся вторым фрагментом полипептидной цепи с концевой карбоксильной группой освобождает фермент, который теперь может приступить к расщеплению другого белка. Авторы предложенного механизма ферментативной активности трипсина постулируют возможность согласованной перестройки водородных связей остатка аминокислоты HIS 57 с соседними аминокислотными остатками ASP 102 и SER 195. Они считают, что такая возвозможность обусловлена специальным окружением этих остатков аминокислот. Нет сомнения, что предложенный на молекулярном уровне механизм работы фермента трипсина представляет большой интерес, хотя и носит чисто 55 описательный характер. Это объяснение не учитывает конформационных преобразований фермента. Удалось также установить механизм активации трипсиногена, химотрипсиногена и эластогена. При синтезе в клетках подподжелудочной железы эти молекулы содержат со стороны иминоконцов начальные участки, состоящие из 15 аминокислот. Операция активации предшественников ферментов состоит в отрыве этих начальных участков от молекулы. Оставшиеся части, начинающиеся с номера 16, и являются активными ферментами. Рассмотренные выше пищеварительные ферменты относятся к большой группе ферментов, расщепляющих белки на отдельные фрагменты. Они теряют активность (ингибируются) при блокировании остатка аминокислоты серина. Поэтому они иногда называются «серино-ферментами». Повидимому, все они имеют активные центры, в которые входят такие же остатки аминокислот, как и у трипсина. Все эти ферменты расщепляют только пептидпептидные связи в белках. Они не затрагивают других связей между атомами в белках и всех связей в небелковых молекулах. Специфичность этих ферментов определяется различными свойствами «мест узнавания», к которым присоединяются только субстраты определенного типа. Кроме пищеварения серино-ферменты принимают участие во многих физиологических явлениях. Они участвуют в образовании и растворении кровяных сгустков, в иммунологических реакциях по отношению к чужеродным клеткам (антигенам) и организмам, в оплодотворении яйца сперматозоидом. Хотя эти ферменты выполняют различные биологические функции, они используют один и тот же способ действия — расщепление некоторых пептидных рвязей в белках. Исключительно важна роль сериноферментов как средства контроля над некоторыми физиологическими процессами. Эффективность такого контроля обусловлена тем, что их активность поддается очень тонкому контролю. Степень их активности легко управляется различными ингибиторами, которые могут иметь широкий спектр действия или, наоборот, быть специфичными, блокируя некоторые группы аминокислотных остатков или только одну. Очень важным свойством серино-ферментов, обеспечивающим их действие только в определенном месте и в определенное время, является то, что они синтезируются в виде неактивных предшественников и становятся активными, только подвергаясь действию других ферментов. В каждом случае процесс активации заключается в отщеплении небольшого участка пептидной цепи путем разрыва только одной пептидной связи. Одним из важных серино-ферментов является тромбин, участвующий в процессе свертывания крови человека и многих животных при повреждении ткани. Механизм свертывания крови очень сложен. Он состоит из нескольких последовательных реакций, в результате каждой из них образуется фермент, необходимый для последующей реакции. Тромбоциты, или кровяные пластинки, находящиеся в плазме крови, попадая в поврежденное место, разрушаются. При этом разрушении выделяется 56 тромбопластин, который катализирует превращение протромбина ( один из белков плазмы, синтезируемый в печени) в тромбин. Тромбин действует как фермент, катализирующий превращение фибриногена в фибрин. Фибриноген является длинной палочкообразной молекулой белка, растворенной в плазме крови. Относительная молекулярная масса фибриногена равна 33 000. Его растворимость обусловлена наличием в полипептидной цепи аминокислотных остатков аргинина и глицина, несущих электрические заряды. Тромбин еще более специфичен, чем трипсин. Он разрывает только четыре пептидные связи, находящиеся между аминокислотными остатками аргинина и глицина. Трипсин же расщепил бы эту молекулу на 150 фрагментов. При гидролизе этих связей освобождается четыре небольшие пептидные цепи, несущие электрические заряды. Потеряв аминокислотные остатки с элект рическими зарядами, фибриноген превращается в нерастворимый фибрин. Тромбин, как и трипсин, имеет вблизи активного центра приемный карман с аспарагиновой кислотой (ASP 189), к которому присоединяется аргининовая боковая цепь субстрата, однако, в отличие от трипсина, каталитическое действие тромбина проявляется только тогда, когда субстрат присоединяется также к другому месту фермента, которое может принять наименьшую боковую аминокислотную цепь — глицин. Образовавшиеся в результате действия тромбина молекулы фибрина связываются водородными связями в полимолекулярные комплексы. Одновременно тромбин активирует другой фермент — так называемый стабилизирующий фактор тромбина, который стабилизирует комплекс, связывая ковалентными связями кислотные цепи глутаминовых кислот с основными цепями лизинов соседних молекул. Между волокнами фибрина этого комплекса задерживаются красные и белые кровяные тельца, увеличивая плотность сгустка и образуя кровяной тромб. Растворение тромбов крови осуществляется серино-ферментом — плазминогеном. Он активируется так же, как трипсин, путем разрыва одной пептидной связи между аргинином и валином. Активированный фермент — плазмин — разрывает все пептид- пептидные связи, соседние с аргинином или лизином в молекулах фибрина. Патологическое свертывание крови в кровеносных сосудах (тромбоз) часто обусловлено высоким уровнем ингибиторов плазмина в крови. Гепаринполисахарид, извлекаемый из печени, подавляет превращение протромбина в тромбин. 8. ФИЗИКА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БИОСИНТЕЗА БЕЛКА Молекулярная биология исследует молекулярную природу основных явлений жизни, прежде всего наследственности и изменчивости. Эти явления наследственности и изменчивости определяются строением и свойствами нуклеиновых кислот – информационных макромолекул – РНК и ДНК. Гены – фрагменты молекул ДНК и РНК, программируют синтез белков. В предыдущих разделах были рассмотрены некоторые проблемы молекулярной 57 биофизики, связанные со строением и функциональностью белков. Теперь обратимся к физическим вопросам, относящимся к строению и свойствам нуклеиновых кислот, к биосинтезу белка. Физика сыграла важную роль в построении молекулярной биологии: открытие двойной спирали ДНК, сделанное с помощью рентгеноструктурного анализа; четко сформулированная проблема генетического кода. 8.1 Структура нуклеиновых кислот. Далеко не всегда связь между структурой молекулы и ее функциональными свойствами проста и очевидна. Мы видели, как сложно установление такой связи для белков. Иначе обстоит дело с нуклеиновыми кислотами, в частности, с ДНК. Здесь, по крайней мере, одна важнейшая функция – редупликация ДНК – была качественно объяснена сразу же после открытия вторичной структуры. Вторичная структура была установлена методом рентгенографии в работах Франклина, Крика, Уотсона, Уилкинда (1952 г.). Установлено, что ... ДНК построена в виде двойной спирали, состоящей из двух взаимно перевитых полинуклеотидных цепей, азотистые основания которых попарно соединены водородными связями: аденин (А) одной цепи связан с тимином (Т) другой, а гуанин (Г) – с цитозином (Ц). Рис. Схематическое изображение комплиментарных пар а –сахар, 3’– 4’– 5’ – фосфодиэфирные связи, -угол ориентации оснований. Пуриновые основания: (А)-аденин, (Г) – гуанин; пиримидиновые основания(Т)-тимин, (Ц)-цитозин, (У)-урацил. Рис. Схемы этих пар (уотсон-криковские пары). Две цепи ДНК в двойной спирали взаимно комплементарны, т.е. имеется однозначное соответствие между их нуклеотидами: Т соответствует А и Г соответcтвует Ц. 58 ДНК может кристаллизироваться в различных двуспиральных формах, отличающихся параметрами решетки: A, B, C, Z – формы. Они различаются значениями шага двойной спирали, углами поворота между соседними парами оснований и наклоном плоскости пар к оси спирали. Двойные спирали ДНК в А, В, С – формах – правые. Позднее была открыта (Рич) левая двойная спираль ДНК. Так как она зигзагообразна, эта форма была названа Z – формой. Очевидно, что имеются две возможности организации двойной спирали: из параллельных и антипараллельных цепей. Рис. Схемы двойных спиралей, построенных из антипараллельных (a) и параллельных (b) цепей. Справедливость модели (а) – антипараллельная цепь – доказана рентгенографическими и биохимическими данными: цепи в двойной спирали антипараллельны. 59 Специфическая двуспиральная структура ДНК непосредственно объясняет важные факты – репликацию ДНК при митозе и ее метаболическую устойчивость. По Крику и Уотсону, при репликации двойная спираль сначала разделяется вследствие разрыва водородных связей и раскручивания цепей. Каждая из них служит матрицей для сборки новой цепи, комплиментарной к матрице. Мономеры новой цепи соединяются с матрицей, образуя уотсон-криковские пары АТ, ТА, ГЦ и ЦГ. При этом образуются две двойных спирали, тождественные первоначальной.Такая полуконсервативная модель (новая спираль содержит одну старую и одну новую цепь) действительно подтверждается опытом. Ошибки при репликации являются точечными мутациями Рис. При репликации двойная спираль сначала разделяется вследствие разрыва водородных связей и раскручивания цепей Двойная спираль подобна одномерному кристаллу, азотистые основания в ней плотно упакованы и прочно связаны слабыми взаимодействиями. Этим объясняется метаболическая устойчивость ДНК и высокая сохранность генов. ДНК – самые большие молекулы, известные науке. Из фага Т2 были выделены кольцевые двуспиральные молекулы ДНК длиной до 49 мкм, а из E.coli – до 400 мкм, что соответствует молекулярной массе порядка 109 D . Рис. Положение ДНК в клетке Взаимодействие ДНК и РНК с малыми молекулами. В ряде случаев взаимодействие ДНК и РНК с малыми молекулами существенно влияет на биологическую функцию ДНК и РНК. Одни из малых молекул являются мутагенами, другие ингибируют транскрипцию. С другой стороны, молекулы 60 белков, которые также малы по сравнению с ДНК, связываясь с ДНК, регулируют основные молекулярно-генетические процессы. 8.2 Редупликация ДНК. При делении клеток генетический материал удваивается, происходит редупликация двойной спирали ДНК. В принципе, возможны три механизма редупликации: консервативный с сохранением исходной двойной спирали и построением дочерней двойной спирали, тождественной исходной; полуконсервативный, при котором две дочерних двойных спирали содержат каждая по одной новой и по одной старой цепи; и, наконец, дисперсный механизм с распределением исходного материала между четырьмя цепями двух дочерних двойных спиралей. Исследование редупликации ДНК при делении клеток E.coli (Месельсон, Сталь, 1958 г.) с помощью меченых атомов (15N), которые делились в среде растворов с 14N (но не с 15N!). Из исходной популяции, из популяции "детей" и "внуков" извлекались молекулы ДНК и определялись их плотность и радиоактивность. Исходная ДНК, меченая 15N, имела наибольшую плотность. ДНК "детей" оказалась меченой на половину и ее плотность равнялась среднему арифметическому от плотностей 15N-ДНК и 14N-ДНК. Наконец, ДНК "внуков" разделилась при седиментации на две зоны – зону ДНК, тождественной дочерней, меченной наполовину, и на зону с немеченой ДНК. Схематически это можно представить так: (15N 15N )  2(15N 14N )  2(15N 14N )  2(14N 14N ) Эти результаты согласуются с полуконсервативным механизмом и подтверждаются и другими данными. Рис. Редупликация. Репликативный синтез. Редупликация требует расплетания исходной двойной спирали. 61 Репликативный синтез идет с непременным участием ДНК-полимеразы, которая, по-видимому, перемещается вдоль двойной спирали, расплетая ее и синтезируя новые цепи (модель "застежки – молнии"). Полимераза, перемещающаяся вдоль двойной спирали, создает локальные условия, нарушающие баланс взаимодействий между цепями. Предположительно, она препятствует гидрофобным взаимодействиям оснований. Точный механизм редупликации ДНК in vido тем не менее нельзя считать установленным. Редупликация in vivo начинается на определенной стадии развития клетки с участием факторов, по-видимому, связанных с клеточной мембраной (модель репликона). 8.3 Проблема генетического кода. Ген есть часть макромолекулы ДНК, ответственная за синтез одной белковой цепи. ДНК содержит информацию о первичной структуре белка – генетическую информацию. Она записана в первичной структуре ДНК, т.е. в последовательности нуклеотидов. Каково соответствие между последовательностью нуклеотидов ДНК и последовательностью аминокислотных остатков в белковой цепи? В этом и состоит проблема генетического кода. Это физическая проблема: во-первых, ставится вопрос о соответствии информационного содержания ДНК и белка, во-вторых, о количественных соотношениях между нуклеотидами и аминокислотами, определяемых в конечном счете взаимодействием молекул в матричном синтезе белка, т.е. молекулярным узнаванием, в-третьих, возникает вопрос о физическом смысле генетического кода, в-четвертых, о его эволюционном происхождении. Проблема генетического кода была впервые сформулирована физиком Гамовым (1953г.). Белковый текст написан алфавитом из 20 букв, текст ДНК (или РНК) – из четырех. Очевидно, что кодовое соотношение, т.е. число нуклеотидов, кодирующих один аминокислотный остаток, не может быть меньше трех, т.к. число сочетаний из четырех по два = 4 2 = 16 < 20, а число сочетаний из четырех по три = 4 3 = 64 > 20. Гамов предположил, что белковая цепь собирается непосредственно на двойной спирали ДНК. Причем каждая аминокислота располагается в выемке между четырьмя нуклеотидами. Эта выемка имеет примерно ромбическую форму. Два нуклеотида принадлежат одной цепи, два – другой. Один из нуклеотидов первой цепи образует уотсон-криковскую пару с нуклеотидом второй цепи. "Бубновый" код Гамова обеспечивает именно 20 букв. Каждая буква, т.е. ромб, состоит из четырех нуклеотидов. Число сочетаний из четырех по четыре = 4 4 =256. Но имеются ограничения, так как малая диагональ ромба обязательно соединяет А с Т или Г с Ц. Если считать тождественными правые и левые формы ромба, например, Г Г А----------Т = Т------------А А А 62 то получится лишь 20 различных ромбов. "Бубновый" код перекрывающийся. Так как в каждый ромб входят нуклеотиды из трех последовательных пар, два нуклеотида, находящиеся на одной стороне ромба, являются общими для двух соседних ромбов. Тем самым возникает коррелляция между двумя соседними аминокислотными остатками: за каждым остатком может следовать не любой из двадцати, но лишь некоторые. Однако, дальнейшие исследования показали, что перекрывающийся код нельзя согласовать с опытом, т.к. любой аминокислотный остаток может следовать за любым. А Т А Т А Г Ц А Т Ц Г Рис. Схема расположения «букв» в бубуновом коде Гамова Кодовое отношение было найдено экспериментально в результате генетического исследования, проведенного Криком с сотрудниками (1961 г.). Основные результаты этих исследований объясняются, если допустить, что: код триплетный (кодоны), неперекрывающийся и "читаемый" подряд, начиная с некоторого фиксированного нуклеотида. Представим цепь ДНК последовательностью букв АВСАВС... На месте каждой буквы может находиться любой из четырех нуклеотидов А, Т, Г, Ц. Чтение кода начинается с определенной буквы, эквивалентно наложению на эту последовательность рамки с прорезью. Если одна из букв выпала (-) или, напротив, добавилась новая (+), то вся последовательность , начиная с места мутации, искажена, и нормальный белок не может синтезироваться. Доказано, что код не имеет "запятых", т.е. материальных элементов, разделяющих кодоны. Кодонами называются тройки следующих друг за другом нуклеотидов, кодирующие аминокислотные остатки. Общее число различных кодонов = 4 3 = 64. В связи с этим встал вопрос о вырождении кода. Так как общее число кодонов (64 = 61+3 "стоп") больше числа аминокислот (20), то нужно выяснить, сколькими различными кодонами кодируется каждый аминокислотный остаток (возможно, несколькими > 1 – "вырождение"! употребляется здесь в физическом, а не в биологическом смысле). В дальнейшем это и другие положения были многократно подтверждены: генетический код является триплетным, неперекрывающимся, лишенным запятых и вырожденным. Код универсален для всех организмов, начиная с вирусов и кончая человеком. 8.4 Биосинтез белка. Полная расшифровка кода потребовала прямых биохимических опытов, ставших возможными лишь в результате раскрытия механизма 63 биосинтеза белка. Само существование фиксированной первичной структуры у белковой цепи доказывает, что в клетке должна быть заложена программа построения этой структуры. "Текст" не может возникнуть в результате случайных встреч аминокислот, подобно типографскому тексту он должен набираться на некоторой матрице. Матрицами служат молекулы ДНК и РНК. Для "набора текста" необходим генетический код. Матричный принцип биосинтеза белка является основным для молекулярной биологии и молекулярной биофизики. Информация, содержащаяся в генах, т.е. в ДНК, передается матричной мРНК в процессе транскрипции. Синтез белка происходит именно на м РНК. Так называемая "центральная догма" молекулярной логики выражается схемой передачи генетической информации: ДНК→ РНК→белок Информация никогда не может быть передана от белка к нуклеиновой кислоте. В 1970 году была открыта обратная транскрипция – передача генетической информации от РНК к ДНК, но, однако, никак не противоречит "центральной догме", которая, конечно, не догма, а является законом природы. Рис. Стадии биосинтеза белка: транскрипция (и редупликация), образование полисомы и сборка белковой цепи Матричная, или информационная, РНК переносит генетическую информацию от хромосом, в которых она хранится, к рибосомам, на которых и реализуется биосинтез. Для биосинтеза необходим исходный материал – аминокислоты – и выполнение надлежащих термодинамических и генетических условий. Аминокислоты фигурируют в клетке в свободном виде. Их прямая поликонденсация сопровождается увеличением свободной энергии (≈12 кДж/моль) при образовании пептидной связи в клетке. Поликонденсация 64 аминокислот сопряжена с реакцией деформирования АТФ. Энергия, необходимая для биосинтеза, запасается в химической связи между аминокислотой и тРНК. Для каждой аминокислоты существует одна или несколько специфических тРНК. Транспортные РНК (тРНК) составляют около 10% общего количества РНК в клетке. Имеются 20 семейств тРНК в соответствии с двадцатью аминокислотами. Вторичная структура различных тРНК, в принципе, однотипна. Очевидно, что это должно быть так для выполнения молекулами тРНК их функций – узнавание кодона мРНК в рибосоме и включение аминокислоты в белковую цепь. Биосинтез белка происходит на рибосомах. Рибосомы представляют собой нуклеопротеидные частицы, состоящие из белков и рибосомальных РНК (рРНК). Рибосомы обепечивают надлежащее взаимодействие мРНК с тРНК, молекулами аминокислоты и поликонденсационной аминокислотой в полипептидную цепь. Рибосомы движутся вдоль цепи мРНК, "читая текст", кодон за кодоном, таким образом, что кодоны (в комплексе мРНК – рибосомы) присоединяют тРНК, связанные с аминокислотами (тРНК – АК). Каждая тРНК, несущая аминокислоту, комплементарно взаимодействует с кодоном мРНК своим антикодоном – триплетом, комплиментарным кодону мРНК. Вдоль одной цепи мРНК перемещается не одна, а ряд рибосом, на каждой из которых растет своя белковая цепь. Система "мРНК – рибосомы" (похожая на нить с бусами) называется полисомой. Рис. Схема присоединения "АК – тРНК" к мРНК в рибосоме. Таким образом, на одной цепи мРНК синтезируются одинаковые белковые цепи. Синтез белковой цепи на полисоме есть трансляция – перевод нуклеотидного текста в аминокислотный, происходящий с помощью генетического кода, т.е. кодоно-аминокислотного словаря. Новая белковая цепь синтезируется из аминокислот, а не из готовых полипептидных блоков. Далее из цепи (или из нескольких цепей) собирается биологически функциональная молекула белка. Описанная последовательность событий при биосинтезе сложна, но все ее этапы характеризуются единым принципом, лежащим в основе 65 молекулярной биофизики. Этот принцип – молекулярное узнавание, реализуемое посредством слабых взаимодействий. Ошибка в узнавании приводит к образованию некомплементарных пар, что и является одной из важнейших причин возникновения мутаций и, как следствие, изменения наследственного материала и эволюции. Рис. Стадии биосинтеза белка: транскрипция(и редупликация), образование полисомы и сборка белковой цепи Вырождение. Ценность генетической информации. Анализ таблицы генетического кода (т.е. таблицы соответствия тех или иных кодонов аминокислотам белков) показывает, что словарь "аминокислоты – кодоны" не случаен. Напомним, что число триплетов равно 4 3 =64, т.е. код вырожден. Это означает, что данная аминокислота может кодироваться несколькими кодонами: так Арг, Сер, Лей кодируются шестью кодонами, множество – четырьмя или двумя кодонами, Иле – тремя, Мет и Три – акждый одним кодоном. Три кодона УАА, УАГ. УГА не кодируют аминокислоты. но определяют окончание (терминацию) растущей белковой цепи. Очевидно, что кодируется первичная структура белка. В то же время биологические свойства белков определяются их третичной и четвертичной структурой. Именно они определяют результаты естественного отбора в эволюции, который идет по биологическим свойствам белков. Таким образом, существует связь между генетикой и эволюционной биологией. Гены кодируют первичную структуру белков→ первичная структура определяет пространственные структуры белков (третичную и четвертичную) → естественный отбор в эволюции. Физическое содержание генетической информации. Однозначное соответствие между первичной структурой БМ и их пространственным строением определяется специфическими слабыми 66 взаимодействиями аминокислотных остатков в цепи (в частности, гидрофобными (У) взаимодействиями). Мутации, приводящие к большому изменению гидрофобности, более опасны для пространственной структуры белка, чем мутации с малым изменением. Генетический код устроен таким образом, что он обеспечивает повышенную надежность по отношению к более опасным мутациям. Таким образом, физический смысл генетического кода в конечном счете определяется особыми свойствами воды (наличие гидрофобных взаимодействий). Условная ценность кодона определяется тем, насколько изменяется гидрофобность аминокислотных остатков в результате возможных замен букв x, y,z кодона. Наиболее ценный – кодон УГГ, кодирующий Трп (мутации этого кодона сильнее всего меняют гидрофобность и потому наиболее опасны). Три кодона (УАА, УАГ и УГА) терминальные, поэтому мутации, приводящие к этим кодонам, наиболее опасны. УГГ→ ( Г  А) : УАГ; УГА ДНК и технологии долгосрочного хранения информации. Одним из способов решения проблемы долгосрочного хранения цифровых данных может стать запись информации на молекулах синтетической ДНК. Основанием для проведения исследования стали предположения о том, что к 2020 году размер цифровых данных достигнет порядка 44 триллионов гигабайт, что в десять раз превышает общее количество цифровой информации, созданной к 2013 году. "Одним из решений проблемы ученые видят перевод в код ДНК цифровых изображений, которые позже можно будет считать с молекулы. В настоящее время детализирована новая техника, которая позволяющая успешно кодировать файлы с изображениями в нуклеотидную последовательность фрагментов синтетической ДНК". В рамках проведенных экспериментов сначала были переведены составляющие бинарного кода (нули и единицы) в комбинации нуклеотидов – аденин, гуанин, цитозин и тимин, при помощи которых происходит запись информации ДНК. После этого синтезировалась искусственная ДНК, которая содержала введенные данные. Кроме того в молекулу вводились специальные маркеры для того, чтобы определить начало и конец файла при раскодировке. Таким образом ученые смогли закодировать и раскодировать четыре изображения. При этом, ученым удалось реконструировать эти же четыре изображения без потери качества, выраженного в байтах. Таким образом, молекулы ДНК способны хранить информацию в миллион раз плотнее, чем современные технологии хранения данных. Такая технология, если будет доведена до совершенства, будет способна сохранять информацию на протяжении тысяч лет, утверждают ученые. 9. БИОЛОГИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ 9.1. Поверхность клетки 67 Основной единицей любой живой ткани является клетка. Каждая клетка имеет внешнюю оболочку, отделяющую внутренвнутреннее содержание клетки от внешней среды. Эта оболочка состоит из нескольких слоев. Внутренний слой, непосредственно примыкающий к цитоплазме клетки, называется цитоплазматической мембраной. Цитоплазматическая мембрана играет наиболее активную роль в жизнедеятельности клетки. Клетки многих организмов — зеленых растений, водорослей, грибов и большинства бактерий — снаружи цитоплазматической мембраны имеют клеточную жесткую стенку из целлюлозы, состоящей из полисахаридов и полимеров аминокислот. ОсновОсновная функция жесткой поверхности клетки — предохранение содержимого клетки от механических воздействий. Поверх жесткой оболочки этих клеток находится внешняя поверхность клетки, имеющая фибриллярную структуру и содержащая большое количество различного типа рецепторов, с помощью которых клетка общается с внешним миром. В лаборатории Габора в Канаде разработаны методы растворения целлюлозной оболочки растительных клеток с помощью специального фермента — целлюлазы. Клетки, лишенные целлюлозной оболочки, получили название протопластов. Такие оголенные клетки более доступны для внешних воздействий. Клетки животных не имеют твердых оболочек. Однако и у них поверх цитоплазматической мембраны находится внешняя мембрана, имеющая фибриллярную структуру и содержащая большое число рецепторов. Только в 50-е годы XX ст., после разработки методов электронной микроскопии и техники изготовления ультратонких срезов клеток, удалось выяснить основные черты строения различных клеточных и внутриклеточных мембран. Для изготовления микрофотографий с помощью просвечивающего электронного микроскопа нужны тончайшие (десятые и сотые доли миллиметра) ровные слои препаратов. Такие.тонкие слои вырезаются из замороженной суспензии клеток в воде. В других случаях ткань заливается полимеризующимся раствором или парафином и после его застывания на специальном аппарате «микротоме» из полученной твердой массы вырезают (строгают) тончайшие пленки-стружки. В качестве режущего инструмента используют свежий скол стекла или алмазные ножи. В состав мембран входят только атомы легких элементов, имеющие сравнительно рыхлые электронные оболочки. Их положение плохо проявляется на электронных микрофотографиях. Поэтому тонкие срезы тканей «окрашивают» атомами тяжелых металлов (например, уранилацетатом, парами платины и т. д.), имеющих плотные электронные оболочки. Микрофотографии приготовленных таким образом срезов дают картину пространственного распределения тяжелых атомов в срезе. Предполагается, что распределение тяжелых атомов отражает структуру тонкого сечения клеточной мембраны. К сожалению, плоскость среза не всегда проходит через наиболее интересные участки поверхности клетки. В конце 60-х годов были получены первые фотографии всей поверхности клетки с помощью растрового, или сканирующего, электронного микроскопа. Растровый микроскоп дал уника68 уникальную возможность увидеть всю поверхность клетки целиком исследовать отдельные ее участки. Можно получить изображения отдельных микроворсинок, складок и пузырьков. Весьма важно, что замедленная киносъемка с помощью растрового электронного микроскопа позволяет проследить за временными изменениями поверхности клетки. Принцип действия растрового (сканирующего) микроскопа напоминает работу приемной телевизионной трубки и электронно-лучевой трубки телевизора. Очень узкий пучок электронов падает на исследуемый объект и последовательно обегает его поверхность. Интенсивность упругорассеянных и вторичных электронов от каждого участка поверхности объекта зависит от ее состава и рельефа. Эти электроны преобразуются в электрический сигнал и после усиления в виде узкого пучка попадают на электронно-лучевую трубку. На флуоресцирующем экране этой трубки электронный луч, пробегая синхронно с лучем, падающим на объект, дает объемное, увеличенное в тысячи и десятки тысяч раз изображение поверхности объекта. На внешней оболочке клетки расположено много микроворсинок, пузырьков и углублений, содержащих различного рода рецепторы и антигены, с помощью которых она специфически реагирует на внешние воздействия. Микроворсинки и другие рецепторы внешней оболочки клетки, доступные для взаимодействия с другими клетками, являются гликопротеинами, т. е. углеводными цепями, связанными с белковыми цепями, или гликолипидами — углеводными цепями, ковалентно присоединенными к липидам (см. ниже). В состав углеводных цепей этих сложных молекул входят глюкоза, галактоза, сиаловая кислота, фруктоза (рис. ) и другие гетеросахариды. Гликопротеины мембран эритроцитов крови состоят на 60% из углеводов и на 40% из пептидов. Рис. Некоторые углеводные молекулы — моносахариды, входящие в состав гликопротеидов внешних поверхностей клеточных мембран: а — D-глюкоза; б — D-галактоаа; в — D-маноза; г — L-фруктоза; д — сиаловая кискислота. 69 9.2. Узнавание клетками друг друга В поверхностном слое клеточной мембраны заключены специальные механизмы узнавания клетками друг друга. Через поверхность клетки осуществляется образование клеточных агрегатов, восприятие специфических химических, физических и механических раздражений, обмен информацией между клетками. Выступающие на поверхности клетки углеводные цепи, по-видимому, являются местами «узнавания», определяющими специфичность клеток, обусловленную их принадлежностью к определенной ткани, биологическому виду или индивидууму. Они ответственны за свойства узнавания, агрегации и адгезии. Если клетка одного млекопитающего попадает в органы другого, то она атакуется находящимися в составе плазмы крови антителами и лимфоцитами и уничтожается или отторгается. Способность клеток узнавать друг друга проявляется при агрегации диссоциированных клеток. Механически смешанные диспергированные клетки губок двух разных видов сами собираются в скопления, состоящие из клеток только одного вида. Эта способность клеток пока еще не получила объяснения. Нормальные клетки, находясь во взвешенном состоянии в питательном растворе, имеют сферическую форму и не делятся. Только прикрепившись к дну сосуда, они начинают делиться. При соприкосновении с другой клеткой движение в направлении контакта прекращается. Оказавшись в окружении других клеток, клетка останавливается и перестает делиться. У многих опухолевых клеток такое контактное торможение отсутствует. Химическое определение состава некоторых узнающих участков поверхности эндоплазматической мембраны основано на использовании антисывороток. Они позволяют обнаружить антигенные свойства молекулярных комплексов, отделенных от поверхности клетки. С помощью ферментов, расщепляющих белки (например, трипсин), удается отделить от мембраны гликопротеины с гетеросахаридными цепями и убедиться в их способности к взаимодействию с антителами. Было установлено, что гликопротеины и гликолипиды с выступающими на поверхности мембраны отдельными углеводными цепями входят в состав цитоплазматической мембраны, охватывающей непрерывным образом внутреннюю часть клетки — цитоплазму. Цитоплазмой называется полужидкое основное вещество клетки, находящееся в непосредственном соседстве с цитоплазматической мембраной. Специфичность гликопротеинов и гликолипидов определяется размером и формой гетеросахаридных концевых цепей, окруженных водной средой с внешней стороны мембраны. Разные последовательности углеводных остатков и различные типы связи между ними создают большое многообразие гетеросахаридных цепей, даже если полисахарид состоит всего из нескольких типов углеводных остатков. Такое многообразие усиливается нековалентными взаимодействиями моносахаридных остатков с соседними 70 гетеросахаридными белками. Эти взаимодействия приводят к образованию комплексов на поверхности мембраны и их кооперативному действию. В межклеточном взаимодействии принимают участие весьма разнообразные силы. При этом наряду с вандерваальсовыми и водородными существенное значение имеют электрические силы. Отрицательные заряды вносят карбоксильные группы (СОО-) сиаловой кислоты и фосфатные группы (РО44-). Интенсивность таких электрических взаимодействий зависит от концентрации ионов и значения рН вблизи клеточной мембраны (В некоторых случаях значение рН у поверхности мембраны примерно на 0,3-0,4 единицы меньше, чем в окружающей среде). Вследствие большой гетерогенности и островному (мозаичному) расположению гликопротеинов и гликолипидов распределение электрических зарядов на поверхности мембраны крайне неоднородно и при сближении клеток существенно сказывается на их ориентации. Не исключено, что при сближении клеток происходит такое перемещение заряженных групп, которое удерживает поверхности клеток в контактах на расстояниях вандерваальсовых радиусов. На микрофотографиях обычно между мембранами соприкасающихся клеток виден просвет шириной от 100 до 200 А. По некоторым данным ионы кальция способствуют слипанию клеток. Возможно, что этот эффект связан с локальной поляризацией мембран. Большой интерес представляют самостоятельные движения клеток, за которыми можно проследить с помощью растрового электронного микроскопа. Так, например, клетки соединительной ткани мыши — фибропласты, имеющие в питательной среде сферическую форму, опускаясь на стекло, расплываются на нем и начинают двигаться по поверхности стекла, образуя на переднем конце широкую пластинку. В некоторых случаях мембраны движущихся по стеклу клеток совершают волнообразные движения. До последнего времени молекулярный механизм таких движений, как и других изменений формы внешней клеточной мембраны (при делении, экзоцитозе и индоцитозе и т. д.), остается невыясневыясненным. Возможно, эти движения обусловлены нитевидными и трубчатыми структурами, примыкающими к внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Некоторые исследователи предполагают, что эти структуры представляют собой сократительные элементы клетки. 9.3. Состав и структура клеточных мембран У одноклеточных животных — прокариотов (бактерии и сине-зеленые водоросли) — клетка выполняет все жизненные функции: пищеварение, дыхание, циркуляцию веществ, выделение, передвижение и размножение. Прокариоты имеют ярко выраженную цитоплазматическую мембрану и следы других внутриклеточных мембран. В этих клетках отсутствуют органеллы, т. е. участки клетки, окруженные своими мембранами. Клетки животных, зеленых растений, грибов и простейших (эукариоты) кроме внешней — плазматической мембраны — имеют внутри клетки широкий набор окруженных своими мембранами органелл, которые в свою очередь 71 могут иметь внутренние мембраны. Цитоплазма пронизана также эндоплааматической сетью, состоящей из трубочек и мешочков, называемых цистернами. Все виды физиологической деятельности и биохимической активности клеток зависят от функционирования их наружных и внутренних мембран. Цитоплазматическая мембрана и все внутренние мембраны разных клеток в основных чертах имеют одинаковое строение. В их состав входят молекулы жировых веществ, называемые липидами, белки и в малом количестве углеводы. Углеводы (сахара), входящие в состав мембран, обычно присоединены к белкам и называются гликопротпеинами, либо к липидам, тогда они называются гликолипидами. Липиды составляют около половины массы большинства мембран. Отдельные молекулы липидов имеют «голову» и два «хвоста», соединенные через промежуточную область — «хребет» (рис.). Рис. Схематическое изображение молекулы липида, входящей в состав клеточных мембран: а - «голова» молекулы; б - «хребет» ; в - гидрофобный хвост, состоящий из двух углеводородных цепей жирных кислот. Каждый угол цепи занят группой СН2, на концах СН3. Углеводородные цепи (хвосты) липидных молекул в мембранах животных клеток представляют собой неразветвленные углеводородные цепи с одинарными (иногда двойными) связями между углеродными атомами. С одной стороны углеводородные цепи заканчиваются карбоксильными группами СООН, которыми они присоединяются к хребту молекулы (остаток глицерина), последний в свою очередь соединен с головой. Углеводородные цепи отталкиваются от воды (гидрофобны). Голова липидной молекулы содержит группу атомов, которые часто несут электрические заряды, поэтому эта часть молекулы гидрофильна. Липиды, содержащие в головной части фосфат, называются фосфолипидами. Химическая структура фосфолипидов представлена на рис. Рис. Типичная структура фосфолипидной молекулы с одной двойной связью в углеводородной цепи: 72 Схематическое изображение некоторых других мембранных липидов дано на рис. Рис. Структурные формулы некоторых мембранных липидов: а - фосфатидил серии, если R = R1 ; фосфатидилэтаноламин, если R = R2 ; фосфатидилхолин, если R = R3 , и фоофатидилинозитол, если R = R4 ; б - холестерин. Различные фосфолипиды отличаются друг от друга как строением углеводородных цепей, так и составом полярных головок. Мембраны животных клеток содержат около 20% фосфолипидов, несущих отрицательный электрический заряд. Внешняя плазматическая мембрана наряду с фосфолипидами содержит большое количество холестерина и гликолипидов, углеводные части которых выступают из поверхности мембраны. Молекулы, имеющие гидрофильные и гидрофобные участки, называются алфифилъными. К этому типу молекул относятся и молекулы липидов. В водной среде молекулы липидов при некоторых условиях группируются в сферические пузырьки — липосомы. Обычно липосомы диаметром около 100 А получают встряхиванием или обработкой ультразвуком водных суспензий фосфолипидов. Поверхность липосом образована двойным слоем липидных молекул (рис.), в котором гидрофильные головы молекул обращены к внешнему и внутреннему слою воды, а гидрофобные (липофильные) хвосты молекул — к средней части двойного слоя. Таким образом, в двойном слое толщиной около 40—60 А липидные молекулы лежат параллельно навстречу друг другу, касаясь хвостами. Рис. Поперечное сечение мембраны липосомы. 73 В случае одинарных (насыщенных) связей между углеродными атомами жирных кислот их расположение характеризуется большой регулярностью (гексагональная структура). При наличии нескольких двойных связей в углеродных цепях правильное расположение в соответствующих местах нарушается. Расположение липидных молекул в виде двойного замкнутого слоя соответствует минимуму свободной энергии системы молекул в воде. Наличие двойного липидного слоя в биологических мембранах было предсказано Даниэлян и Даусоном в 1930 г., когда еще не были получены соответствующие экспериментальные данные. В настоящее время такое правильное расположение липидов как в мембранах липосом, так и в биологических мембранах подтверждено рентгеноструктурными данными. В противоположность липидам, белковые молекулы обычно не образуют упорядоченной структуры на мембранах. Каждый тип мембран содержит большое разнообразие белковых молекул, различающихся составом, молекулярной массой и расположением. Поэтому изучение их рентгеновскими методами может дать только усредненную картину. Именно белковые молекулы придают мембране специфические функциональные свойства. Многие из этих белков имеют глобулярную структуру и являются ферментами, контролирующими химические реакции, часть из них участвует в переносе молекул и ионов из области малой концентрации в область больших концентраций, т. е. вдоль градиента концентрации. В зависимости от положения в мембране, белки можно раздеразделить на внешние, или поверхностные, и внутренние, или интегральные. Поверхностные белки примыкают к внутренней или внешней стороне мембраны, не внедряясь в нее либо внедряясь очень незначительно. К таким белкам относятся белки, содержащие гидрофильные остатки аминокислот: LYS, HIS, ARG, ASP, GLV, SER, THR. Основная часть поверхностных белков окружена водой. Они сравнительно легко отделяются от мембраны (при изменении значения рН), при этом они не увлекают за собой липиды и обычно хорошо растворяются в воде. Все это указывает на слабую связь внешних белков с двойным липидным слоем мембран. Поверхностные белки содержатся в мембранах миэлиновой обооболочки нервных волокон, где они лежат на внешней поверхности липидного слоя. К таким белкам относятся также цитохром с и фермент АТФ-аза, участвующий в синтезе молекул АТФ мембранами митохондрий. На микрофотографиях эти молекулы в виде бугорков видны на поверхности мембраны. С внутренней стороны плазматических мембран красных кровяных телец — эритроцитов — лежит поверхностный белок спектрин. Все углеводородные цепи молекул гликопротеидов этой мембраны расположены на ее внешней поверхности. Эта же мембрана содержит и внутренние белки (рис.). 74 Рис. Схема расположения некоторых белковых молекул в мембране красных кровяных телец : а - «внутренние белки»; б - гликоиротеид; г - полипептид спектрин. Характер взаимодействия глобулярной молекулы с липидным слоем мембраны зависит от величины энергии взаимодействия полярных групп белковой молекулы с головами липидных молекул. Если эти взаимодействия достаточно сильны (например, когда участки белковой молекулы и липидного слоя имеют электрические заряды разного знака и т. д.), то происходит частичная денатурация белковой молекулы. Она раскручивается и распластывается по поверхности мембраны. При таком раскручивании и распластывании некоторые неполярные боковые цепи проникают между головами липидных молекул внутрь липидного слоя. В этом случае жидкостная структура липидного слоя делается более жесткой. Будет ли глобулярная белковая молекула раскручиваться и распластываться между поверхностью липидного слоя и водой, зависит в значительной степени от расположения и природы неполярных боковых цепей аминокислот, входящих в состав белковой молекулы, и от величины поверхностного натяжения в липидном слое. При малой величине 75 поверхностного натяжения многие неполярные боковые цепи белковой молекулы проникнут в липофильную область двойного липидного слоя. Такое проникновение будет сопровождаться повышением энтропии за счет большей свободы колебательных движений. При большом поверхностном натяжении в липидном слое малое число неполярных боковых групп проникнет в липидный слой, предпочитая оставаться внутри белковой группы. Повышение энтропии при поверхностной денатурации отражает повышение гибкости боковых цепей белковой молекулы на границе липидного слоя и воды. Для некоторых молекул (methemoglobin) энтропия поверхностной денатурации на границе вода — липидный слой в четыре раза больше, чем на границе вода — воздух. Кроме изменения энтропии при присоединении белковых молекул к мембране следует учитывать изменение электрических взаимодействий вследствие локального изменения диэлектрической постоянной, разрыва некоторых водородных связей в глобуле и образования новых водородных связей с молекулами воды и т. д. Характер присоединения белковой молекулы к мембране существенно зависит от величины и компактности гидрофобной области мо лекулы белка. Во внешних белках эти области незначительны и находятся в основном вне мембраны. Обычно мембраны содержат как внешние, так и внутренние белки. При этом доля внутренних белков часто превышает 70 %. Выделение внутренних белков из мембран требует значительных воздействий. Во многих случаях после отделения они остаются еще связанными с липидами. При отделении от липидов они нерастворимы в воде или собираются в водных растворах в агрегаты. Таким образом, внутренние белки и гликопротеины сильно взаимодействуют с двойным липидным слоем, глубоко внедряясь в него. Эти белки так же, как и фосфолипиды, должны быть амфифильными. Они содержат полярные (гидрофильные) боковые цепи и неполярные (гидрофобные) боковые цепи. Чем глубже белок погружен в липидный слой, тем больше он содержит гидрофобных остатков аминокислот. У гликопротеинов углеводные остатки сахаридов, ковалентно присоединенные к белкам, всегда выстувыступают из липидного слоя мембраны. Если оба конца большой белкобелковой молекулы гидрофильны, а средняя часть гидрофобна, то такая молекула пронизывает мембрану насквозь, выступая гидрофильными концами с обоих сторон мембраны. Мембрана является живой активно функционирующей системой. За время жизни клетки отдельные компоненты мембраны непрерывно обновляются. Время обновления варьирует в широких пределах от часов до нескольких суток. Клетки высших организмов содержат большое число различных мембранных структур. Они отличаются составом липидов и белков и их расположением. Именно разные состав и организация белков и липидов определяют разнообразные функциональные свойства мембран. Возникает вопрос, каким образом в состав мембраны включаются нужные ей белки и липиды. Ответа на этот вопрос еще нет. Механизмы, посредством которых белки транспортируются от мест их синтеза к 76 соответствующим невыясненными. мембранам, до настоящего времени остаются 9.4. Внутренние мембранные белки Из внутренних белков наиболее хорошо изучен родопсин, который входит в состав фоторецепторных мембран дисков наружных сегментов клеток палочек сетчатки глаза. В родопсине имеется 36% гидрофильных и 64% гидрофобных остатков аминокислот. В темноте молекула родопсина погружена на одну треть в двойной липидный слой. При освещении она углубляется на половину своего диаметра. В лаборатории Грина (Институт изучения ферментов Висконзинского университета) Капальди с сотрудниками успешно провели исследование внутреннего белка — цитохромоксидазы, входящего в мембрану митохондрий, который является конечным звеном цепи электронного транспорта, синтезирующей молекулы АТФ. Им удалось отделить цитохромоксидазу от всех других белков мембраны. В суспензии, состоящей из выделенного белка и фосфолипидов, они получили пузырьки — липосомы. Двойной липидный слой поверхности липосом содержал только белковые молекулы цитохромоксидазы. Исследователи убедились, что фермент сохраняет свои ферментативные свойства в таких искусственных мембранах. Это указыуказывало на одинаковое взаимодействие молекул фермента с двойным липидным слоем естественных и искусственной мембран. Фермент цитохромоксидаза может находиться в двух состояниях: окисленном и восстановленном. В окисленном состоянии молекулы фермента при соответствующей концентрации образуют на поверхности липидного слоя двумерную решетку. Такая решетка хорошо видна в электронном микроскопе и может быть изучена рентгеновскими методами. Проведенные исследования позволили установить, что отдельные молекулы фермента имеют на поверхности мембраны размеры 55 X 60 А; третий размер, поперек мембраны, составляет 80—85 А0. Следовательно, молекула цитохромоксидазы насквозь пронизывает мембрану, имеющую толщину только 45 А. 9.5. Динамические модели клеточных мембран Исследования структуры биологических мембран, выполненные последние годы различными методами (электронный парамагнитный резонанс, ядерный магнитный резонанс и др.), показали, что эти структуры не статические, а динамические. При физиологических температурах (около 37° С) белки и липиды могут совершать диффузионные движения вдоль поверхности мембраны. По своим свойствам липидный двойной слой в мембранах напоминает жидкие кристаллы. Поперек мембраны могут совершать диффузионное движение (раздвигая хвосты липидных молекул) белковые молекулы-переносчики. Вблизи голов липидных молекул структура двойного слоя более упорядочена, чем вблизи хвостов. 77 Центральная область двойного слоя толщиной 10—15 А совершенно неупорядочена. Хвосты липидных молекул могут изгибаться и совершать трансляционные смещения. Подвижность липидных молекул и молекулпереносчиков в мембране зависит от температуры и степени ненасыщенности связей между углеродными атомами углеводородных хвостов липидных молекул. Чем больше ненасыщенных связей, тем подвижнее молекулы при данной температуре. Возможность диффузионного движения молекул двойного липидного слоя и растворенных в нем белковых молекул имеет большое значение для выполнения мембранами их физиологических функций. При понижении температуры подвижность липидных молекул уменьшается и замирают многие физиологические процессы. Температура, при которой живет клетка, сказывается на количестве ненасыщенных связей в цепях жирных кислот липидных молекул. Например, бактерии, растущие при низкой температуре, имеют мембраны с большим числом ненасыщенных связей между атомами углерода, входящими в состав хвостов липидных молекул, чем те, которые живут при более высокой температуре. Клетки ног северного оленя, расположенные ближе к копытам, имеют мембраны с большим числом ненасыщенных связей между атомами углерода липидных молекул, чем клетки частей ног, расположенных ближе к туловищу. Эта разница обусловлена более низкой температурой нижних частей ног северного оленя. Подвижность и характер расположения белковых молекул на мембранах разного типа существенно различаются. Вследствие взаимодействия между белковыми молекулами они часто собираются на мембранах в комплексы, выполняющие определенные физиологические функции. В мембранах митохондрий имеются комплексы, состоящие из пяти типов белков. Четыре из них участвуют в цепи электронного транспорта, пятый синтезирует молекулы АТФ. Такой комплекс обеспечивает связь цепей электронного транспорта с синтезом АТФ. В мембранах эритроцитов большие белковые молекулы спектрина, лежащие со стороны внутренней поверхности мембраны, связаны с проникающими через мембрану другими белковыми молекулами, в частности с молекулами гликопротеинов, выступающих с внешней стороны поверхности мембраны. В цитоплазматических мембранах расположение отдельных белковых молекул и их комплексов контролируется сетью микротрубочек и микронитей, расположенных со стороны внутренней поверхности мембраны. Наиболее хорошо изучено движение белковых молекул в фоторецепторных мембранах внешних дисков палочек сетчатки глаза. Эти мембраны содержат белковые молекулы одного типа — родопсин. Поэтому их можно исследовать с помощью ренттеноструктурных методов. Му-минг Пу и Коне показали, что молекулы родопсина расположены равномерно по поверхности мембраны, углубляясь в нее примерно наполовину. Эффективный диаметр молекул равен 45Ǻ, средние расстояния между 78 молекулами 70Ǻ. При 20°С молекулы родопсина совершают диффузионные движения вдоль поверхности мембраны. При этом средняя длина свободного пробега равна примерно 25Ǻ. Среднее время столкновений между молекулами 4 • 10-6 с. Вязкость липидного слоя в десятки и сотни раз превышает вязкость воды. Итак, согласно современным представлениям, клеточные мембраны являются мозаичными структурами, содержащими в замкнутом двойном слое липидных молекул ориентированные двумерные растворы белковых молекул, гликопротеинов, гликолипидов и полисахаридов. Основу мозаичной структуры образует двойной слой липидных молекул с ионными и полярными группами атомов, лежащими на поверхности мембраны, соприкасаясь с водой. Вследствие наличия в двойном слое «островков» белковых молекул, плавающих в липидном слое, некоторые мембраны имеют неодинаковую толщину. Наименьшая их толщина — в областях с открытыми головами липидных молекул, наибольшая — в обласобластях выступающих полисахаридных цепей. 9.6. Кооперативные явления в мембранах Под кооперативным (аллостерическим) эффектом обычно понимается явление, при котором изменение, возникшее на одном месте сложной структуры, передается к другому удаленному месту с помощью структурной или энергетической связи. Модель мембраны в виде жидкой мозаики допускает диффузионную передачу локальных физических или химических воздействий на отдельные компоненты мембраны. Диффузия в вязкой липидной среде может играть существенную роль в медленных процессах. В частности, она, по-видимому, важна при транспорте малых полярных молекул через мембраны с помощью белковых молекул-переносчиков. В быстрых процессах проявляются динамические изменения, обусловленные резонансной передачей возбуждения, переносом конформационного изменения, переносом протонов или электронов. Такие явления можно подразделить на два типа: цис и транс . К транс-эффектам относятся кооперативные явления, которые соответствуют передаче локального изменения с одной стороны мембраны на другую сторону. Например, внутренний белок может состоять из двух (и большего числа) субъединиц, первая из которых находится на одной стороне мембраны, а вторая — на другой. В этом случае изменение, обусловленное присоединением гормона или другой молекулы к внешней субъединице, может привести к изменению второй субъединицы, обращенной к цитоплазме. К цис-эффектам относятся кооперативные изменения, охватывающие сравнительно большие участки мембраны при локальном ее возбуждении. Многие явления, характеризующие поведение клеток: дифференциация, агрегация в колонии, регуляция роста, контактное торможение деления, влияние гормонов и ядов и т. д., являются проявлением кооперативных 79 эффектов. Внешние возбуждения воспринимаются клеткой через систему локально расположенных на мембране выступающих цепей полисахаридов. К кооперативным явлениям следует отнести и передачу нервного импульса вдоль нервного волокна. Несмотря на большие успехи, достигнутые в области изучения молекулярной структуры и функций клеточных мембран, многие их свойства остаются неясными. При теоретическом исследовании свойств мембран приходится использовать модельные представления, отражающие только некоторые свойства реальных мембран. Фрагментарный и спекулятивный характер таких теоретических построений не вызывает сомнений. Поэтому их следует рассматривать как некоторые рабочие гипотезы. Ценность этих гипотез заключается в том, что они могут стимулировать развитие новых теоретических и экспериментальных исслеисследований. При теоретическом исследовании кооперативных свойств мембран Шанже с сотрудниками рассматривали мембрану как упорядоченное собрание повторяющихся глобулярных белково-липидных единиц — протомеров, организованных в двумерную решетку. Предполагалось, что: 1) протомеры имеют только два обратимых конформационных состояния А и В; 2) присоединение лиганда к протомеру А переводит его в состояние В; 3) учитывалось взаимодействие только соседних протомеров; 4) взаимодействие протомера с соседними протомерами изменяется на величину г\, когда все они переходят в состояние В. Исследование состояний такой системы протомеров, как функции концентрации лигандов и температуры, сводится к исследованию состояний двумерной модели Изинга. Как известно, модель Изинга сильно идеализирует физические системы. Однако она часто дает качественное описание очень важных свойств таких систем. Точных решений двумерная модель Изинга не имеет. Шанже с сотрудниками использовали приближение Брегга — Вильямса, в котором взаимодействие с соседними протомерами заменяется взаимодействием с усредненным полем. Они показали, что для значений η ≥ 4кТ кривые возбуждения протомеров как функции концентрации лигандов имеют разрыв при некоторой критической концентрации Скр. Если концентрация лигандов переходит через критическое значение, то скачком возбуждаются все протомеры. При η < 4кТ кривые возбуждения изменяются непрерывно. 9.6. Пассивный транспорт ионов и молекул через мембраны В нормально функционирующих клетках сотни различных малых молекул и ионов должны присутствовать в концентрациях, значительно меньших или значительно больших, чем их концентрации в окружающей водной среде. Например, концентрация ионов калия в клетке человека в десятки раз превышает их концентрацию в крови. Для ионов натрия отношение таких концентраций обратное. Поддержание разных концентраций внутри 80 и вне клетки абсолютно необходимо. Даже небольшое изменение концентрационных отношений приводит к полному нарушению жизненных процессов. Клетки могут избирательно поглощать некоторые вещества. Например, живая клетка кишечной палочки (бактерии E-coli) может иметь концентрацию питательного вещества — молекулы молочного сахара (лактозу), в 500 раз превышающую его концентрацию в окружающей среде. Контроль внутреннего содержания клеточного вещества осуществляется цитоплазматической мембраной. Она регулирует поступление в клетку и выход из нее различных веществ. Проницаемость цитоплазматической мембраны весьма избирательна. Одни молекулы она пропускает сравнительно свободно, другие с трудом или вовсе не пропускает. Селективность пропускной способности мембран может меняться под влиянием внешних условий. Скорость проникновения в клетку небольших молекул пропорциональна их растворимости в маслах. Ионы и полярные молекулы не очень малых размеров проникают в клетку с помощью особых переносчиков (см. ниже). Поглощение клетками очень крупных молекул может происходить путем «эндоцитоза». Клетка как бы заглатывает такие молекулы, образуя углубление мембраны в виде кармана. Затем этот карман закрывается и внутри клетки образуется пузырек с заключенной в нем молекулой. Процесс выделения клеткой крупных молекул (экзоцитоз) происходит в обратном порядке. Такое поглощение и выделение крупных молекул требует затраты энергии. Движение молекул (ионов) через мембраны посредством диффузии из области большой концентрации в область малой концентрации молекул (ионов) называется пассивным транспортом. Некоторые молекулы (ионы) принудительно накачиваются или выкачиваются из клетки в направлении увеличения концентрации. Такое перемещение молекул (ионов) называется активным транспортом и осуществляется при затрате энергии. 9.7. Транспорт молекул и ионов через мембраны, разделяющие электролиты При теоретическом исследовании движения молекул и ионов через мембраны под влиянием градиента концентраций и электрического потенциала разные авторы рассматривают мембрану либо в виде однородной среды, характеризуемой определенными значениями коэффициентов диффузии и подвижности ионов, либо моделируют ее последовательностью потенциальных барьеров. Детальное теоретическое исследование прохождения ионов через модельные системы, состоящие из мембран, разделяющих два электролита, проведено в монографии В. С. Маркина, Ю. А. Чизмаджиева. Здесь мы рассмотрим простейший случай стационарных условий, при которых концентрации на границах мембраны пропорциональны их концентрациям в растворах. Предположим, что на двух поверхностях (1 и 2) однородной мембраны молярные концентрации нейтральных молекул одного сорта равны соответственно С1 и С2. Если С2 > С1 и концентрация меняется линейно 81 внутри мембраны, то градиент концентрации (химический градиент), направленный перпендикулярно плоскости мембраны в сторону возрастания концентрации, имеет постоянное значение (9.1) Под влиянием градиента (9.1) в мембране возникает диффузионное движение (пассивный транспорт). Молярная плотность потока Jx молекул, т. е. число молей молекул, проходящих в секунду через единицу поверхности мембраны, направлена со стороны большей концентрации в сторону меньшей концентрации, т. е. против градиента концентрации . Его величина определяется уравнением диффузии, которое называется законом Фика, (9.2) где D — коэффициент диффузии через мембрану, имеющий размерразмерность (см2/с). Подвижности ионов различного типа не зависят от наличия других ионов (принцип независимости потоков). Это предположение оправдывается при малых концентрациях ионов в мембранах. Однако точные оценки концентраций проникающих ионов внутри мембран в настоящее время отсутствуют. В работе Хочкина и Кейса [157] показано, что принцип независимости потоков не выполняется, по крайне мере для ионов калия. Многие ткани млекопитающих обладают системами облегченной диффузии для получения из плазмы крови ряда веществ (метаболитов) — сахара, аминокислот, пуринов, глицерина и др. Активность таких систем регулируется гормонами. Например, облегченная диффузия глюкозы в скелетные мышцы активируется инсулином. Пассивная диффузия определяется величиной проницаемости мембраны и электрохимическим градиентом. Вода и растворенные в ней газы (кислород, углекислый газ) проникают через мембраны практически беспрепятственно. Большая скорость прохождения воды через биологические мембраны была установлена при использовании воды, меченой тритием. Прохождение молекул через двойной липидный слой указывает, что в этом жировом слое имеются сквозные поры. Сквозь такие поры могут проходить через мембрану и другие малые полярные молекулы. По некоторым оценкам, диаметр пор равен 6—10 А, и занимают они только 0,06% всей поверхности мембраны. Возможно, что поры в липидном слое несут электрические заряды, так как мембрана хорошо отличает анионы от катионов. По-видимому, поры в липидном слое не статические, а динамические образования, возникающие вследствие флуктуационных смещений липидных молекул. Скорость проникновения молекул через мембраны существенно зависит от температуры. Такую зависимость 82 обычно рассматривают как следствие необходимости преодоления молекулой некоторого потенциального барьера. Допуская, что зависимость скорости проникновения от температуры подчиняется экспоненциальному закону ~ ехр (—Q*/kT), можно определить эффективную энергию активации Q*. Для этиленгликоля и глицерина таким образом были получеполучены значения энергии активации, равные 12,6 и 16,1 эВ. Такие значения оказались близкими энергии гидратации молекул. В связи с этим было высказано предположение, что энергия активации связана с необходимостью освобождения молекулы от гидратной оболочки перед входом в мембрану. Приведенные выше рассуждения о природе температурной зависимости не учитывают изменения свойств пропускания самой мембраны, обусловленные изменением подвижности липидных молекул в мембране. При понижении температуры двойной липидный слой делается очень жестким и пропускная способность резко снижается. 9.8. Пассивный транспорт при участии переносчиков При исследовании пассивного транспорта растворимых в воде веществ (сахара, аминокислоты, катионы) через искусственные мембраны, целиком состоящие из молекул фосфолипидов, было обнаружено, что такое движение происходит со скоростью на несколько порядков меньшей скорости движения тех же ионов через естественные мембраны. Поэтому предполагалось, что в естественных мембранах должны быть особые вещества, облегчающие прохождение малых полярных молекул и металлических ионов через липидный слой. Эксперименты с биологическими мембранами показали, что гипотетические переносчики обладают очень высокой селективностью. Например, переносчик, облегчающий транспорт глюкозы через мембраны, не оказывает никакого влияния на транспорт аминокислот или других сахаров. Валиномицин, нигерицин и другие антибиотики — комплексоны — оказались одними из первых соединений, у которых была открыта способность избирательно увеличивать вероятность прохождения ионов металлов через биологические и искусственные мембраны. Для изучения механизма проницаемости мембран часто используются искусственные биомолекулярные фосфолипидные мембраны, или бислои. Такие мембраны образуются из пленок раствора фосфолипидов в неполярном растворителе (гептан, декан, ...). Пленкой закрывается отверстие в тефлоне, разделяющем сосуд на две части. При спонтанном «испарении» пленка утончается и образует биомолекулярный двойной слой толщиной 60—80 Ǻ. Чаппель с сотрудниками в Кембриджском университете разработали метод исследования селективного ионного транспорта через мембраны с помощью измерения электрического сопротивления мембран. Двойной липидный слой закрывал малое отверстие между двумя камерами с раствором КСl, содержащим ионы К+. С помощью электродов, погруженных в эти камеры, измерялось электрическое сопротивление двойного липидного слоя. Измерения 83 показали, что удельное сопротивление двойного липидного слоя при отсутствии валиномицина в растворе составляет 10 7 — 108 Ом/см2. Оно на несколько порядков выше удельного сопротивления 10—104 Ом/см2) типичных биологических мембран. При добавлении в раствор КС1 малых количеств валиномицина (около 10 -7 г/мл) удельное сопротивление двойного липидного слоя падает на пять порядков. На эту же величину возрастает пропускная способность мембраны относительно ионов калия. В растворах NaCl, содержащих ионы Na +, добавление молекул валиномицина приводит к очень малому изменению сопротивления. Повышение проводимости двойного липидного слоя ионами К + при наличии молекул валиномицина достигает стационарного значения примерно через 40 мин после введения спиртового раствора валиномицина в раствор КС1. При этом повышение проводимости не зависит от того, присутствуют молекулы валиномицина по одну или по обе стороны мембраны. Это указывает на то, что повышение проводимости бислоя связано с растворением в нем молекул валиномицина. В Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе Красне с сотрудниками показали, что усиление транспорта ионов К + валиномицином прекращается, если двойной липидный слой «замораживается» при понижении температуры. Понижение температуры приводит к снижению подвижности молекул валиномицина в лйпидном слое. Таким образом, эффективность действия молекул валиномицина непосредственно связана с их подвижностью в липидном слое мембраны. Уменьшение сопротивления бислоев при растворении в них молекул валиномицина, энниатина, монамицина и некоторых других исследовалось во многих лабораториях мира. Однако, как отмечается в работе [51], «многие проблемы, связанные с изучением механизма этого явления, и поныне остаются нерешенными». Антибиотики валиномицин, энниатин и монатицин представляют собой циклические депсипептиды, построенные из остатков аминокислот и оксикислот, соединенных между собой амидными и сложноэфирными связями. В основе мембранной активности валиномицина и других родственных соединений лежит способность связывать ионы щелочных металлов с образованием липофильных (растворимых в липидах) положительно заряженных катионных комплексов, которые и участвуют в переносе ионов через внутреннюю гидрофобную зону мембраны. За способность переносить ионы через мембраны их называют ионофорами. Рис. Схема конформационного изизменения молекулы валиномивдща при образовании комплекса с ионом калия: О — атом кислорода; — ион калия. 84 Как уже отмечалось, скорость прохождения катионов через естественные мембраны на несколько порядков выше скорости их прохождения через мембраны, состоящие только из двойного липидного слоя. При добавлении валиномицина в концентрации 10 -7 — 10-6 моль пропускная способность таких искусственных мембран сравнивается с пропускной способностью естественных мембран. В связи с этим было сделано предположение, что в естественных мембранах также присутствуют некоторые молекулыпереносчики, которые действуют подобно молекулам валиномицина. Существование таких естественных переносчиков пока только постулируется. Все попытки обнаружить молекулы-переносчики в биологических мембранах не привели к успеху. Возможно, что их содержание в мембранах очень мало. Возможно также, что перенос ионов в естественных мембранах осуществляется и другими способами. Высказываются мнения, что в естественных мембранах существуют молекулярные или надмолекулярные образования, которые создают в мембранах проходы или поры. Сторонники этих взглядов допускают существование в мембране не только малых пор, пропускающих молекулы воды, но и более крупных пор с диаметром, равным или превышающим диаметр ионов. Вероятность переноса ионов через такие поры сопряжена с дегидратацией иона при переходе его из водной среды в пору под влиянием взаимодействий ионов с группами атомов, выстилающих пору. Внутри пор катионы могут быть сольватированы нейтральными лигандными группами. Так, например, Хилл [154] предполагает, что при внедрении катиона Na+ в натриевый канал нервных мембран образуются комплексы за счет связи с шестью кислородными атомами (лигандами). Движение иона рассматриварассматривается как процесс последовательных переходов между молекулами, образующими пору. Гипотеза о существовании каналов — пор, избирательно пропускающих катионы через мембраны,— нашла поддержку в данных, полученных при изучении мембранной активности, обусловленной антибиотиками грамицидиновой группы (грамицидины А, В, С и D). Грамицидины А, В и С представляют собой белковые цепи весьма близкого строения. Их первичная структура образована чередующимися гидрофобными остатками L- и D-аминокислот. Грамицидины А, В и С отличаются друг от друга только одиннадцатым остатком. Пептидная цепь грамицидинов имеет спиральную конформацию, которую принято называть πLD-спиралью. В отличие от α-спиральных структур, где карбоксильные группы С=О ориентированы вдоль оси спирали, в πLD -спиралях связи С=О соседних пептидных (амидных) групп расположены антипараллельно. С=О группы L-аминокислотных остатков ориентированы вдоль оси спирали по направлению к С-концу, соответствующие группы D-остатков и глицина к N-концу. Боковые цепи аминокислотных остатков направлены под углом примерно 900 к оси спирали и обеспечивают ее высокую липофильность. 85 Грамицидины очень плохо растворяются в воде и не образуют устойчивых комплексов с ионами щелочных металлов. Однако они весьма склонны к образованию димеров. Расположение грамицидинов в двойном липидном слое мембран не установлено. Урри предположил, что грамицидины в мембране образуют димеры, в которых свернутые в виде πLD -спиралей соседние молекулы соединены «голова к голове» водородными связями между амидными концами полипептидных цепей. Такой димер представляет собой как бы полую трубу, прошивающую насквозь мембрану. Димер имеет длину, приблизительно равную толщине бислойной мембраны 30—50 Ǻ). Предполагается, что такая «труба» и является порой (каналом) для катионов. Грамицидины существенно увеличивают проницаемость бислойных липидных мембран для ионов щелочных металлов. Проницаемость пропорциональна квадрату концентрации молекул грамицидинов в водном растворе. Это подтверждает участие димеров в механизме увеличения проводимости. В отличие от катионной проницаемости, обусловленной валиномицином, проницаемость, вызываемая молекулами грамицидина, не зависит столь существенно от того, находится мембрана выше или ниже температуры фазового перехода липидного слоя. Следовательно, механизм проводимости не связан с движением молекул грамицидина в липидном слое. В последнее время многие ученые придерживаются мнения, что перенос ионов через мембраны осуществляется через ионные каналы — специализированные участки мембраны, включающие белковые молекулы и окружающие молекулы липидов. В качестве подтверждения такой точки зрения используют экспериментально установленную возможность блокирования транспорта ионов определенного типа ингибиторами. Так, например, транспорт ионов калия можно блокировать с помощью молекул тетраэтиламмония. Следует, однако, иметь в виду, что блокировка транспорта определенных ионов будет происходить и в том случае, когда ионы переносятся подвижными переносчиками. Несомненно, что в переносе ионов участвуют определенные белковые молекулы. В некоторых случаях перенос ионов связан с перемещением таких молекул внутри липидного слоя, в других же случаях белковые молекулы-переносчики пронизывают всю мембрану и движение иона осуществляется внутри комплекса, образованного белковой молекулой и липидными молекулами. По-видимому, в природе реализуются обе такие возможности. В обоих случаях изменение напряженности электрического поля внутри мембраны может приводить к конформационному изменению комплексов, участвующих в переносе ионов, и, следовательно, изменять проницаемость мембраны. При исследовании механизма работы мембран часто используются ионофоры, увеличивающие проницаемость мембран для протонов (ионов 86 Н+). К таким ионофорам относятся молекулы, имеющие структурную формулу , кратко обозначаемые FCGP, и некоторые другие. В приведенной формуле молекула изображена в состоянии с присоединенным протоном в местах, указанных кружками. Все эти молекулы являются слабыми кислотами. Они легко отдают и приобретают протоны. Без протонов и при наличии протонов они растворимы в липидном слое клеточных мембран, поэтому такие молекулы могут переносить протоны через мембраны методом облегченной диффузии, т. е. под влиянием разности протонных концентраций и электрического поля. Механизм такого переноса аналогичен механизму переноса ионов калия валиномицином. Перенос протонов через мембраны могут осуществлять и молекулы нигерицина. Однако такой перенос они осуществляют только в обмен на ионы калия. Эта особенность молекул нигерицина обусловлена тем, что они растворяются в липидном слое мембраны, присоединив ион калия или протон. 9.9. Трансмембранная разность потенциалов Широкое использование техники микроэлектродов (диаметром до 0,5 мкм) позволило проводить измерение разности потенциалов на внешней и внутренней поверхностях цитоплазматических мембран многих клеток. Особенно тщательно изучены разности потенциалов на мембранах крупных клеток нервного волокна — аксона и мышечных волокон. В живых клетках в состоянии покоя разность потенциалов на цитоплазматической мембране — трансмембранная разность потенциалов — варьирует от 20 до 200 мВ. Клетки одного типа имеют одинаковую, характерную для них трансмембранную разность потенциалов. В цитоплазматической мембране аксона кальмара разность потенциалов равна 60 мВ, а в мышечном волокне — 90 мВ. Внутренний потенциал этих клеток, как и других, отрицателен. При отсутствии суммарного тока через мембрану величина трансмембранной разности потенциалов ΔU выражается через молярные концентрации ионов на обоих поверхностях мембраны и их проницаемости в мембране с помощью уравнения Гольдмана — Хочкина — Каца. В случае одновалентных ионов оно имеет вид 87 молярные концентрации положительных и отрицательных ионов внутри (вн) и снаружи (сн) клетки; R — универсальная газовая постоянная; F — число Фарадея. Если внутри и вне клетки находятся только два типа проникающих через мембрану одновалентных ионов, имеющих электрические заряды противоположного знака А+ и В-, то из требования равенства электрохимических потенциалов в условиях равновесия следует соотношение или [А+]сн [В-]сн = [А+]вн [В-]вн Гликопротеины (карбоксильные группы сиаловой кислоты, аминокислотных остатков и т. д.) часто несут отрицательный электрический заряд, поэтому поверхность клетки обычно заряжена отрицательно. Эти заряды частично компенсируются положительными зарядами ионов Са 2+, Mg2+ и других, входящих в состав окружающей среды. При физиологическом значении рН внутри клетки также имеются макромолекулы, несущие отрицательный электрический заряд. Если внутри клетки или вне ее имеются заряженные макромолекулы, неспособные проникать через мембрану, то они оказывают существенное влияние на распределение ионов между клеткой и внеклеточной средой. Рассмотрим это явление на простом примере. Пусть внутри и вне клетки имеется только два типа (А+ и В-) проникающих через мембрану одновалентных ионов и внутри клетки находятся неподвижные отрицательные заряды с молярной концентрацией δ. В состоянии равновесия внутри и снаружи клетки должны выполняться условия нейтральности Подставляя эти значения в предыдущее равенство для подвижных ионов, получаем уравнение Из полученных соотношений следует, что при выполнении неравенства δ«С 88 Подставив эти значения и трансмембранного потенциала из которого следует, что даже при одинаковой проницаемости ионов РА = РВ на мембране имеется трансмембранная разность потенциалов A3.10) в A3.8), найдем значение Эта разность потенциалов называется доннановской. Различные концентрации ионов внутри и вне клетки в основном создаются системами активного транспорта. Значения концентрации трех основных ионов внутри и вне гигантского аксона кальмара приведены в табл. Таблица Проницаемость этих ионов через мембрану существенно зависит от внешних условий. В состоянии покоя при физиологических условиях соотношение коэффициентов проницаемости имеет вид Следовательно, основной вклад в трансмембранный потенциал вносят только ионы К+ и Сl-. Согласно A3.8) при 30° С получаем что хорошо согласуется с экспериментальным значением: - 60 мВ. 10. ПРИНУДИТЕЛЬНЫЙ ТРАНСПОРТ МОЛЕКУЛ И ИОНОВ ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ 10.1 Ионные насосы Искусственные фосфолипидные мембраны позволили выяснить некоторые особенности селективности и механизма действия ионных переносчиков (ионофоров), обеспечивающих пассивный транспорт ионов из областей высоких в области малых концентраций. Наряду с пассивным транспортом 89 в жизнедеятельности клетки большую роль играют процессы принудительного переноса молекул и ионов из областей их малых концентраций в области высоких концентраций. Биологические мембраны являются асимметричными устройствами, позволяющими при затрате энергии устанавливать разность электрических потенциалов и разность концентраций ионов и молекул на двух сторонах мембран. Транспортные системы мембран, призванные создавать градиенты концентраций переносимых веществ на двух сторонах мембран, часто называют насосами. Так, например, говорят о натрий-калиевых насосах, создающих на мембранах градиенты концентрации ионов натрия и калия, о кальциевых насосах, создающих градиенты концентрации ионов кальция, о протонных насосах, создающих градиенты концентрации протонов. Натрий-калиевые насосы входят в состав цитоплазматических мембран, окружающих клетки. Эти насосы обеспечивают малое отношение концентрации ионов натрия к концентрации ионов калия внутри клетки, несмотря на то что вне клетки такое отношение велико. Кальциевые насосы входят в состав мембран саркоплазматической сети мышечных волокон. Эти насосы снижают концентрацию двукратно ионизированных атомов кальция в мышечных волокнах при их расслаблении до значения 10-7 моль, перегоняя их внутрь канальцев саркоплазматической сети, где их концентрация составляет 10-3 моль. Натрий-калиевые и кальциевые насосы работают за счет потребления энергии гидролиза молекул АТФ с образованием молекул АДФ и неорганического фосфата (Фн). Эти насосы могут работать обратимо, используя градиенты концентрации ионов для синтеза молекул АТФ из молекул АДФ и Фн. Протонные насосы входят в состав цитоплазматических мембран бактерий, внутренних мембран клеточных органелл — митохондрий, мембран тилакоидов, входящих в состав хлоропластов/зеленых растений (см. § 17). Протонные насосы в цитоцитоплазматических мембранах бактерий и во внутренних мембранах митохондрий работают за счет энергии окисления молекул углеводов и жиров. Протонные насосы в тилакоидах используют энергию света, поглощаемого растениями. При переносе одного моля вещества со стороны мембраны с малой концентрацией C1 на сторону с большей концентрацией С2 надо затратить работу, равную изменению свободной энергии Гиббса, где Т — абсолютная температура в градусах Кельвина; R — газовая постоянная. Такая работа должна выполняться за счет сопряженного процесса, выделяющего энергию. Совершая работу по переносу ионов и молекул через мембрану, клетка расходует значительную энергию. Так, 90 например, живая клетка бактерии может накопить ионы калия внутри клетки до концентрации 10-1 моль при его концентрации вне клетки 10-4 моль. Согласно формуле A4.1), при 27° С она должна затратить на это энергию, равную 803 кал/моль. Проблема выяснения механизма работы биологических ионных насосов остается одной из центральных в биологии. Натрий-калиевый насос, который часто для упрощения называют натриевым насосом, осуществляя активный транспорт ионов натрия и калия через цитоплазматические мембраны, поддерживает поперек мембраны разность электрических потенциалов, равную 60—100 мВ с отрицательным знаком внутри клетки. При этом внутри клетки устанавливается отношение концентраций ионов калия к концентрации ионов натрия в пределах от 6 до 15, в то время как вне клетки оно равно 0,03—0,04. Важной особенностью натриевого насоса является то, что вынос ионов Na+ из клетки не происходит, если во внешней среде нет ионов К+. Поглощение клеткой ионов К+ возможно только в том случае, когда внутри клетки есть ионы Na+. Другими словами, ионы натрия активируют натриевый насос на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны, а ионы калия — на ее внешней поверхности. В связи с этой особенностью натриевого насоса высказывалось мнение, что потоки ионов натрия и кглия в сторону возрастания их концентраций осуществляются одним и тем же комплексом белков. Подтверждением такой точки зрения явились опыты Бейкера и Манила, которые показали, что замена внеклеточной жидкости средой, не содержащей ионов калия, практически мгновенно прекращает активный поток ионов натрия из клетки. Тем самым было показано, что связь ионных токов Na+ и К+ является прямой, а не косвенной. Для объяснения встречных потоков ионов натрия и калия была предложена модель натрий-калиевого обмена. Согласно этой модели внутри мембраны находится носитель, меняющий свое сродство к ионам натрия и калия. На внутренней поверхности мембраны носитель присоединяет ионы натрия и переносит их на внешнюю поверхность. Отдав ион натрия, носитель на внешней поверхности приобретает сродство к ионам калия. Захватывая ион калия, он переносит его на внутреннюю поверхность клетки, где снова, приобретая сродство к ионам Na+, может начать новый цикл. Чтобы такая модель имела право на существование, необходимо найти объяснение изменений сродства переносчиков к присоединению ионов на внешней и внутренней сторонах мембраны. Чем обусловлен такой векторный характер переноса? Связан ли он с тем, что гидролиз молекул АТФ осуществляется только на внутренней стороне мембраны? Необходимо также объяснить, как энергия гидролиза используется для перемещения ионов. Механизм работы натриевого насоса на основе натрий-калиевого обмена ионов не объясняет наблюдаемые в эксперименте непостоянные стехиометрические отношения чисел переносимых ионов натрия и калия. В мембранах эритроцитов человека натриевый насос выводит из клетки три иона натрия и вводит два иона калия. В гигантском аксоне кальмара это отношении 91 равно трем или двум к одному. Большое значение имеет работа П. Г. Костюка с сотрудниками, где показано, что в одной и той же клетке соотношение активных потоков натрия и калия не постоянно. При изменении поперечной разности потенциалов изменяется выход ионов калия, при неизменном натриевом токе. Эти исследования, по-видимому, указывают на то, что калиевый ток слагается из двух частей. Одна непосредственно связана с работой натриевого насоса, а вторая обусловлена движением ионов в электрическом поле мембраны. Проницаемость ионов калия через мембрану значительно выше, чем ионов натрия. Поэтому электрическое поле мембраны оказывает основное влияние на ионы калия. Вывод натрия из клетки осуществляется натриевым насосом и в том случае, когда во внешней среде ионы калия заменены друдругими одновалентными катионами NH4+, Li+, Cs+, Rb+ и Т1+. Эти ионы переносятся внутрь клетки вместо ионов калия. Интересно, что натриевые насосы в почках осуществляют активный транспорт ионов Na+ и С1- в одном направлении (из клетки) без участия ионов калия. Это было подтверждено на искусственных фосфолипидных мембранах, в которые включались ион-транспортирующие комплексы, выделенные из почек. Активный транспорт ионных токов натрия и калия может быть заторможен веществами, стимулирующими сердечную деятельность. Эти вещества называются кардиоактивными стероидами. К ним относятся производные строфантидина — строфантин G и К или оуабаин и некоторые другие. Ингибирующее действие кардиоактивных стероидов на активактивный транспорт ионов натрия и калия в мембранах эритроцитов было отмечено в 1953 г. Шатцманом. Производные строфантидина в 20— 30 раз снижают скорость выведения натрия из гигантских аксонов кальмара. Теперь такие стероиды широко используют в исследованиях при необходимости подавления активного переноса ионов или для отделения активных потоков от пассивных. Работа натриевого насоса обеспечивается энергией гидролиза молекул АТФ (более правильно — комплекса MgАТФ2-). Следовательно, такой гидролиз должен быть обусловлен комплексом белков и липидов, входящих в натриевый насос. Роль молекул АТФ в активном транспорте установлена прямыми опытами на гигантских аксонах кальмара, отравленных цианидом. Активное выведение натрия из такого волокна наблюдалось лишь в тех случаях, когда внутри волокна сохранялось некоторое количество молекул АТФ или они вводились туда искусственно. Установлено, что тени эритроцитов, т. е. замкнутые мембраны эритроцитов, не содержащие цитоплазматических компонентов, способны поддерживать натриевые и калиевые градиенты только в том случае, если в состав их внутри среды входят молекулы АТФ и ионы Mg 2+. Ингибирование натриевого насоса стероидами и активация ионами натрия и калия показали, что его действие подобно действию фермента. Этот фермент должен вызывать и гидролиз молекул АТФ, чтобы использовать их энергию. Поэтому он назван Na, К-АТФ-азой. Впервые такой фермент был открыт в 1957 г. в мембранных фракциях нерва краба. В дальнейшем 92 выяснилось, что фермент Na, К-АТФ-аза прочно вмонтирован в липидный слой плазматической мембраны так, что его активные центры располагаются на противоположных поверхностях мембраны. Молекулы АТФ расщепляются только на внутренней поверхности мембраны [195]. Образующийся при гидролизе неорганический фосфат остается в цитоплазме клетки. В опытах на гигантских аксонах кальмаров установлено, что действие ингибитора оуабаина проявляется только с внешней поверхности мембраны. Ингибирование обусловлено присоединением молекул оуабаина к части фермента, выступающей с внешней стороны мембраны. Используя меченные тритием молекулы оуабаина, удалось определить плотность расположения ферментов Na, КАТФ-азы на поверхности мембраны. Бейкер и Виллис [76, 77] нашли, что в мембранах нервных клеток имеется 500—1500 ферментов на 1 мкм2; у эритроцитов — только один фермент на 1 мкм2. По некоторым оценкам фермент совершает 6000—10000 выбросов ионов в минуту. Делались многократные попытки выделения ферментов Na, K-АТФ-азы из цитоплазматических мембран. В настоящее время считают, что этот фермент состоит из двух полипептидных цепей с молекулярными массами 100 000 и 50 000. В структурной организации фермента, возможно, и в его действии, существенную роль играет гидрофобное окружение молекул липидов. Высказывалось даже предположение, что они принимают непосредственное участие в переносе ионов. Ферменты, образующие кальциевые насосы в мембранах саркоплазматической сети мышечных волокон, жестко связаны с мембранами и проявляют активность только в контакте с липидами. От кальциевого насоса требуется очень большая производительность. За очень короткое время после сокращения мышечного волокна надо снизить концентрацию ионов кальция в саркоплазме мышечного волокна от значения 10 -6 моль до значения, меньшего 10-7 моль, при концентрации кальция в пузырьках саркоплазматической сети, равной 10~3 моль. Поэтому белки, участвующие в работе кальциевого насоса, составляют в мембранах саркоплазматических пузырьков около 60% их общего веса. Белки кальциевого насоса называют ферментами Са2+ -зависимой АТФ-азы. Они могут быть выделены из мембран саркоплазматической сети. Белки кальциевых насосов, выделенные из мембран саркоплазматической сети, в растворе с липидами при встряхивании входят в состав образующихся небольших пузырьков — липосом. Если в такой раствор добавить молекулы АТФ и ионы кальция, то последние накапливаются внутри липосом. Такие эксперименты подтверждают, что кальциевые насосы при переносе ионов кальция через мембраны внутрь липосом используют энергию гидролиза молекул АТФ. Установлено, что при активном переносе через мембраны саркоплазматической сети мышечных волокон двух ионов кальция затрачивается энергия гидролиза одной молекулы АТФ. Возможная модель работы кальциевого насоса сводится к следующему. Кальциевый насос захватывает два иона Са2+ и одну молекулу АТФ, несущую 93 четырехкратный отрицательный заряд. Фермент, входящий в состав белков кальциевого насоса, в присутствии ионов кальция вызывает гидролиз молекул АТФ. Энергия гидролиза вызывает конформационные изменения других белков, входящих и состав насоса, которые в свою очередь вызывают перемещение ионов кальция внутрь пузырька саркоплазматической сети. Конечно, такое описание не объясняет процесс перемещения ионов кальция. Характер преобразований в белках кальциевого насоса и механизм использования энергии гидролиза молекул АТФ остаются невыясненными. 10.2. Энергетизованное состояние мембраны Согласно гипотезе Митчелла, в клетках имеется только два типа насосов: протонные во внутренних мембранах митохондрий, в мембранах тилакоидов, входящих в хлоропласты зеленых растений, и в мембранах бактерий и натрий-калиевые в цитоплазматических мембранах клеток. Эти насосы управляют перемещениями других молекул и ионов через мембраны. В цитоплазматической мембране энергетизованное состояние создается натрий-калиевым насосом, который использует энергию гидролиза молекул АТФ, синтезируемых в митохондриях. Натрийкалиевый насос переносит из внутренней области клетки во внешнюю среду три иона натрия в обмен на два иона калия, которые перемещаются внутрь клетки. При таких перемещениях ионов создается разность концентраций ионов натрия и калия и трансмембранный потенциал на мембране (отрицательный знак внутри клетки). Протонные насосы, имеющиеся во внутренних (сопрягающих) мембранах митохондрий и тилакоидов, за счет энергии дыханиясоздают значительную разность электрических потенциалов (до 220 мВ) и значительный градиент концентрации протонов. Переход мембраны в такое возбужденное (энергетизованное) состояние при принудительном переносе через мембрану протонов характеризуется электрохимическим мембранным потенциалом. Этот потенциал слагается из двух компонент: 1) разности электрических потенциалов с положительным знаком на той стороне мембраны, куда перемещаются протоны; 2) химического (осмотического) потенциала, пропорционального разности значений рН на обеих сторонах мембраны. Разность электрических потенциалов действует на все ионы, находящиеся в мембране. Химическая (осмотическая) часть потенциала оказывает действие только на протоны. Используя различные ионофоры, можно измерить отдельные компоненты электрохимического потенциала мембраны. Так, например, поскольку валиномицин увеличивает проницаемость мембраны для ионов калия, то присутствие молекул валиномицина в мембране вызывает выравнивание электрических потенциалов и остается только химическая часть потенциала, обусловленная разностью значений рН. 94 Ионофор нигерицин вызывает почти электрически нейтральный обмен протонов на ионы калия. Поэтому его наличие в мембране вызывает выравнивание значений рН, но сохраняет значение разности электрических потенциалов. Полный электрохимический потенциал, независимо от того, из каких компонент он составлен, может быть измерен в энергетических единицах. Его можно определить как энергию, требуемую для перемещения протонов против направления поля, создаваемого этим потенциалом, т. е. в сторону более высокой концентрации протонов. Эта энергия выделяется при обратном движении протонов. Согласно Митчеллу, полный электрохимический потенциал мембраны с помощью специальных ферментов используется для перемещения ионов и молекул в направлении увеличения их концентраций и для синтеза молекул АТФ. Полный электрохимический потенциал на сопрягающих мембранах митохондрий равен примерно 5,3 ккал/моль (0,23 эВ), на цитоплазматических мембранах бактерий его значение составляет 4,4 ккал/моль (0,19 эВ). Большая разница в концентрациях ионов натрия внутри и вне клеток используется ими для активного транспорта через плазматические мембраны cахаров и аминокислот (например, в кишечнике и почках). Ионы натрия образуют тройной комплекс с переносимой молекулой и молекулой-переносчиком и перемещаются внутри мембраны под действием градиента электрического поля мембраны. Совместный перенос ионов натрия и некоторых сахаров и аминокислот через мембраны клеток почек и кишечника называется симпортом. В ряде случаев установлены белковые соединения, играющие роль переносчиков молекул через мембраны. Так, при исследовании транспорта молочного сахара (лактозы) через цитоплазматическую мамбрану бактерии E-coli Моно, Коен и Рикенберг в Пастеровском институте (Париж) установили, что носителем лактозы является гидрофобный белок, находящийся внутри мембраны, и что процесс транспорта напоминает каталитическую реакцию, инициируемую ферментом. Они показали, что система активного транспорта в мембране этой бактерии приводит к 500кратному повышению концентрации лактозы внутри клетки по сравнению с концентрацией вне ее. Белок, участвующий в переносе лактозы, по мнению группы Моно, осуществляет эту функцию путем ряда конформационных преобразований, происходящих при затрате энергии. В качестве наглядной, хотя и мало убедительной, иллюстрации этого процесса предложена «модель транспорта», изображенная на рис. Рис. Механизм активного транспорта: переносимая молекула S в растворе с наружной стороны мембраны 1) захватывается «носителем», который при этом меняет свою форму (2) 95 затем носитель поворачивается на 1800 (3), изменяет свою форму и освобождается от молекулы S (4), опять изменив свою форму (5) и поворачивается, возвращаясь н исходное состояние. Гидрофобный белок, переносящий лактозу, представлен в виде «вращающейся двери». Он имеет углубление с внешней стороны мембраны, способное захватывать молекулу лактозы. После захвата молекулы лактозы этот белок изменяет свою форму и поворачивается так, чтобы освободить ее на другой стороне мембраны. После этого он снова меняет форму и еще раз поворачивается на 180°. Далее восстанавливается первоначальная форма переносчика, и он способен повторить новый цикл. В 1965 г. Кеннеди и Фокс в Гарвардской медицинской школе определили состав белкового переносчика и показали, что он способен как фермент присоединять лактозу. В 1970 г. Кабан с сотрудниками показали, что энергия, требуемая для активного транспорта лактозы бактерией E-coli, выделяется при окислении до СО2 и Н2 О молочной и янтарной кислот: Однако до сих пор молекулярный механизм процесса переноса лактозы через мембрану и способ использования энергии окисления в этом процессе остаются невыясненными. С помощью молекул-переносчиков осуществляется транспорт через мембрану многих соединений. Например, таким образом переносятся молекулы глюкозы в эритроциты крови. Транспорт веществ при участии переносчиков отличается рядом свойств от прямого пассивного транспорта. Он очень специфичен, так как переносчики присоединяют только определенные вещества. Проявляется также зависимость насыщения от скорости переноса и от концентрации переносимого вещества. Насыщение наступает тогда, когда все молекулыпереносчики использованы для транспорта переносимых молекул. Наконец, так же, как при каталитических реакциях, осуществляемых ферментами, процесс транспорта молекул и ионов при участии переносчиков зависит от рН среды и подвержен действию ингибиторов и активаторов. Например, инсулин активирует транспорт глюкозы в некоторые клетки млекопитающих. 10.3. Окислительное фосфорилирование Для переноса через мембрану молекул и ионов из области малой их концентрации в область большой концентрации необходимо поддерживать 96 (раздельно или вместе) разность концентраций протонов (или ионов натрия) и разность электрических потенциалов на двух поверхностях мембраны независимо от того, происходит такой перенос с участием или без участия переносчиков. Непрерывное поддержание такого «возбужденного» состояния мембраны требует затраты клеткой энергии. Если в клетку не поступает энергия, то разности потенциалов и концентраций веществ на поверхностях ее мембран выравниваются и клетка умирает. Энергоснабжение клеток всех живых организмов происходит за счет окисления пищевых продуктов (дыхания) у животных и фотосинтеза у растений. При окислении органических веществ электроны от окисляемого вещества переходят к кислороду. Энергия, выделяемая в процессе окисления, у высших животных первоначально используется во внутриклеточных органеллах — митохондриях для синтеза, с помощью особых ферментов, называемых АТФ-азами, молекул аденозинтрифосфата (АТФ) из молекул аденозиндифосфата (АДФ) и фосфорной кислоты (рис.). Химическая реакция АДФ + Н3РО4 → АТФ + Н2О называется фосфорилированием. При наличии специальных ферментов происходит обратная химическая реакция, называемая гидролизом молекул АТФ, так как она требует участия воды. В физиологических условиях при гидролизе молекулы АТФ выделяется около 0,54 эВ A2,5 ккал/моль) энергии. Эта энергия используется клеткой для активного транспорта через цитоплазматическую мембрану многих веществ и ионов и для многих других жизненно важных процессов (синтез аминокислот, белков и других составных частей клетки, выполнение механических движений и т. д.). Процессы окисления пищевых продуктов и фосфорилирования сопряжены между собой. Они осуществляются системой взаимосвязанных ферментов, находящихся в мембранах клеток. Мембраны, содержащие такие комплексы ферментов, называются сопрягающими. Сопряженный процесс окисления и фосфорилирования называется окислительным фосфорилированием. Цитоплазматические мембраны животных и растений и внешние мембраны митохондрий и хлоропластов неспособны к окислительному фосфорилированию. Для активного транспорта ионов и других веществ они используют в качестве источника энергии молекулы АТФ, синтезированные в митохондриях или хлоропластах. Бактерии не имеют внутренних сопрягающих мембран. Поэтому их цитоплазматические мембраны содержат комплексы ферментов, синтезирующие молекулы АТФ за счет энергии окислительного фосфорилирования. Молекулы АТФ используются клеткой для внутренних потребностей (синтез аминокислот, белков и др.) и для активного транспорта. Кроме того, активный транспорт этими мембранами может 97 осуществляться без участия молекул АТФ непосредственно за счет энергии, выделяющейся при окислении органических веществ. У некоторых бактерий (кишечная палочка E-coli) транспорт глюкозы внутрь клетки осуществляется третьим механизмом. Молекулы глюкозы внутри клетки превращаются в молекулы глюкозамопофосфата. Процесс фосфорилирования осуществляется специальными ферментами. Донорами фосфата служат молекулы фосфоэнолпирувата (ФЭП). В результате фосфорилирования количество свободных молекул глюкозы внутри клетки резко уменьшается и в клетку поступают другие молекулы глюкозы механизмом пассивного транспорта. Молекулы глюкозамонофосфата не могут пройти через мембрану и остаются в клетке. Транспорт глюкозы в бактериях, осуществляемый путем фосфорилирования, получил название фосфоэнолпируватной фосфотрансферазной системы. Ее удалось разделить на две последовательные стадии. Вначале на внутренней поверхности мембраны фосфоэнолпируват фосфорилирует растворимый белок. Затем этот белок отдает свой фосфат глюкозе, превращая ее в глюкозамонофосфат. Обе стадии транспорта глюкозы осуществляются разными ферментами. Фермент, осуществляющий первую стадию, лежит на внутренней поверхности мембраны. Фермент, осуществляющий вторую стадию и освобождающий фосфорилированную глюкозу, прочно связан с мембраной. Несмотря на большие успехи, достигнутые биохимиками в определении состава и выделения белков, ответственных за активный транспорт в мембранах, пока еще невозможно на молекулярном уровне объяснить механизм процессов переноса. Остается неясным, как присоединяется субстрат к молекулам-переносчикам, каков характер их движения через мембрану и освобождение на другой ее стороне. 10.4. Активный транспорт в мембранах бактерий Весьма интересные исследования процессов активного транспорта через мембрану бактерий, называемых кишечной палочкой E-coli, провели Лурия с сотрудниками в Массачузетском технологическом институте. С помощью антибиотика колицина им удалось вмешаться в некоторые стадии активного транспорта сахаров внутрь клетки этой бактерии. Опишем кратко результаты этих исследований. Антибиотик колицин является молекулой белка. Он известен в четырех формах: К, Е1, Е2 и ЕЗ. Колицины Е2 и ЕЗ разрушают в клетке механизм синтеза белков. Колицины К и Е1 нарушают механизм активного транспорта сахаров в клетках бактерий. Группа Лурия использовала колицины К и Е1 как средство воздействия на клетки бактерии E-coli. Бактерии E-coli используют несколько различных механизмов для активного транспорта Сахаров и других молекул внутрь клетки. Молекулы глюкозы транспортируются внутрь клетки при участии молекул фосфоэнолпирувата . Для переноса 98 молекул молочного сахара используется энергия окисления молочной и янтарной кислот. Перенос молекул глютамина осуществляется за счет энергии гидролиза молекул АТФ. Было показано, что присоединение белковых молекул колицина К и Е1 к клеткам бактерии E-coli сопровождается прекращением синтеза макромолекул: белков, ДНК, РНК и гликогена. Прекращается также активный транспорт молочного сахара (лактозы), глютамина, различных аминокислот и ионов калия и магния. В то же время клетка продолжает аккумулировать глюкозу, активный транспорт которой обеспечивается непосредственно энергией окисления молочной кислоты. Не нарушались также процессы транспорта веществ, не требующие затраты энергии (пассивный транспорт). Согласно гипотезе Митчелла , которая в настоящее время принимается многими учеными, активный транспорт многих веществ через мембраны осуществляется в том случае, когда на ее поверхности поддерживается разность потенциалов около 200 мВ с положительным знаком вне клетки и отрицательным внутри. Такое состояние мембраны называется энергизированным. Оно обеспечивается за счет энергии переноса электронов при окислении некоторых веществ или гидролиза молекул АТФ. Хотя молекулярный механизм этих процессов совершенно не установлен, использование гипотезы Митчелла оказывается полезным для интерпретации ряда явлений. Молекулы колицина присоединяются к специальным рецепторам — молекулам липополисахаридам, выступающим из внешней жесткой оболочки бактерии. Присоединив молекулу колицина К (или Е1), бактерия некоторое время продолжает функционировать нормально. В этом первом состоянии молекула колицина находится вне бактериальной клетки и может быть удалена путем добавления в раствор фермента трипсина, который расщепляет молекулы колицина, как и другие белковые молекулы Бактерия теряет способность к активному транспорту лактозы и глютамина (рис.), когда молекула колицина проникает через цитоплазматическую мембрану. Одновременно внутри клетки резко уменьшается число молекул АТФ и прекращается синтез белков и молекул ДНК и РНК. Рис. Структурные формулы молекул, переносимых активным транспортом через цитоплазматическую мембрану бактерии E-coli: а — лактоза — молочный сахар (переносится за счет разности потенциалов, возникающей при окислении молочной и янтарной кислот); б — глюкоза (в переносе участвуют молекулы фосфоэнолпирувата) ; в — глютамин (при переносе используется гидролиз АТФ). 99 Переход от активного состояния клетки бактерии ко второму, неактивному, состоянию происходит только в том случае, когда цитоплазматическая мембрана находится в энергизированном состоянии. Следовательно, для прохождения молекулы колицина через мембрану требуется затрата энергии. Скорость перехода зависит от состояния липидов в мембране. Переход затормаживается при охлаждении мембраны или включении в нее липидов с насыщенными углеродными связями, которые делают липидный слой более жестким. Цитоплазматическая мембрана бактерии переходит в энергизированное состояние за счет энергии двух независимых процессов: окисления молочной и янтарной кислот (перенос электрона к кислороду) и гидролиза молекул АТФ. Энергизация мембраны за счет энергии гидролиза осуществляется специальным ферментом АТФ-азой, находящимся в мембране. Этот же фермент может осуществлять обратную реакцию — синтез молекул АТФ из молекул АДФ и фосфата га счет энергии мембраны. Опыты с мутантными бактериями E-coli, лишенными фермента АТФ-азы в цитоплазматической мембране, показали, что при присоединении к ним молекул колицина их поведение существенно отличается от поведения обычной бактериальной клетки. После присоединения молекулы колицина к таким мутантным клеткам также происходит прекращение активного транспорта лактозы, глютамина и ионов К+ и Mg2+, однако внутри клетки не прекращается синтез белков и молекул ДНК и РНК. При этом количество молекул АТФ внутри клетки даже возрастает. Для объяснения наблюдаемых эффектов влияния молекул колицина на нормальные и мутантные бактерии E-coli делается предположение, что внедрение молекулы колицина в клетку сопровождается снижением мембранной разности потенциалов. Снижение разности потенциалов приводит к прекращению активного транспорта лактозы, глютамина, ионов калия и магния через мембрану. В нормальной бактериальной клетке фермент АТФ-аза, находящийся в мембране в безнадежной попытке восстановить необходимую разность потенциалов, производит интенсивный гидролиз молекул АТФ, снижая количество этих молекул внутри клетки. Следствием уменьшения числа молекул АТФ является прекращение синтеза молекул белка, ДНК и РНК. В мутантной клетке, из-за отсутствия фермента АТФ-азы при присоединении молекулы колицина, гидролиэ молекул АТФ в мембране не происходит. Их же синтез внутри клетки продолжается за счет окисления молекул глюкозы, поступление которых внутрь клетки не тормозится молекулами колицина. Число молекул АТФ внутри клетки возрастает. Они используются при синтезе белков и молекул ДНК и РНК. Таким образом, снижение мембранного потенциала в случае мутантных молекул прекращает только активный транспорт лактозы, глютамина и ионов калия и магния. 100 Вопрос о молекулярном механизме происходящих в мембране изменений при присоединении молекул колицина остается открытым. Возможно, что снижение разности потенциалов обусловлено конформационной перестройкой белковых молекул, участвующих в активном транспорте. 11. БИОЭНЕРГЕТИКА 11.1. Метаболические реакции в клетке Источником энергии для ьсех существующих на Земле живых организмов служит солнечный свет. Растения и фотосинтезирующие бактерии непосредственно используют энергию Солнца. В процессе фотосинтеза из воды и углекислоты создаются молекулы глюкозы, а при участии неорганических солей — и другие более сложные органические соединения. Например, при участии ферментов за счет энергии солнечного излучения происходит реакция образования сахара, известная еще в прошлом столетии, В таких реакциях энергия солнечных лучей превращается в химическую энергию. Одним из основных этапов развития жизни на Земле явилось появление зеленых растений. Только зеленые растения используют процесс фотосинтеза для построения своих организмов из углекислоты и воды. Они выделяют в атмосферу кислород, необходимый для всех животных. Животные не могут непосредственно преобразовывать энергию солнечных лучей в химическую энергию. Они пополняют свои энергетические запасы, поедая растения (травоядные) или других животных, питающихся растениями (плотоядные). Для высокоорганизованных живых систем основными питательными веществами служат углеводы, жиры и белки. Путем окисления при дыхании эти вещества превращаются через ряд последовательных этапов в более простые соединения и в конце концов — в двуокись углерода, воду и соединения азота. Некоторые организмы (анаэробные) не нуждаются в кислороде. Они получают энергию при химических реакциях. Например, нитритные бактерии окисляют аммиак до нитритов, нитратные бактерии окисляют нитриты до нитратов. Эти бактерии играют важную роль в круговороте азота. В результате деятельности нитритных и нитратных бактерий аммиак превращается в легко доступные для зеленых растений нитраты. Энергия, выделяемая при химических превращениях в клетках животных, трансформируется, аккумулируется и используется для синтеза новых соединений, создания неравновесных распределений веществ и ионов внутри и вне клеток, для перемещения веществ, движения органов и т. д. Реакция, обратная A5.1), называется окислением. Она сопровождается выделением около 30 эВ энергии. Однако только около 40% этой энергии 101 используется клеткой для полезной работы, остальная часть расходуется в виде тепла. Процесс окисления обусловлен переносом атомов водорода от окисляемой молекулы к другой молекуле, которая рассматривается как восстановитель. В связи с тем что в воде и водной среде клетки всегда присутствуют протоны, при описании процесса окисления достаточно рассмотреть только перенос электронов. Необходимое количество протонов для образования атомов водорода заимствуется из водной среды. Обычно реакции окисления внутри клеток протекают в несколько этапов. Под действием специальных ферментов два электрона переносятся от пищевого вещества на какой-либо первоначальный акцептор. Другие ферменты переносят их далее, вдоль системы переноса электронов ко вторичному акцептору и т. д. Этот процесс заканчивается образованием молекулы воды, для чего каждому атому кислорода требуется два элекэлектрона и два протона. Главными первичными акцепторами электронов в клетках служат окисленные формы НАД+ и НАДФ+ молекул НАД — никотинамидадениндинуклеотид, или пиридиннуклеотид с двумя фосфатными группами, НАДФ — никотинамидадениннуклеотидфосфат, или пиридиннуклеотид с тремя фосфатными группами, и молекулы ФАД — флавинадениннуклеотид, или флавохинон, ФМН — флавинмононуклеотид. Окисленные формы этих молекул играют роль первичных акцепторов электронов и атомов водорода. При присоединении двух атомов водорода, в соответствии с реакцией окисленная форма НАДФ переходит в восстановленную молекулу НАДФ • Н (рис.). Молекула НАД+ имеет такой же активный центр, как и молекула НАДФ+. При присоединении двух атомов водорода, в соответствии с реакцией она превращается в восстановленную молекулу НАД • Н. 102 Рис. Структурные формулы молекул НАД+ и НАДФ+ и реакция приприсоединения к ним атома водорода и электрона. Активные части молекул обведены штриховой линией. Молекулы НАД+ и НАДФ+ являются коферментами, осуществляющими реакции дегидрирования (отнятие двух атомов водорода) у соединений, содержащих группу атомов В присутствии ферментов (пиридинзависимых гидрогеназ) при участии молекул НАД+ и НАДФ+ от такой группы атомов отщепляются два атома водорода (два протона и два электрона). Один протон и два электрона присоединяются к молекуле НАД+ или НАДФ+, преобразуя их в восстановленные формы НАД • Н или НАДФ • Н, второй протон освобождается. По такому механизму, например, происходит окисление молочной кислоты (лактата) с образованием пировиноградной кислоты (пирувата) и НАД • Н Восстановленные молекулы НАД • Н и НАДФ • Н могут служить донорами электронов (восстановителями) в других реакциях. Они принимают участие в большом числе биосинтетических процессов, в частности в синтезе жирных кислот и холестерина. Продукт реакций A5.3а) — пировиноградная кислота — далее подвергается декарбоксилированию При декарбоксилировании от карбоксильной группы отцепляется молекула углекислоты и образуется ацетальдегид. Вся углекислота, которую выдыхают животные, образуется в результате декарбоксилирования карбоксильной группы СООН. Ацетальдегид с помощью кофермента, сокращенно обозначаемого К0А • SH, имеющего на активном конце атомы водорода и серы, преобразуется (активируется) в молекулу, содержащую группу атомов 103 «Активированная» молекула дегидрируется ферментом НАД+ или НАДФ+ по механизму типа A5.3а) до ацетилкофермента А Первичный акцептор электронов — кофермент ФАД, структурструктурная формула которого представлена на рис. 34, при участии ферментов (флавинзависимые дегидрогеназы) производит дегидрирование веществ, содержащих группу атомов Примером такой реакции является дегидрирование янтарной кислоты с образованием фумаровой кислоты Восстановленные пиридиннуклеотиды НАД • Н и НАДФ • Н и восстановленные флавины окисляются кислородом при участии нескольких цитохромов (система переноса электронов). Рассмотренные выше отдельные этапы окислительных процессов происходят в клетках в некоторой последовательности, образуя циклы. Последовательность реакций, в результате которых углеродные цепи сахаров, жирных кислот и аминокислот превращаются в углекислоту, впервые описана Кребсом и получила название цикла Кребса, цикла лимонной кислоты, или цикла трикарбоновых кислот. Непременным участником цикла Кребса являются ацетилкофермент А и кофермент А A5.6). Лимонная кислота не содержит групп атомов A5.3) и A5.7), поэтому она не способна подвергаться непосредственному дегидрированию. Пройдя две стадии предварительной «активации», она преобразуется в изолимонную кислоту, содержащую группу атомов A5.3), которая и подвергается дегидрированию. В последующих процессах дегидрирования, декарбоксилирования и активации молекул с помощью кофермента А выделяются две молекулы СО2 и 8 атомов водорода. 104 Рис. В водной среде ацетилкофермент соединяется с щавелевоуксусной кислотой, образуя лимонную кислоту и свободный кофермент А, согласно реакции В настоящее время установлено, что конечным этапом метаболизма жирных кислот, аминокислот и углеводов является цикл Кребса. Последовательность реакций, в результате которых глюкоза и другие сахара превращаются в пировиноградную кислоту, называется гликолизом. При гликолизе за счет энергии окисления одной молекулы глюкозы синтезируются две молекулы АТФ из молекул АДФ и неорганического фосфата. При этом суммарную реакцию можно записать в виде Здесь и в дальнейшем для краткости фосфорная кислота называется неорганическим фосфатом и обозначается символом Фн. Последующее окисление лактата происходит согласно реакции A5.3а) с образованием пировиноградной кислоты (пирувата). Молекулы аировиноградной кислоты в соответствии с реакциями A5.4) и A5.5) превращаются далее в ацетилкофермент А, а затем через цикл Кребса образуется углекислота и вода. Синтез молекул АТФ в ходе отдельных ферментативных реакций при гликолизе называется субстратным фосфорилированием. Образующиеся молекулы АТФ являются наиболее удобным и универсальным поставщиком энергии для многих биологических процессов. При отсутствии кислорода пировиноградная кислота превращается в молочную кислоту. В клетках дрожжей пировиноградная кислота превращается в ацетальдегид, реакция A5.4), который с помощью особого фермента может принимать атомы водорода от НАД • Н с образованием этилового спирта 105 Процесс окисления аминокислот начинается с отщепления аминогруппы (NH2). Эта стадия реакции называется дезаминированием. Оставшаяся углеродная цепь подвергается дальнейшим превращениям и в конце концов вступает в цикл Кребса. Так, например, аминокислота аланин после дезаминирования дает пировиноградную кислоту, аспарагиновая кислота после дезаминирования дает щавелевоуксусную кислоту. Перенос электронов от питательных веществ к первичным рецепторам электронов, окисленным пиридиннуклеотидам (НАД + и НАДФ+) и флавинам (ФАД и ФМН) является только первой стадией выделения энергии окисления. Основными реакциями, в процессе которых освобождается энергия в форме, удобной для дальнейшего использования клетками, являются реакции окислительного фосфорилирования, при которых синтезируются молекулы АТФ. Такие реакции происходят в системах электронного транспорта, расположенных у многоклеточных животных во внутренних мембранах митохондрий, а в одноклеточных бактериях, не имеющих выделенного ядра,— в цитоплазматической мембране. 11.2. Молекула АТФ как универсальный аккумулятор энергии в клетке Современное представление о процессе окислительного фосфорилирования ведет свое начало от пионерских работ Белицера и Калькара. Калькар установил, что аэробное фосфорилирование сопряжено с дыханием. Белицер [7] подробно изучил стехиометрические отношения между сопряженным связыванием фосфата и поглощением кислорода и показал, что отношение числа молекул неорганического фосфата к числу атомов поглощенного кислорода при дыхании равно не менее чем двум. Он же указал, что переход электронов от субстрата к кислороду является возможным источником энергии для образования двух и более молекул АТФ на один атом поглощенного кислорода. Донором электронов служит молекула НАД • Н, и реакция фосфорилирования имеет вид Кратко эту реакцию записывают в виде Синтез трех молекул АТФ в реакции A5.11) происходит за счет переноса двух электронов молекулы НАД • Н по цепи электронного транспорта к молекуле кислорода. При этом энергия каждого электрона понижается на 106 1,14 эВ. В водной среде при участии специальных ферментов происходит гидролиз молекул АТФ Структурные формулы молекул, входящих в реакции A5.12) и A5.13), приведены на рис. При физиологических условиях входящие в реакции A5.12) и A5.13) молекулы находятся в разных стадиях ионизации (АТФ, АТФ-, АТФ2-, ...). Поэтому химические символы в этих формулах следует понимать как условную запись реакций между молекулами, находящимися в разных стадиях ионизации. В связи с этим увеличение свободной энергии ΔG в реакции A5.12) и ее уменьшение в реакции A5.13) зависит от температуры, концентрации ионов Mg2+, Ca2+ и от значения рН среды. При стандартных условиях ΔG0 ≈ - 0,32 (эВ =7,3 ккал/моль). Если ввести соответствующие поправки с учетом физиологических значений рН и концентрации ионов Mg2+, Ca2+ внутри клеток, а также обычные значения концентраций молекул АТФ и АДФ и неорганического фосфата в цитоплазме клеток, то для свободной энергии гидролиза молекул АТФ получим значение —0,54 эВ (—12,5 ккал/моль). Свободная энергия гидролиза молекул АТФ не является величиной постоянной. Она может быть неодинаковой даже в разных местах одной клетки, если эти места различаются по концентрации АТФ, АДФ, Фн, Mg2+, Ca2+, ... Со времени появления пионерской работы Липмана (1941 г.) известно, что молекулы АТФ в клетке выполняют роль универсального кратковременного хранителя и переносчика химической энергии, используемой в большинстве процессов жизнедеятельности. Выделение энергии в процессе гидролиза молекулы АТФ сопровождается преобразованием молекул При этом разрыв связи, обозначенной символом ~, приводит к отщеплению остатка фосфорной кислоты. По предложению Липмана такую связь стали называть «фосфатной связью, богатой энергией» или «макроэргической связью». Это название крайне неудачно. Оно совершенно не отражает энергетики процессов, происходящих при гидролизе. Выделение свободной энергии обусловлено не разрывом одной связи (такой разрыв всегда требует затраты энергии), а перестройкой всех молекул, участвующих в реакциях, образованием новых связей и перестройкой сольватных оболочек при реакции. 107 При растворении молекулы NaCl в воде образуются гидратированные ионы Na+ и С1-. Выигрыш энергии при гидратации перекрывает затрату энергии при разрыве связи в молекуле NaCl. Было бы странным приписывать этот выигрыш энергии «высокоэргичности связи» в молекуле NaCl. Как известно, при делении тяжелых атомных ядер выделяется большая энергия, что не связано с разрывом каких-либо высокоэргических связей, а обусловлено перестройкой осколков деления и уменьшением энергии кулоновского отталкивания между нуклонами в каждом осколке. Справедливая критика представления о «макроэргических связях» высказывалась неоднократно Тем не менее это представление широко внедрилось в научную литературу. Большой беды в этом нет, если выражение «высокоэргическая фосфатная связь» использовать условно, как краткое описание всего цикла преобразований, происходящих в водном растворе при соответствующем наличии других ионов, рН и т. д. Таблица 8 Итак, понятие энергия фосфатной связи, используемое биохимиками, условно характеризует разность между свободной энергией исходных веществ и свободной энергией продуктов реакций гидролиза, при которых отщепляются фосфатные группы. Это понятие нельзя путать с понятием энергии химической связи между двумя группами атомов в свободной молекуле. Последняя характеризует энергию, необходимую для разрыва связи. 108 В клетках содержится ряд фосфорилированных соединений, гидролиз которых в цитоплазме связан с выделением свободной энергии. Значения стандартных свободных энергий гидролиза некоторых из этих соединений приведены в табл. Структурные формулы этих соединений изображены на рис. Большие отрицательные величины стандартных свободных энергий гидролиза обусловлены энергией гидратации отрицательно заряженных продуктов гидролиза и перестройкой их электронных оболочек. Из табл. 8 следует, что значение стандартной свободной энергии гидролиза молекулы АТФ занимает промежуточное положение между «высокоэнергетическими» (фосфоэнолпирунат) и «низкоэнергетическими» (глюкозо-6фосфат) соединениями. Это одна из причин того, что молекула АТФ является удобным универсальным переносчиком фосфатных групп. С помощью специальных ферментов молекулы АТФ и АДФ осуществляют связь между высоко- и низкоэнергетическимифосфатными соединениями. Например, фермент пируваткиназа переносит фосфат с фосфоэнолпирувата на АДФ. В результате реакции образуется пируват и молекула АТФ. Далее с помощью фермента гексокиназа молекула АТФ может передать фосфатную группу D-глюкозе, превратив ее в глюкозо-6-фосфат. Суммарный продукт этих двух реакций сведется к преобразованию фосфоэнолпируват + D-глюкоза ↔ пируват + D-глюкозо-6-фосфат. Весьма важно, что реакции этого типа могут проходить только через промежуточный этап, в котором обязательно участвуют молекулы АТФ и АДФ. 11.3. Митохондрии — энергетические фабрики клеток Одноклеточные животные — бактерии и синезеленые водоросли — не имеют выделенных ядер, содержащих генетический материал ДНК. Их называют прокариотами. Не имеют они и выделенных специализированных органелл для усвоения пищи и синтеза АТФ. Это клетки малых размеров. Их энергоснабжение полностью обеспечивается дыхательными ферментами и системами фосфорилирования, локализованными в поверхностной мембране. Все другие живые организмы — эукариоты (животные, зеленые растения и водоросли, грибы и простейшие) — имеют сравнительно крупные клетки. Так, объем клеток тканей млекопитающих в тысячи раз превышает объем клеток бактерий. В состав таких крупных клеток входит ядро, содержащее молекулы ДНК и РНК, рибосомы, в которых синтезируются белки, и другие органеллы со специальными функциями. Потребность крупных масс цитоплазмы клеток эукариотов не может быть удовлетворена только за счет молекул АТФ, образующихся в цитоплазматической мембране. Поэтому клетки этих животных содержат специализированные органеллы — митохондрии. 109 Как показали Кеннеди и Ленинджер в 1949 г., основное назначение митохондрий состоит в снабжении клеток энергией за счет окислительного фосфорилирования пищевых продуктов. Это своеобразные энергетические станции клеток. Митохондрии представляют собой специально организованные надмолекулярные комплексы, находящиеся в цитоплазме клеток и имеющие в поперечнике размеры порядка 0,2—5 мкм. Форма мимитохондрий варьирует от эллипсоидальной до вытянутой палочкообразной. Число митохондрий в одних клетках очень мало (несколько штук), в других оно достигает нескольких тысяч и десятков тысяч. В некоторых клетках митохондрии составляют 15 - 20% общего объема цитоплазмы. Рис. Схема строения митохондрии: 1- внешняя мембрана; 2 - внутренняя мембрана с кристами; 3 - пространство между мембранами; 4 - матрице; 5 – цитоплазма клетки. Митохондрии в клетке могут перемещаться, изменять свои размеры и форму, сливаясь между собой или распадаясь на более мелкие. Обычно они сосредоточены в той части клетки, где обмен веществ наиболее интенсивен. Каждая митохондрия окружена двумя мембранами (рис.). Внешняя сравнительно гладкая мембрана имеет строение, совпадающее со строением внешней цитоплазматической мембраны самой клетки. Внутренняя мембрана представляет собой замкнутый мешок с многочисленными складками и выступами, направленными поперек митохондрий. Такие складки называют кристами. Благодаря кристам значительно увеличивается поверхность внутренней мембраны. Полужидкое внутреннее содержимое, ограниченное внутренней мембраной, называется матриксом. Матрикс не сообщается с пространством между мембранами. Толщина внутренней мембраны митохондрий порядка 70—90 А. Количество белков, входящих в состав мембраны, превышает количество липидов почти в два раза. Около одной трети белков внутренней мембраны осуществляют функцию переноса электронов (цитохромы, железопротеиды, флавопротеины). Матрикс и цитоплазма клетки имеют отрицательный потенциал. Жидкость в пространстве между внешней и внутренней митохондриальными мембранами имеет положительный потенциал так же, как и жидкость с внешней стороны плазматической мембраны клеток (см. рис.). Именно такое распределение потенциалов в клетке вызывает необходимость 110 окружения основной мембраны митохондрии дополнительной внешней мембраной. Наличие такой мембраны дает возможность иметь на внешней поверхности внутренней мембраны положительный потенциал, а внешняя мембрана митохондрии значительно сокращает объем, в котором синтезируются молекулы АТФ. В пространстве между внешней и внутренней мембранами митохондрии значительно легче создать нужную концентрацию молекул АДФ и неорганического фосфата, необходимых для синтеза молекул АТФ, чем в большом объеме клетки. У митохондрий обнаружены некоторые свойства, весьма напоминающие свойства бактерий. Это дает основание считать, что митохондрии в клетках произошли от каких-то примитивных организмов, подобных бактериям, которые проникли в клетку, содержащую ядро, и превратились в эндосимбионтов. Митохондрии почти не отличаются от бактерий по размерам. Состав липидов в мембранах бактерий и внутренних мембранах митохондрий почти одинаков. Митохондрии имеют автономный механизм синтеза белков и нуклеиновых кислот (молекулы ДНК, РНК, рибосомы), позволяющий им синтезировать свои собственные белки. Весьма интересно, что митохондриальная ДНК имеет кольцевое строение, как и ДНК бактерий [54]. Если митохондрии в свое время возникли в клетках эукариотов путем эндоцитоза (захвата клеткой) небольших одноклеточных организмов, то легко понять характер распределения электрического потенциала на поверхностях их двух мембран. Внешняя мембрана митохондрии является частью внешней мембраны клетки (рис.). Рис. Захват (эндоцитоз) бактерии клеткой. Митохондрии отличаются от остальных внутриклеточных органелл клетки тем, что в зависимости от условий существования они могут находиться как в функционально активной, так и в неактивной форме. Одним из ярких примеров того, насколько резкими могут быть изменения структуры митохондрий и содержания в них ферментов, служат глубокие изменения свойств дрожжей при изменении внешних условий. Дрожжи, выращенные в анаэробных условиях и использующие только брожение как источник энергии, имеют слаборазвитые митохондрии с упрощенной внутренней мембраной, лишенной крист и не содержащей основных компонент дыхательной системы. Если к таким клеткам подвести кислород, то в цитоплазме происходит образование митохондрий, во внутренних мембранах митохондрий начинает осуществляться биосинтез дыхательных 111 ферментов, резко повышается поглощение кислорода. Окисляя глюкозу при поглощении кислорода до СО2 и Н2 О дрожжи получают в 19 раз больше энергии, чем в случае, когда при брожении процесс заканчивается образованием этилового спирта. Первая стадия извлечения энергии в митохондриях осуществляется ферментами цикла Кребса, находящимися в матриксе митохондрий. Образованные в результате этих реакций восстановленные пиридиннуклеотиды (НАД • Н, НАДФ • Н) и флавины подвергаются дальнейшему окислению при участии нескольких переносчиков электронов, входящих в систему электронного транспорта — дыхательной цепи, находящейся во внутренних мембранах митохондрий. Итак, восстановленные пиридиннуклеотиды и флавины являются основными промежуточными звеньями, передающими по два атома водорода атому кислорода с образованием воды. Такая передача атомов водорода осуществляется путем переноса электронов по цепи электронного транспорта и заимствования протонов из жидкости в пространстве между внешней и внутренней мембранами митохондрий. 11.4. Цепь электронного транспорта в митохондриях Перенос электронов в мембранах митохондрий осуществляется последовательно системой переносчиков, которые объединяются в высокоорганизованные комплексы белковых молекул, входящих в состав мембран. На каждом этапе электрон переходит при понижении свободной анергии от одной молекулы к другой. Молекула, отдающая электрон, называется донором (восстановителем), молекула, принимающая электрон, называется акцептором (окислителем). Процесс передачи электрона сопровождается окислением донора и восстановлением акцептора. Поэтому он называется окислительно-восстановительной реакцией. Иногда окислительно-восстановительная реакция сопровождается и перепередачей протона. В этом случае донор теряет атом водорода, а акцепакцептор приобретает атом водорода. Отрыв атома водорода от молекулы называется дегидрированием. Дегидрирование в некотором смысле эквивалентно окислению. Иногда одновременно передается электрон и атом водорода. Донор и акцептор (восстановитель и окислитель) образуют сопряженную восстановительно-окислительную пару. Способность донора отдавать электрон сопряженному акцептору принято характеризовать окислительновосстановительным или редокс-потенциалом φ. В табл.приведены значения окислительно-восстановительных потенциалов φ° некоторых сопряженных пар, находящихся в стандартных условиях (одномолярные концентрации, рН7, температура 25° С) [40]. Окислительно -восстановительный потенциал φ° выражается в вольтах и может быть как положительным, так и отрицательным. Он характеризует относительное изменение свободной энергии системы при переносе двух электронов между компонентами восстановительно-окислительных пар. 112 Таблица При исследовании переходов с участием промежуточных со- При исследовании переходов с участием промежуточных состояний надо рассматривать только разность потенциалов конечного фк и начального срн состояний, так как промежуточные состояния восстанавливаются и тут же окисляются. Если разность φк – φн положительна, то переход электрона связан с выделением энергии е(φк – φн). Например, при переходе двух электронов от НАДФ • Н к двум цитохромам с (Fe+) выделяется энергия 0,22 + 0,32 = 0,54 эВ. Если разность φк – φн отрицательна, то переход требует затраты энергии. Другими словами, переход электрона связан с выделением энергии при перемещении но градиенту потенциала φ°, т. е. в направлении увеличения окислительно-восстановительного потенциала. Следует, конечно, иметь в виду, что такие энергетические оценки могут иметь только качественное значение, во-первых, потому что условия в клетке отличаются от стандартных и, во-вторых, потому что потенциалы φ°, как и свободные энергии, характеризуют равновесные состояния, а процессы переноса электронов являются существенно неравновесными. Если известны концентрации доноров [D] и акцепторов [А] в клетке, то реальный окислительно-восстановительный потенциал φ° выражается при n-электронном переносе через стандартный потенциал φ° с помощью уравнения Нернста где F — число Фарадея; R — газовая постоянная. Для двухэлектронных переносов это уравнение может быть записано в виде Перенос электронов (атомов водорода) в сопряженной восстановительноокислительной паре осуществляется при участии специальных ферментов. Согласно современным представлениям наиболее вероятная схема переноса электронов по дыхательной цепи внутренних мембран 113 митохондрий может быть описана следующим образом. От питательных веществ (пируват, сукцинат, малат и др.) — субстратов (S • 2Н) — ферменты — пиридинзависимые дегидрогеиазы — переносят два атома водорода (два электрона) к молекулам НАД +, которые выступают как первичные акцепторы электронов. При этом свободные ионы Н+ переходят во внутреннюю область митохондрий (матрикс), где они вместе с ионами гидроксила ОН- образуют молекулы воды. Эти реакции можно записать в виде где S — окисленный субстрат. В дальнейшем от молекулы НАД • Н прямой перенос пары атомов водорода на молекулы флавинмононуклеотида (ФМН) осуществляют ферменты — флавинзависимые дегидрогеназы. В результате образуются восстановленные молекулы ФМН • Н 2, согласно реакции, происходящей с внутренней стороны сопрягающей мембраны, В этой реакции молекула НАД • Н передает свои два электрона и один протон молекуле ФМН, второй протон заимствуется из окружающей среды. Молекула ФМН располагается на внутренней стороне сопрягающей мембраны. По-видимому, она присоединена к большой белковой молекуле, которая пронизывает мембрану насквозь. Образующаяся в результате реакции A6.3) молекула ФМН•Н2 передает (возможно, через канал присоединенной к ней белковой молекулы) два атома водорода на внешнюю поверхность сопрягающей мембраны. Там атомы водорода ионизируются. Электроны переходят на два желевосерных белка (FeS), а оставшиеся протоны — в среду на внешней стороне сопрягающей мембраны. Отдав два протона и два электрона, молекула ФМН • Н 2 возвращается в свою первоначальную форму (ФМН) и может быть снова восстановлена молекулой НАД • Н2 с помощью реакции A6.3). Рис. Структурная форма убихинона (K.Q): а — окисленная форма; б — восстановленная форма. Железосерные белки принимают и отдают электроны по одному. Эти электроны передаются небольшой кольцеобразной молекуле — окисленной форме убихинона (рис.), называемой коферментом 114 убихиноном («вездесущий хинон») и обозначаемой буквой Q. В полностью окисленном состоянии (без двух атомов водорода) оба атома кислорода присоединены к кольцу двумя химическими связями. Присоединение одного электрона от молекулы (FeS) и протона из окружающей среды к одному атому кислорода переводит кофермент убихинон в семихинонное состояние QH*. Присоединение злектрона и протона ко второму атому кислорода преобразует молекулу Q в восстановленную форму QH 2. Молекулы убихинона растворимы в липидном слое мембраны, поэтому они могут мигрировать от одной стороны мембраны к другой. Молекулы убихинона осуществляют перенос электронов от железосерных белков к другим составным частям цепи электронного транспорта митохондрий, которые называются цитохромами. Механизм такого переноса недостаточно ясен. Основными элементами цепи электронного транспорта, которую часто называют дыхательной цепью митохондрий, являются пять различных молекул цитохромов. Они обозначаются латинскими буквами b, с, c1, а и а3 . Возможную последовательность переноса пары электронов по дыхательной цепи можно кратко изобразить схемой В этой схеме компоненты дыхательной цепи располагаются в порядке возрастания окислительно-восстановительных потенциалов. Кроме цитохромов в дыхательную цепь входят молекулы флавинмононуклеотида, железосерные белки, молекулы убихинона и некоторые другие белковые молекулы. Молекулы НАД+ являются главным связующим звеном между циклом лимонной кислоты и цепью электронного транспорта, черев которую пара электронов передается атому кислорода. Говорят о переносе пары электронов, потому что электроны появляются парами на молекуле НАД•Н2. Заканчивается цепь переносом двух электронов к атому кислорода. Внутри цепи электроны переносятся по два и по одному. Цитохромами называются белковые молекулы, содержащие железопорфириновые кольца, близкие по строению к гемам в молекуле гемоглобина (см. рис.). Цитохромы, входящие в состав дыхательной цепи, исключительно важны, так как именно они позволяют осуществлять окисление пищевых продуктов кислородом воздуха. Предполагается, что появление молекул цитохромов в клетках около полутора миллиардов лет тому назад привело к существенному скачку в развитии жизни на Земле, так как позволило клеткам значительно улучшить использование энергии пищевых продуктов, доводя их окисление до СО2 и Н2О. В геме четыре лигандные группы плоского порфиринового кольца (см. рис.) образуют комплекс с ионом железа, находящемся в центре кольца. В образовании этого комплекса участвуют четыре из шести 115 координационных валентностей иона железа. Оставшиеся две валентности иона железа расположены перпендикулярно плоскости кольца. В миоглобине и гемоглобине одна из валентностей используется для образования связи с гистидиновым остатком белковой цепи, а шестая участвует в присоединении молекул кислорода. В цитохромах пятая и шестая валентности участвуют в удержании боковых групп аминокислотных остатков белковых цепей. Поэтому ионы железа в гемах цитохромов не могут переносить молекулярный кислород. Гемоглобин переносит молекулы кислорода. При присоединении молекул кислорода к гемоглобину или миоглобину ион железа остается двухвалентным. Цитохромы же осуществляют окислительновосстановительные реакции путем отрыва электрона (окисление) и присоединения электрона (восстановление) к ионам железа, входящим в состав их гемов. При окислении ион железа из двухвалентного состояния Fe2+ переходит в трехвалентное состояние Fe 3+. При восстановлении происходит обратное преобразование. Цитохромы с ионами Fe 2+ и Fe3+ называются ферроцитохромами и феррицитохромами. В окислительновосстановительной реакции всегда участвуют два электрона, и, следовательно, должны участвовать два цитохрома. Например, отрыв двух атомов водорода от субстрата SН2 осуществляется при восстановлении двух феррицитохромов (Fe3+) до ферроцитохромов (Fe2+): Если окислительно-восстановительный процесс протекает через несколько последовательных одноэлектронных состояний, то промежуточные продукты будут содержать неспаренные электроны (свободные радикалы). Образование радикалов зарегистрировано сигналами электронного парамагнитного резонанса при работе митохондрий. Все цитохромы подразделяются на три главных класса а, b, с в зависимости от положения полос поглощения в спектрах. В табл. приведена длина волны λ максимумов полос поглощения цитохромов. Таблица 116 Весьма интересно, что в мембранах пузырьков — липосом, образованных в суспензии, содержащей фрагменты сопрягающих мембран митохондрий, расположение белковых молекул обратное их расположению в сопрягающих мембранах, находящихся внутри митохондрий. Белки, выступающие в сторону матрикса на внутренней поверхности сопрягающих мембран митохондрий (цитохромы b и а3, ФМН ...), в мембране липосомы располагаются на внешней поверхности и, наоборот, белки, находящиеся на внешней поверхности сопрягающих мембран митохондрий (цитохромы a, с1 , с ...), в липосомах находятся на внутренней стороне мембраны. Таким образом, мембрана липосомы представляет собой как бы «обращенную» сопрягающую мембрану митохондрий. Это замечательное свойство дает возможность с помощью внешних воздействий на мембраны липосом изучать поведение белков, которые в естественных условиях в митохондриях расположены на трудно доступных внутренних поверхностях сопрягающих мембран. При переносе пары электронов по всей дыхательной цепи A6.4) от НАД • Н к молекулярному кислороду, согласно данным табл., в стандартных условиях выделяется энергия, равная 1,14 эВ. Она расходуется на синтез трех молекул АТФ из молекул АДФ и неорганического фосфата. Суммарные уравнения процессов дыхания и фосфорилирования можно записать в виде двух уравнений При стандартных условиях в реакции A6.7) выделяется свободная энергия ΔG° ≈ 1,4 эВ. В реакции A6.8) расходуется энергия 3 X 0,32 ≈ 0,96 эВ. Таким образом, в стандартных условиях полезный коэффициент использования энергии дыхания равнялся бы примерно 69%. В реальных условиях, характерных для митохондрий, это значение может быть иным. Ранее считалось, что синтез молекул АТФ происходит в трех участках дыхательной цепи. Предполагали, что ими являются: область расположения флавопротеидов, так как на участке НАД — Q выделяется около 0,27 эВ энергии, близкой к энергии 0,32, необходимой для синтеза АТФ в стандартных условиях; участок между цитохромом b и цитохромом с, где выделяется около 0,22 эВ энергии и, наконец, участок между цитохромоксидазой и кислородом, на котором выделяется около 0,53 эВ энергии. Согласно экспериментальным данным, только две молекулы АТФ синтезируются при восстановлении каждого атома кислорода до воды. Возможно, что такое уменьшение эффективности синтеза молекул АТФ связано с необходимостью затраты энергии на транспорт молекул АДФ и неорганического фосфата внутрь матрикса и вывод молекул АТФ из этой области. 117 Скорость сопряженных процессов переноса электронов и форилирования во внутренних мембранах митохондрий зависит от кинетики поступления «топлива» (глюкозы, жирных кислот, пирувата, аминокислот и др.), молекул АДФ, неорганического фосфата и молекул кислорода в митохондрии. Главным назначением внутренних — сопрягающих — мембран митохондрий является синтез основных хранителей энергии в клетке — молекул АТФ за счет энергии переноса электронов по цепи окислительновосстановительных ферментов, локализованных в мембране. Плазматические мембраны клеток также способны синтезировать молекулы АТФ путем обращения работы натриевого насоса. При этом они используют энергию перемещения ионов поперек мембраны в направлении их меньших концентраций. Ферменты, осуществляющие синтез молекул АТФ из молекул АДФ и неорганического фосфата одинаковы в сопрягающих мембранах митохондрий и в цитоплазматических мембранах бактерий. Гипотезы о механизме фосфорилирования во внутренних мембранах митохондрий. До сих пор остается нерешенным вопрос о механизме использования энергии, выделяемой при переносе электронов, ферментаферментами, синтезирующими молекулы АТФ. В настоящее время выскавысказываются три гипотезы о механизме такого сопряжения [230]: химическая, конформационная, или механохимическая, и хемиосмотическая, или электроосмотическая. Согласно химической гипотезе, впервые выдвинутой Липманном в 1946 г. и развитой Слейтером в 1953 г. [229], в мембране происходит прямое преобразование химической энергии, освобождающейся при окислении и восстановлении переносчиков электронов в химическую энергию промежуточных соединений, которые с помощью фермента АТФ-азы, находящейся в мембране, обеспечивают синтез АТФ. Физический механизм процесса сопряжения окислительно-восстановительной реакции и фосфорилирования остается неизвестным. Эта гипотеза вызвала возражения в связи с тем, что до сих пор не удалось выделить из митохондриальной мембраны ни одного из постулированных промежуточных продуктов. Конформационная, или механохимическая, гипотеза развивалась в работах Грина с сотрудниками [139, 146, 209]. Согласно механохимической гипотезе, химическая энергия окисления при переносе электронов вызывает конформациониое изменение звеньев цепи электронного переноса, которое приводит к эиергизированному состоянию всей мембраны. Энергия перехода мембраны из энергизированного в основное состояние используется при синтезе молекул АТФ. Молекулярный механизм такого процесса также остается невыясненным. Экспериментальные данные действительно свидетельствуют о структурных изменениях внутренних мембран митохондрий при их 118 энергизации, обусловленной электронным транспортом или действием АТФ . Авторы ряда работ [83, 137, 146, 209] полагают, что структурные изменения мембран происходят под действием электрического поля, возникающего при переносе электронов. Остаются невыясненными вопросы о том, как локальный перенос электронов сказывается на энергизации большого участка мембраны, каков физический механизм использования энергии энергизированного состояния для синтеза молекул АТФ. Против конформационной гипотезы сопряжения иногда высказывается возражение, основанное на несовпадении времен окислительного фосфорилирования и конформационных изменений. Этот вопрос требует специального рассмотрения. Не исключено, что движение электронов адиабатически сопровождается движением конформационного изменения. Это приводит к значительному увеличению эффективной массы электрона и к снижению его скорости. Хемиосмотическая гипотеза предложена Митчеллом в 1961 г. [196]. Большой вклад в развитие этой теории внесли советские ученые В. П. Скулачев и Е. А. Либерман [58, 59, 41]. Хемиосмотическая гипотеза Митчелла получает все новые и новые экспериментальные подтверждения. По-видимому, дальнейшее развитие наших представлений о механизме сопряжения процессов дыхания и фосфорилирования и понимание молекулярных механизмов этих процессов будет происходить на основе этой гипотезы. Поэтому изложим более подробно основные положения гипотезы Митчелла. Хемиосмотическая гипотеза относится к той стадии окислительного фосфорилирования, которая начинается электронным транспортом в дыхательной цепи и заканчивается синтезом молекул АТФ. Основное предположение гипотезы Митчелла сводится к утверждению, что при переходе каждой пары электронов через ферменты дыхательной цепи от молекул НАД • Н к кислороду через мембрану митохондрий из матрикса наружу перемещаются шесть протонов, а внутри матрикса остаются шесть ионов ОН- . Перенос протонов осуществляется тремя циклами так, что пара электронов пересекает мембрану в обоих направлениях три раза. При каждом цикле из матрикса извлекается два протона (рис.). Рис. Схема комплексов ферментов цепи дыхания и фосфорилирования во внутренней мембране митохондрий . Согласно хемиосмотической гипотезе, в сопрягающих мембранах отсутствует прямая связь ферментов дыхательной цепи с ферментами 119 фосфорилирования. Поэтому их можно исследовать раздельно. Сопряжение дыхания и фосфорилирования осуществляется через мембрану.При переносе протонов через мембрану она переходит в энергетизованное состояние, обусловленное возникшими градиентом концентрации протонов и разностью электрических потенциалов поперек мембраны. При переходе сопрягающей мембраны в энергетизованное состояние возникают силы, стремящиеся возвратить протоны обратно в метрике. Под влиянием этих сил протоны проходят по каналу фермента F 0 из внешней области к ферменту F1, расположенному на внутренней стороне мембраны. Энергия перемещения двух протонов используется этим ферментом для синтеза одной молекулы АТФ в матриксе. Протонный градиент сопрягающей мембраны используется также натриевым насосом мембраны, перемещающим ионы натрия наружу в обмен на протоны, движущиеся внутрь матрикса. Такой обмен ионами одинакового знака осуществляется только под влиянием разности концентраций протонов. Электрическое поле мембраны облегчает движение протонов и затрудняет движение ионов натрия. Равновесие наступает, когда градиент концентрации ионов натрия становится равным градиенту концентрации протонов, поддерживаемым внешним источником — дыханием. Протонный градиент сопрягающей мембраны используется также для переноса молекул АДФ и неорганического фосфата в метрике митохондрии и извлечения из него молекул АТФ. Хотя детали молекулярных механизмов указанных выше процессов еще не установлены, многие качественные предположения хемиосмотической гипотезы получили экспериментальное подтверждение. Несомненно, гипотеза Митчелла, дающая качественное описание явлений окислительного фосфорилирования, оказалась весьма полезной, так как стимулировала и, по-видимому, будет стимулировать в дальнейшем теоретические и экспериментальные исследования важных явлений энергообеспечения биологических процессов. 12. ФОТОСИНТЕЗ В БИОСИСТЕМАХ 12.1. Механизм фотосинтеза Фотосинтезом называется процесс преобразования солнечной энергии в химическую энергию в клетках живых организмов. Способностью к фотосинтезу обладают весьма разнообразные организмы: зеленые растения, многоклеточные зеленые, бурые и красные водоросли и некоторые одноклеточные. К одноклеточным фотосинтезирующим организмам относятся синезеленые водоросли, зеленые и пурпурные бактерии. Фотосинтезирующие системы высших растений и водорослей являются основными поставщиками ислорода в атмосферу. На земной поверхности фотосинтез более чем наполовину осуществляется одноклеточными организмами и водорослями. Все фотосинтезирующие клетки содержат один или несколько классов зеленых пигментов, 120 называемых хлорофиллами. Накопление хлорофилла в листьях растений, выращенных в темноте, происходит только при освещении — листья зеленеют на свету. Кроме хлорофилла, большинство фотосинтезирующих клеток содержит еще два типа светопоглощающих вспомогательных пигментов: желтые каротиноиды и синие или красные фикобилины. Эти вспомогательные пигменты придают фотосинтезирующим организмам разнообразную окраску. Например, водоросли и бактерии могут быть бурыми, красными, пурпурными, сине-зелеными и т. д. Простейшими фотосинтезирующими организмами являются синезеленые водоросли. Они существуют в форме одиночных клеток или колониями и могут находиться в почве, пресных водоемах и океанах. Кроме углерода и кислорода живым организмам для синтеза белков и нуклеиновых кислот необходим азот. Из всех живых организмов наиболее независимое существование ведут синезеленые водоросли. Они способны и к фотосинтезу и к фиксации азота из атмосферы. Энергию они получают от Солнца. Источником углерода является СО2, донором электронов для восстановления СО2 является вода. Большинство живых организмов не способно извлекать азот из воздуха. Растения получают большую часть азота из почвы в виде нитратов, которые они восстанавливают до аммиака и аминокислот. Пополнение запасов связанного азота в почве осуществляется азотофиксирующими бактериями, способными восстановить молекулярный азот. Хлорофилл и другие пигменты в синезеленых водорослях и фотосинтезирующих бактериях распределены не равномерно, а разбросаны в виде мелких зерен хроматофоров в цитоплазме клеток. Наряду с другими пигментами синезеленые водоросли содержат синий пигмент фикоцианин. Кроме пигментных молекул хроматофоры содержат ферменты, необходимые для биохимических реакций фотосинтеза. В клетках многоклеточных организмов пигментные молекулы и ферменты фотосинтезирующих систем находятся в небольших органеллах, называемых хлоропластами. В клетках зеленых растений обычно присутствуют как хлоропласты, так и митохондрии. На свету в клетках происходит фотосинтетическое образование глюкозы из СО2 и Н2О и запасание глюкозы в виде крахмала и целлюлозы. В темноте фотосинтезирующие клетки дышат за счет кислорода воздуха и окисляют глюкозу в митохондриях. В каждой клетке высших растений имеется от 20 до 100 хлоропластов. У некоторых водорослей, например у хлореллы, в клетке имеется только один хлоропласт. Хлоропласты высших растений имеют эллипсоидальную форму с размерами осей от 1 до 10 мкм. У хлоропластов низших растений их форма весьма разнообразна: спиральная, звездчатая, пластинчатая. Хлоропласты отделяются от цитоплазмы клеток двумя близко расположенными внешними мембранами. Во внутренней области хлоропласта располагаются граны. Граны представляют собой стопки, составленные из десяти — двадцати, а иногда и большего числа, параллельно уложенных плоских образований, 121 называемых тилакоидами. В некоторых местах тилакоиды уложены весьма плотно. Небольшое число тилакоидов тянется из одной граны в другую. Мембраны тилакоидов являются основными сопрягающими мембранами хлоропластов. Они содержат все главные ферменты, обеспечивающие фотосинтез и фотосинтетические фосфорилирование. Повидимому, молекулы хлорофилла располагаются со стороны внутренней поверхности мембраны тилакоида. В живых клетках полярность мембран тилакоидов обратна полярности сопрягающих мембран митохондрий. У тилакоидов внутренняя поверхность мембраны имеет положительный электрический потенциал, а внешняя — отрицательный. В связи с этим, в отличие от митохондрий, имеющих по одной внешней мембране, у хлорохлоропластов две внешние замкнутые мембраны (мешок в мешке). В состав хлоропластов входят молекулы ДНК, синтезирующие нужные им белки. Поэтому хлоропласты способны к росту и делению. Еще в 1905 г. английский физиолог Блекман считал, что фотосинтез состоит из двух последовательных фаз: быстрой световой реакции и ряда медленных, независящих от света реакций, называемых темновыми. Однако только в 1937 г. Хиллу удалось получить прямое биохимическое доказательство существования независимых световой и темновой фаз фотосинтеза. Он показал, что при освещении растворов, содержащих хлоропласты и некоторые акцепторы электронов (А), например, такие как феррицианид, наблюдалось в отсутствии СО2 выделение молекул кислорода в соответствии с реакцией где ℏω — квант света. Эта реакция получила название реакции Хилла. Тем самым Хилл, а вслед за ним Варбург, Гаффон и другие продемонстрировали возможность разобщения процессов, в которых выделяется кислород, и темновых процессов, сопровождающихся восстановлением двуокиси углерода. В дальнейшем было показано, что в качестве акцептора электронов может выступать также молекула НАДФ +. В присутствии хлоропластов при освещении происходит реакция В 1954 р. Арнон и его сотрудники [71] обнаружили, что освещение растворов хлоропластов в присутствии АДФ и фосфата приводит к образованию молекул АТФ. Этот процесс был нааван фотосинтетическим фосфорилированием, в отличие от окислительного фосфорилирсвания, осуществляемого в митохондриях. В результате многих исследований было установлено, что конечными стабильными продуктами первых световых реакций у высших растений и водорослей являются молекулы АТФ, НАДФ-Н и О2, у бактерий образуются молекулы АТФ и НАД•Н без выделения кислорода. 122 Начальной стадией реакции фотосинтеза является превращение световой энергии в энергию разделенных зарядов, т. е. отщепление электронов от молекул хлорофилла или от некоторого комплекса таких молекул, образующих реакционные центры. Пока неясен механизм, препятствующий рекомбинации зарядов, образующихся в первичной и последующих стадиях реакций переноса электронов во внутренних мембранах хлоропластов. Решение этой проблемы может способствовать созданию искусственных преобразователей солнечной энергии. Молекулы АТФ, НАДФ-Н и НАД-Н, синтезированные во внутренних мембранах хлоропластов, выделяются в строму, содержащую ферменты, осуществляющие темновую часть реакции фотосинтеза — преобразование СОа в углеводы. Темновые реакции мало отличаются от обычных биохимических процессов в клетках. Все специфические особенности фотосинтеза связаны с первичными световыми процессами. Общий баланс энергии в реакциях фотосинтеза показывает, что для преобразования одной молекулы СО2 необходимо затратить энергию трех молекул АТФ и двух молекул НАДФ-Н. У всех фотосинтезирующих организмов, за исключением бактерий, суммарное уравнение фотосинтеза можно представить в виде Реакция A7.3) происходит за счет энергии света при увеличении свободной энергии продуктов примерно на 5,21 эВ. Если учесть, что энергия красного фотона Лео равна примерно 1,7 эВ,то можно убедиться, что, согласно энергетическим оценкам, для осуществления реакции A7.3) необходимо поглощение не менее трех квантов света. Проблема эффективного суммирования энергии этих квантов остается одной из центральных в понимании процессов фотосинтеза на молекулярном уровне. Фотосинтезирующие бактерии не выделяют молекулярный кислород. Вместо воды в качестве доноров электронов они используют либо неорганические соединения (сероводород, тиосульфат, газообразный водород), либо органические вещества (молочную кислоту, изопропиловый спирт). Например, зеленые серные бактерии поглощают сероводород, согласно уравнению Ван-Хиль предложил суммарное уравнение фотосинтеза записывать в более общей форме: В этом уравнении Д-Н2 — донор атомов водорода, а Д — его окисокисленная форма. В роли Д-Н2 может выступать вода, сероводород, изопропиловый спирт или другой возможный донор атомов водорода. 123 У фотосинтезирующих организмов в роли акцептора атомов водорода (электронов) не всегда используется молекула СО2. Например, у азотофиксирующих организмов акцептором атомов водорода, наряду с молекулой СО2 , может служить молекулярный азот. Тогда уравнение фотосинтеза можно записать в виде 12.2. Темновая фаза фотосинтеза При освещении ФСI и ФСII в тилакоидах образуются молекулы АТФ и НАДФ • Н. Эти молекулы используются в строме хлоропластов для осуществления конечной фазы фотосинтеза — преобразование СО2 в углеводы (шестиуглеродные остатки cахаров —- гексозы). Нормальный фотосинтез может происходить только при концентрации СО 2 в воздухе, превышающей 0,008%. В настоящее время в земной атмосфере содержится около 0,03 % углекислого газа. Согласно исследованиям Бассгама [79] для преобразования одной молекулы СО2 необходима затрата энергии двух молекул НАДФ • Н и трех молекул АТФ. Образование двух молекул НАДФ • Н требует четырех квантов света. В самом деле, согласно реакции A7.6) для образования молекулы НАДФ • Н необходимы два электрона, которые могут быть освобождены в активном центре ФСI только при поглощении двух квантов. Если предположить, что при каждом фосфорилировании затрачивается энергия перемещения одного электрона, то синтез трех молекул АТФ потребует поглощения системами ФС1 и ФСП не менее трех квантов. Таким образом, на преобразование одной молекулы СО2 при фотосинтезе необходимо затратить не менее семи квантов света. Темновые реакции преобразования СО2 в углеводы, очевидно, в основном происходят одинаково во всех фотосинтезирующих системах. Возможно, что преобразование СО2 при фотосинтезе осуществляется несколькими путями. Дадим краткое описание одного из них [185]. С помощью особого фермента молекулы СО2 и рибулозодифосфата образуют две молекулы фосфоглицериновой кислоты: Рис. Рибулозодифосфатфосфоглицериновая кислота A7.7) Далее при участии фермента рибулозодифосфаткарбоксилазы две молекулы фосфоглицериновой кислоты преобразуются в две молекулы триовофосфата. Эта реакция требует затраты энергии, которая черпается при сопряжении с реакциями 124 Затем две молекулы триозофосфата объединяются в одну молекулу фруктозодифосфата. Последняя при отщеплении фосфатной группы преобразуется в молекулу глюкозы и молекулу рибулозофосфата. Молекула глюкозы является основным продуктом фотосинтеза. Молекула рибулозофосфата в сопряжении с реакцией гидролиза молекулы АТФ преобразуется в молекулу рибулозодифосфата, которая совместно с СО2 может дать реакцию A7.7) нового цикла. 13. ПЕРЕДАЧА НЕРВНОГО ИМПУЛЬСА 13.1 Нервная клетка — нейрон Основным структурным элементом нервной системы высших животных является нервная клетка — нейрон. Каждая нервная клетка состоит из ядра, тела клетки и многочисленных отростков — дендритов (рис. 50). Рис. Строение нервной клетки: 1 — ядро; 2 — дендриты; 3 – аксон; 4 — миелиновая оболочка; 5 — ядро шванновской клетки. в — перехват Ранвье. Один из дендритов обычно значительно длиннее других. Он называется нервным волокном, или аксоном. Нервное волокно представляет собой полую трубку, стенки которой образованы мембранами, имеющими толщину около 70 А. Структура мембраны нервных волокон близка к структуре плазматических мембран других клеток. Мембранные трубки нервных волокон человека имеют диаметр от 0,1 до 10 мкм. Диаметр нервных волокон других животных может быть значительно больше, например, диаметр самых крупных нервных волокон кальмара — гигантских аксонов — достигает нескольких миллиметров. Нервные волокна имеют длину от долей миллиметра до нескольких метров. Периферические нервные волокна высших животных часто окружены небольшим слоем клеток сателлитов, которые называются шванновскими клетками. Шванновские клетки частично обволакивают нервное волокно и выполняют функцию защитного покрытия. По-видимому, шванновские клетки участвуют в синтезе ферментов и компонентов мембран нервных 125 волокон. Большинство нервных волокон позвоночных животных, кроме самых тонких, окружены также толстой неклеточной жировой оболочкой, которую называют миелиновой оболочкой. Миелиновая оболочка порождается шванновскими клетками. В виде многих слоев oнa оборачивается вокруг нервного волокна. Через каждые 1 - 2 мм по длине волокна миелиновая оболочка прерывается узкими (около 1 мкм) кольцевыми щелями, которые называются перехватами Ранвье (рис. 50). Участок миелиновой оболочки между двумя перехватами Ранвье относится к одной шванновской клетке. Нервные волокна, покрытые миелиновой оболочкой, кажутся белыми. В состав миелиновой оболочки входят белки, липопротеиды и липиды — холестерин и фосфолипиды с насыщенными связями. Она имеет очень высокое сопротивление и выполняет роль изолятора, уменьшающего утечку зарядов между перехватами Ранвье. Нервные волокна многих животных не имеют миелиновой оболочки, хотя и окружены сложной системой шванновских клеток. К таким нервным волокнам, в частности, относится гигантский аксон кальмара, который часто используется в лабораторных исследованиях. 13.2. Немиелинизированные нервные волокна Немиелинизированные нервные волокна представляют собой полые трубки, заполненные электролитом — аксоплазмой — и окруженные мембраной. В живом нервном волокне состав электролита внутри и снаружи разный. Концентрации некоторых главных ионов внутри и снаружи активного аксона кальмара указаны в табл. Таблица В состоянии покоя между внутренней и внешней поверхностью мембраны нервного волокна имеется разность электрических потенциалов 50—70 мВ. Внутри волокна потенциал отрицателен по отношению к внешней среде, потенциал которой обычно принимается равным нулю. Разность концентраций ионов и потенциалов обусловлена работой «ионных насосов», выбрасывающих за счет энергии гидролиза молекул АТФ три иона Na+ из внутренней области аксона и впускающих два иона К+ внутрь волокна. Плохая ионная пропускная способность и большое электрическое сопротивление мембраны способствуют поддержанию такого энергизованного состояния. В состоянии покоя электрическое сопротивление мембраны приблизительно 10 3Ом/см2, электрическая емкость 1 мкФ/см2. Цианистый калий подавляет действие натрийкалиевого насоса. Поэтому отравление нервных волокон цианистым калием приводит к постепенному выравниванию концентраций ионов Na + и К+ внутри и вне аксона. 126 В состоянии покоя мембрана нервного волокна наиболее проницаема для ионов К+. По отношению к ионам К+ проницаемость (Р) других ионов имеет значения Значения Рк, РNa , РCl зависят от уровня мембранного потенциала. В генезисе потенциала покоя гигантского аксона кальмара ведущую роль играют ионы К+. Если бы мембрана была проницаема только для ионов К+, то, согласно уравнению Нернста, разность потенциалов на внутренней и наружной поверхностях мембраны определялась бы соотношением Подставив в это соотношение значения концентраций [К+]сн = = 20 ммоль и [К+]сн = 400 ммоль, получим φ0k= —75 мВ. На разность потенциалов между внутренней и внешней поверхностями мембран оказывают влияние также фиксированные отрицательные заряды на поверхностях мембраны. Они частично экранируются катионами саркоплазмы и внешней среды. Согласно исследованиям Э. П. Бужинского, П. Г. Костюка, А. А. Лева и других ученых, большая часть ионов К+ находится в протоплазме в свободном состоянии. В то же время почти половина ионов Na + в протоплазме либо связана, либо находится в некоторых внутриклеточных образованиях, а ионы Са2+ почти целиком находятся в связанном состоянии [68] с анионами или во внутриклеточных органеллах (митохондрии и др.). Одной из причин (возможно, не главной) меньшей проницаемости мембраны для ионов Na+ по сравнению с проницаемостью для ионов К+ является то, что электрическое поле вокруг иона N +, имеющего меньший радиус (RNa+=0,98 Ǻ, RK+= 1,33 Ǻ), значительно больше поля вокруг иона К+. Поэтому гидратная оболочка вокруг иона Na+ имеет радиус 0,256 нм, а вокруг иона К+ — только 0,198 нм. Проницаемость ионов через мембрану может быть существенно изменена с помощью специальных ингибиторов. Так, например, тетродоксин (ТТХ) — водорастворимый паралитический яд, извлекаемый из некоторых рыб и калифорнийских саламандр, введенный в пространство снаружи аксона, полностью прекращает движение ионов К+ через натриевые каналы нервных и мышечных волокон. Однако, введенный внутрь аксона, он не оказывает никакого действия на проницаемость этих ионов. Противоположное влияние на натриевую проницаемость оказывает батрахотоксин (БТХ) — стероидный алкалоид, получаемый из секрета кожных желез колумбийской лягушки. Он повышает проницаемость ионов Na+, вследствие чего потенциал покоя падает и в ряде случаев меняет знак. Батрахотоксин оказывает действие как с внешней, так и с внутренней стороны мембраны. 127 Другой ингибитор — тетраэтиламмоний (ТЭА), введенный внутрь аксона, не изменяет проницаемости ионов Na +, но полностью прекращает движение ионов К+ через мембрану. Указанные выше свойства ингибиторов ТТХ и ТЭА свидетельствуют, что прохождение ионов натрия и калия через мембраны происходит независимо. Такие ингибиторы позволяют изучать раздельно прохождение через мембрану ионов обоих типов. Исследования показали, что проницаемость мембраны для ионов Na + и К+ зависит от температуры и значения разности потенциалов Δφ = φвн - φсн на мембране. При изменении Δφ особенно существенно изменяется проницаемость ионов Na +. Уменьшение абсолютной величины Δφ, например путем кратковременного приложения внешнего положительного потенциала φg, приводит к резкому увеличению проницаемости ионов Na+ при значениях потенциала φg ≥ φ0g. Пороговое значение φ0g. зависит от концентрации ионов Mg 2+ и Са2+. В нормальных условиях для аксона кальмара φ0g ≈ 15 мВ. Большая специфичность пропускной способности различных ионов мембранами и раздельное действие ингибиторов ТТХ и ТЭА на проницаемость ионов Na+ и К+ стали основанием для представления, что транспорт ионов через мембраны осуществляется с помощью специализированных белково-липидных комплексов, получивших название ионных каналов. Каждому иону соответствует свой канал. Используя свойство тетродоксина прекращать транспорт ионов Na +, т. е. закрывать натриевые каналы, оказалось возможным установить, что на площади 1 мкм2 мембраны находится около сотни натриевых каналов. В состоянии покоя проводимость одиночного натриевого канала оценивается величиной 4 • 10-12 Ом-1, а калиевого — 12 • 10-12 Ом-1. Различные авторы предлагают феноменологические модели, описывающие характер прохождения ионов через каналы с помощью одномерного электрического поля специального профиля, совершенно не затрагивая вопроса о том, как создается это поле. При прохождении иона через мембрану происходит постепенная его дегидратация и замещение молекул воды полярными группами, которые выстилают внутреннюю поверхность канала. На рис. схематически представлены энергетические профили ионов К + и Na+ в предполагаемых мембранных каналах [46]. Рис. Схемы энергетических Профилей ионов К+ и Na+ в мембранных каналах. 128 Подробный анализ различных феноменологических моделей ионионных каналов проведен в монографии В. С. Маркина и Ю. А. Чизмаджиева [47]. Для поддержания разности концентраций ионов внутри и вне нервного волокна на нужном уровне необходима непрерывная работа натриевого насоса в течение всей жизни организма. Эта работа осуществляется за счет энергии гидролиза молекул АТФ. В нервах краба около 50% энергии метаболизма используется натриевыми насосами даже в спокойном состоянии нервных волокон. Гидролиз молекул АТФ осуществляется ферментом АТФ-азой. Для функционирования этого фермента кроме ионов К+ и Na+необходимо присутствие ионов Mg 2+. Источником молекул АТФ служат процессы окислительного фосфорилирования, протекающие в митохондриях. Фермент АТФ-аза входит в состав мембраны и имеет два активных участка: один — на внутренней, другой — на внешней стороне мембраны. Внешний (калиевый) центр взаимодействует с внеклеточными ионами К+. Если ионы К+ отсутствуют во внешней области, работа насоса прекращается. Внутренний (натриевый) участок канала активируется ионами Na+. Молекулярный механизм работы натриевого насоса, использующего энергию АТФ для перемещения ионов Na+ в направлении увеличения их концентрации, неизвестен. Предполагают, что ионы переносятся особыми подвижными переносчиками. Согласно одной ив гипотез, переносчики обеспечивают только транспорт ионов Na+ из протоплазмы. Ионы К+ перемещаются внутрь клетки под действием разности потенциалов, созданной активным транспортом ионов Na+. Согласно этой гипотезе, поток ионов Na+ не должен зависеть от разности потенциалов на мембране (в пределах небольших допороговых изменений), поток же ионов К+ внутрь клетки увеличивается при возрастании равности потенциалов. Это так называемое электрическое сопряжение транспорта ионов Na+ и К+ было подтверждено результатами исследований П. Г. Костюка с сотрудниками [341 на гигантских аксонах виноградной улитки. Следует, однако, отметить, что электрическое сопряжение не дает ответа на вопрос, почему натриевый насос не работает, когда во внешней среде отсутствуют ионы К+. 13.3. Потенциал действия Возбуждение нервного волокна происходит при локальном сверхпороговом уменьшении отрицательного значения потенциала на мембране. Такое изменение можно вызвать искусственно, пропуская кратковременно ток через мембрану с помощью специальных микроэлектродов. Если импульс тока настолько мал, что сдвиг отрицательного потенциала на внутренней стороне мембраны не превышает некоторого порогового значения φ0g, то после выключения возбуждающего тока (стимула) потенциал на мембране медленно и монотонно возвращается к первоначальному значению. Если же сдвиг 129 потенциала превышает пороговое значение φ0g (для этого достаточен импульс тока 10-6 А), то происходит резкое уменьшение отрицательного потенциала и после прекращения стимула. Значение потенциала достигает нуля и продолжает быстро изменяться (~ 0,5 мс) в положительном направлении (происходит обращение знака потенциала — деполяризация мембраны) до некоторого максимального значения (+50 мВ), затем медленно (в течение миллисекунд) возвращается к исходному значению. Весь этот процесс в нерве кальмара длится около 6 мс. Такое спонтанное обращение знака мембранного потенциала называется потенциалом действия, или спайком. Возникновение потенциала действия обусловлено резким увеличением проницаемости ионов Na + при повышении (уменьшение отрицательного значения) потенциала на внутренней стороне мембраны. Ионы Na+, проникая внутрь волокна, еще более повышают потенциал на его внутренней поверхности. Это приводит к дальнейшему увеличению проницаемости ионов Na+ и возрастанию скорости их проникновения внутрь волокна. Система стремится к равновесному натриевому потенциалу, определяемому концентрацией ионов Na+ снаружи и внутри волокна с помощью формулы Нернста Повышение потенциала на внутренней стороне мембраны вызывает с некоторым запаздыванием медленное увеличение проницаемости мембраны для ионов Na+. Поскольку их концентрация велика внутри волокна, они устремляются наружу. Спустя примерно 0,3 мс после возникновения потенциала действия ионы К + начинают выходить из волокна быстрее, чем входят в него ионы Na+, так как проницаемость ионов Na+ возрастает очень медленно. Возврат мембранного потенциала от максимального значения (около + 50 мВ) к исходному (от -50 до - 70 мВ) происходит не под влиянием обратного движения ионов, а под влиянием выхода наружу ионов К+. Ионы Na+, вошедшие в волокно в период возрастания потенциала действия, выходят из него только в результате работы натриевого насоса. Натриевый и калиевый токи во время спайка очень незначительны. Так, гигантский аксон кальмара при каждом спайке поглощает от 3 • 10 -12 до 4 • 10-12 моль/см2 ионов Na+ и теряет примерно столько же ионов К+. В течение одного импульса концентрация ионов К+ внутри волокна изменяется только на стотысячную часть их общего количества. Поэтому невозможно обнаружить изменения в концентрациях ионов Na+ и К+ в волокне. Гигантский аксон кальмара может провести несколько сот тысяч импульсов после выключения его натриевого насоса, прежде чем концентрации ионов внутри и вне волокна выровняются. После прохождения каждого импульса наступает период невозбудимости — 130 абсолютный рефрактерный период, в течение которого нервное волокно не может возбудить второй потенциал действия. В результате инерционных изменений в проницаемостях ионов, обусловленных деполяризацией мембраны, нервное волокно не может реагировать на второе раздражение. Способность к возбуждению появляется вновь после восстановления норнормальной проницаемости ионов, для этого требуется 0,5—2,0 мс. Амплитуда потенциала действия гигантского аксона кальмара существенно зависит от температуры. Повышение температуры в диапазоне от 6 до 37° С приводит к значительному уменьшению амплитуды спайка. Такая зависимость является прямым следствием ускорения роста калиевой проводимости при повышении температуры. Одновременно увеличивается натриевая инактивация. 13.4. Уравнения Ходжкина — Хаксли В настоящее время не выяснены на молекулярном уровне механизмы процессов, протекающих в мембранах при возникновении потенциала действия. Неизвестны причины, приводящие к изменению проницаемости мембран для ионов натрия и калия при изменении мембранного потенциала. Возможно, что такое изменение связано с конформационными изменениями свойств мембран и ионных каналов при изменении электрического поля в мембране. При разности потенциалов 70 мВ и толщине мембраны 70 А электрическое поле в мембране весьма внушительно: 105 В/см. Несмотря на отсутствие молекулярной теории потенциала действия, имеются феноменологические уравнения, предложенные в 1952 г. Ходжкиным и Хаксли, которые дают количественное описание процесса возникновения потенциала действия в гигантском аксоне кальмара [67, 155]. Эти уравнения описывают временное поведение мембранного потенциала при пространственно-однородном возбуждении нервного волокна. Если φ(t) — потенциал мембраны и С - емкость единицы длины волокна, то временное изменение потенциала определяется уравнением максимально возможная проводимость по натриевым и калиевым каналам; Р — проводимость,, характеризующая ток утечки, переносимый ионами хлора и другими ионами; φ0Na и φ0K — равновесные потенциалы для ионов, определяемые равенствами A8.2) и A8.3); n(φ), m(φ) и h(φ) — функции, зависящие от потенциала φ, изменяющиеся в интервале от нуля до единицы. Эти функции удовлетворяют системе линейных уравнений 131 Функции α и β имеют размерность, обратную времени. Их зависимость от потенциала ф подбирается путем сопоставления теоретических и экспериментальных результатов. Для аксона кальмара эти функции изображены на рис. Рис. Зависимость параметров α и β от мембранного потенциала φ Решение уравнения A8.5) для случая постоянного потенциала имеет вид Для интерпретации феноменологических уравнений Ходжкина — Хаксли иногда используется представление о гипотетических частицах — активаторах, регулирующих проницаемость каналов. Например, полагают, что в калиевом канале имеется четыре одинаковых активирующих частицы и функция n(t) характеризует вероятность того, что n -частица находится в канале. Если допустить, что ион может проходить через канал только в случае, когда в район канала под воздействием потенциала φ(t) подходят одновременно четыре n-частицы, то ток ионов К+ в канале будет определяться выражением которое использовано в уравнении A8.4). Для описания экспериментальных данных о натриевом токе пришлось допустить, что проводимость натриевого канала обусловлена двумя типами частиц: тремя активирующими частицами m и одной инактивирующей частицей h. Натриевый канал пропускает ионы натрия, если в канале одновременно находятся три частицы m и не имеется частиц h. Если m (φ) — вероятность наличия m-частицы в канале, a h(φ) — вероятность отсутствия h частицы, то натриевый ток в канале определяется выражением Как и любые феноменологические уравнения, уравнения Ходжкина — Хаксли имеют ограниченную область применения. Они описывают только сравнительно быстрые процессы, непосредственно связанные с генерацией потенциала действия. Согласно модели Ходжкина — Хаксли, изменения ионных проводимостей при сдвигах мембранного потенциала обусловлены 132 влиянием электрического поля на пространственное распределение в мембране гипотетических заряженных активирующих частиц . Делались многократные попытки обнаружить активирующие частицы в каналах. Пока это никому не удавалось. В связи с необходимостью проверки гипотезы Ходжкина — Хаксли об активации и инактивации ионных каналов гипотетическими активирующими частицами в последнее время большие надежды возлагались на исследования так называемых воротных токов. Воротным током называют дополнительную компоненту тока смещения, обусловленную структурной перестройкой ионных каналов при резком изменении мембранного потенциала. В 1973 г. Армстронгу и Кейнсу с сотрудниками удалось провести измерения воротного тока в натриевых каналах гигантских аксонов. Оказалось, что амплитуда воротного тока в сотни раз меньше амплитуды ионных токов. Поэтому для их измерения приходилось с помощью специальных ингибиторов (ТТХ и ТЭА) подавлять основные ионные токи. При деполяризации мембраны оротный ток направлен от внутренней к внешней стороне мембраны (против направления тока Na +). Примерно за 0,8 мс (при 5°С) он достигает своего максимума, а затем падает по экспоненте. Предложено несколько моделей для объяснения воротных токов. В основном эти модели носили феноменологический характер. Рассматривались движения гипотетических заряженных частиц или переориентация некоторых элементарных диполей, как бы выстилающих поверхности каналов. Эти модели не могли дать ответ на основной вопрос — о природе носителей тока. 13.5. Распространение импульсов по нервным волокнам Потенциал действия — нервный импульс — распространяется вдоль нервного волокна с некоторой скоростью без изменения амплитуды. Перемещение нервного импульса связано с перемещением вдоль волокна локальной деполяризации с положительным знаком заряда внутри мембраны. По мере продвижения волны деполяризации происходит реполяризация, так что в каждый данный момент небольшой участок нервного волокна оказывается деполяризованным. После прохождения нервного импульса через некоторую область волокна наступает рефрактерный период, длящийся от 0,4 до 2 мс в зависимости от диаметра волокна. В течение этого времени волокно не реагирует на другие раздражения. Распространение потенциала действия φ (х, t) вдоль гладкогладкого нервного немиелинизированного волокна описывается системой уравнений Ходжкина — Хаксли 133 где R — сумма внутреннего и внешнего сопротивлений электролитов на единицу длины волокна; J (φ) — плотность электричеэлектрического тока, протекающего через мембрану, Функции n, h и m удовлетворяют системе уравнений A8.5) и A8.6). Уравнение A8.9) является одномерным нелинейным уравнением диффузии. Впервые такие уравнения рассматривались в 1937 г. А. Н. Колмогоровым, И. Г , Петровским и И. С. Пискуновым. Они показали, что любое локальное возмущение в системе, описываемой уравнением типа A8.9), может приводить к уединенной волне, распространяющейся в системе с постоянной скоростью. Свойства такой уединенной волны определяются значениями параметров С и R и видом функции J(φ). Постоянная скорость распространения обусловлена равновесием между выделением и поглощением энергии на каждой единице длины системы. Явное решение уравнения с ионным током A8. 20), зависящим т потенциала φ (х, t), возможно только при использовании вычислительных машин. Для получения аналитических решений вводятся физические модели, отражающие основные особенности распространения импульса вдоль нервного волокна. Простейшая модель сводится к замене тока A8.10) кусочно-постоянными значениями. Учитывая знакопеременность тока, полагают, что в момент включения он направлен внутрь волокна и в течение времени τi имеет постоянное значение Ji. Затем ток меняет направление и в течение времени τj имеет постоянное значение Jj, а затем падает до нуля. В этом случае автомодельное решение уравнения A8.9) сводится к задаче на собственные значения относительно скорости перемещения импульса. Из двух допустимых значений скорости только одна соответствует устойчивому решению. Она выражается через параметры переднего фронта бегущего импульса и порогового значения потенциала φпор с помощью формулы Распространение нервного импульса вдоль волокна напоминает движение солитонов — уединенных весьма устойчивых волн, форма которых не зависит от условий их образования. В отличие от солитонов повторное распространение импульса возможно только после истечения рефрактерного времени. В гладких немиелинизированных нервных волокнах скорость проведения потенциала действия примерно пропорциональна квадратному корню из их диаметра. Относительно высокие скорости проведения нервных импульсов 20—30 м/с) обеспечиваются в таких волокнах за счет увеличения их диаметра. Гигантские аксоны некоторых беспозвоночных животных имеют 134 диаметр 100—1000 мкм. У позвоночных животных повышение скорости передачи импульса достигается путем миелинизации волокон. В миелинизированных нервных волокнах ионы натрия входят внутрь волокна только в перехватах Ранвье. Передача импульса по волокну происходит дискретно-сальтаторно, путем перескока от одного перехвата Ранвье к другому. В этом случае импульс передается быстрее и с меньшей затратой энергии, чем в немиелинизированном волокне сравнимого диаметра. Скорость распространения импульса зависит от расстояний между перехватами, которые в свою очередь определяются диаметром волокна. Эта связь такова, что скорость распространения импульса оказывается пропорциональной диаметру волокна, а не квадратному корню иэ диаметра, как в случае немиелинизированных волокон. Если в немиелинизированных волокнах амплитуда потенциала с повышением температуры уменьшается, то в миелинизированных волокнах эта зависимость выражена слабо, что обусловлено высокой плотностью натриевого тока в перехватах Ранвье. Она почти на порядок выше, чем в гигантском аксоне кальмара. Слабая зависимость амплитуды потенциала действия в перехватах Ранвье от температуры обеспечила работу нервных волокон в органах теплокровных животных. 13.6. Синаптическая передача Передача нервных импульсов между клетками и нервными окончаниями осуществляется через синаптические соединения. Синаптической передачей называется однонаправленная передача нервного импульса от нервного волокна к нервной клетке, к другому нервному волокну, или другим клеткам, например к мышечному волокну. Наиболее хорошо изучены нервно-мышечные соединения. Наблюдаются два типа передачи нервного импульса в синапсах: химическая и электрическая. При электрической передаче (впервые обнаруженной в синапсах речного краба) мембраны на месте контакта двух клеток работают как эффективный электрический выпрямитель, допускающий свободное прохождение тока от пресинаптической мембраны к постсинаптической и препятствующий течению тока в обратном направлении. Ток, проходящий через синаптический контакт, вызывает деполяризацию и возбуждение постсинаптической мембраны. Гораздо чаще осуществляется химическая передача. Еще в 1921 г. Леви показал, что синаптическая передача осуществляется специальными химическими передатчиками — нейромедиаторами, которые синтезируются и накапливаются в пресинаптических нервных окончаниях, а затем освобождаются под действием нервного импульса и передаются постсинаптической мембране. Оказалось, что этими химическими веществами являются небольшие молекулы: ацетилхолин и родственные ему соединения (рис.), норадреналин, доиамин, гистамин и др. 135 Рис. Структурные формулы молекул иытермедиатов в химических синапсах: Синаптическая передача может быть возбуждающей и тормозящей. При возбуждающей передаче происходит деполяризация постсинаптической мембраны, что, при достижении определенного критического уровня, приводит к возникновению нервного импульса в постсинаптической мембране. Деполяризация постсинаптической мембраны вызывается молекулами нейромедиатора. В нервно-мышечном соединении и во многих других синапсах таким медиатором является молекула ацетилхолина. При тормозящей передаче нейромедиатор вызывает временное повышение мембранного потенциала на постсинаптической мембране. В связи с этим для ее возбуждения надо приложить больший пороговый деполяризующий потенциал. Характер синаптической передачи зависит не только от природы медиатора, но и от химической восприимчивости постсинаптической мембраны. Так, ацетилхолин оказывает возбуждающее действие в нервномышечных синапсах и служит тормозящим средством для сердца позвоночных животных, снижая частоту его сокращений. В синаптическом соединении мембраны двух клеток отделены одна от другой узкой синаптической щелью. В области щели обе мембраны более толстые и плотные, чем в других участках клетки. В области пресинаптической мембраны располагаются синаптические пузырьки, в которых находятся молекулы медиаторов. Количество и расположение пузырьков зависит от типа клеток, между которыми передается нервный импульс. 13.7. Нервно-мышечные синапсы В области соединения нервного окончания с мышечным волокном нервное волокно, лишенное миелиновой оболочки, расщепляется на тонкие окончания. Каждое такое окончание располагается в мелкой канавке на поверхности мышечного волокна. Между нервным волокном и канавкой имеется щель толщиной около 500 А, которую называют синаптической щелью. Она заполнена жидкостью. Внутри нервных окончаний вдоль части мембраны, прилегающей к синаптической щели, примерно на расстояниях 1 мкм имеются области, содержащие крошечные пузырьки. В каждом пузырке имеется около 104 молекул ацетилхолина. В мембранах мышцы против этих областей имеются значительные углубления, содержащие белковые молекулы —рецепторы молекул ацетилхолина (рис.). 136 Рис. Схематическое изображение поперечного сечения нервно-мышечного синапса: 1 — мембрана нервного волокна; 2 — аксоплазма с синаптическими пузырьками, содержащими ацетилхолин; 3— шванновская клетка; 4 — мембрана мышечного воволокна; 5 — углубления в мембране, содержащие рецепторы ацетилхолина. Нервный импульс, прибывающий к нервному окончанию, вызывает поток ионов Са+ через их мембрану, что способствует соединению синаптических пузырьков с мембраной и выбросу путем экзоцитоза содержащихся в них молекул ацетилхолина в синаптическую щель. Молекулы ацетилхолина диффундируют к мембране мышечного волокна и примерно через 0,3 мс соединяются с рецепторными молекулами, которые открывают натриевые каналы в мембране мышцы. При каждом импульсе открывается около 2000 каналов. Возникающий вследствие открытия каналов поток ионов Na+ внутрь мышечного волокна вызывает электрический ток, деполяризующий мембрану. Эту деполяризацию называют потенциалом концевой пластинки, или возбуждающим постсинаптическим потенциалом. При нормальных условиях такой потенциал превышает пороговое значение и индуцирует в мембране мышечного волокна импульс, который и вызывает затем сокращение длины мышечного волокна. Чтобы предотвратить повторное действие молекул ацетилхолина, поступивших в синаптическую щель, эти молекулы расщепляются на ацетат и холин специальным ферментом ацетилхолинэстеразой. Этот фермент прикреплен к сети волокон коллагена и мукополисахаридов, располагающихся около синаптической щели. Согласно оценкам, проведенным Кацем в Лондонском университетском колледже [186], фермент ацетилхолинэстераза разрушает около трети молекул ацетилхолина до того, как они достигнут молекул рецепторов в мембране мышечного волокна. Быстро разрушаются и остальные молекулы ацетилхолина после того, как они в течение миллисекунд были присоединены к рецепторным молекулам. Скорость, с которой молекулы ацетилхолина связываются с рецепторными молекулами и разрушаются ферментом, обеспечивает возможность повторения нескольких сотен возбуждений в секунду. Для исследования структуры рецепторов ацетилхолина в мембранах мышечных волокон необходимо выделить их из мембран. Решение этой 137 задачи было облегчено после открытия молекулярной метки, связанной почти необратимо с молекулами- рецепторами. Такой меткой оказались молекулы яда змей типа кобры. Жертвы этих змей погибают в результате паралича дыхательных мышц. Исследованиями Чен Юан-ли, Лестера и их сотрудников в Национальном Тайванском университете было показано, что молекулы яда блокируют рецепторы молекул ацетилхолина путем прочного присоединения к ним. Они не взаимодействуют с ферментом ацетилхолинэстеразой и не нарушают любой другой процесс нормальной активности мышц. Оказалось, что молекулы яда могут быть помечены радиоактивными атомами йода и водорода. Это позволило исследовать распределение рецепторов в неповрежденных мембранах. Используя способность молекул ядов присоединяться к рецепторам молекул ацетилхолина, удалось выделить эти рецепторы из мембран электрических органов гигантского электрического ската (и некоторых других электрических рыб). Эти электрические органы развиваются в эмбрионе из тех же клеток, из которых развиваются мышцы. Большие плоские клетки — электродиски — электрических органов таких рыб весьма чувствительны к ацетилхолину. Они содержат очень большое число рецепторных молекул и удобны для их извлечения из мембран с помощью молекул ядов. В 1971 и 1972 гг. такое выделение удалось провести в нескольких лабораториях. Было установлено, что рецепторные молекулы являются сильно асимметричными белковыми молекулами с гидрофобными областями и небольшим числом молекул сахаров. Карлин из Колумбийского университета и Шанже из Пастеровского института в Париже высказали предположение, что действие молекулы ацетилхолина на рецепторную молекулу в постсинаптической мембране напоминает действие активаторов на ферменты. Активирующая молекула, присоединяясь к ферменту в некотором месте, может вызвать конформационное его изменение, что скажется на эффективности фермента по отношению к субстрату. Согласно этой аналогии, открытие и закрытие ионных каналов в постсинаптической мембране связано с конформационным преобразованием акцепторной молекулы, вызываемым молекулами ацетилхолина. Кац и Теслефф обнаружили кооперативное действие молекул ацетилхолина. Присоединение молекулы ацетилхолина к рецептору не только открывает некоторые каналы, но и увеличивает чувствительность рецептора к другим молекулам ацетилхолина. Такое кооперативное поведение, как и в случае ферментов, можно объяснить наличием в рецепторе нескольких субъединиц. Исследуя с помощью электронных микроскопов очищенные рецепторы электрических дисков электрических рыб, Шанже и другие исследователи показали, что эти диски имеют структуру «розетки» с центральным отверстием, состоящей из пяти или шести субъединиц. 138 При присоединении молекул ацетилхолина к рецепторам каналы остаются открытыми в течение миллисекунды. Это время увеличивается в три раза, когда температура понижается на 10° С. Время, в течение которого каналы открыты, уменьшается при деполяризации мембраны. Закрытие каналов сопровождается отделением молекул ацетилхолина от рецепторов и последующим их разрушением ферментом ацетилхолинэстеразой. Молекулярный механизм открытия ионных каналов при присоединении молекул ацетилхолина к рецепторам остается невыясненным. 14. НЕРАВНОВЕСНАЯ ТЕРМОДИНАМИКА В БИОЛОГИИ. 14.1. Необратимые процессы. Изучая структуру биополимеров, мы до сих пор, как правило, ограничиваемся рассмотрением равновесных состояний. Пока речь идет о готовой структуре, это законно. Но возникновение структуры, т.е. биосинтез и самосборка, являются совокупностью неравновесных процессов, протекающих необратимо. Тем более это относится и функционирования биологической системы как целого, к процессам эволюционного и индивидуального развития. Система, находящаяся в равновесном состоянии, "мертва", для нее не существует времени и истории. В это равновесное состояние система переходит из неравновесного состояния. когда она была еще "живой" и обладала "силами", которые приводили различные изменения, осознавали "стрелу времени" и при этом подводили систему к ее финалу – равновесию – смерти. Этого можно избежать, если с помощью внешних сил искусственно поддерживать систему в состоянии, далеком от термодинамического равновесия. В неравновесной динамике термин "сила" или "обобщенные силы" приписываются всем воздействиям или изменениям, включая обычные механические силы. Так, например, в длительном неравновесном состоянии систему может поддерживать постоянный приток и отток вещества и энергии. Поэтому, в данном контексте свойства необратимости процесса и неравновесности состояния представляют собой две стороны одного и того же явления физического мира. В неравновесной замкнутой системе могут возникать силы, например, за счет протекания химических реакций, температурных и концентрационных градиентов, являющихся следствием различия соответствующих величин в разных участках данной системы. Силы образуют потоки, которые в конце концов исчерпывают источники сил, породивших эти потоки. Все градиенты постепенно исчезают и система достигает окончательно состояния равновесия. 139 Пример: поток тепла от более нагретой к менее нагретой частям тела (градиент температуры), приводящий к выравниванию температуры и к становлению теплового равновесия. 14.2. Энтропия неравновесной системы. Наличие сил и потоков в неравновесной системе (н.с.) в частности может означать, что эта система неоднородна или в ней происходят химические процессы. В наиболее общем случае состав и все соответствующие переменные системы изменяются в пространстве и во времени. Вопрос: каким образом в н.с. можно определить интенсивные величины, подобные температуре или давлению, если, например, понятие температуры должно четко увязываться с содержанием нулевого закона термодинамики? (равенство температур во всех точках равновесной системы) Эти трудности могут быть преодолены, если воспользоваться представлением о локальном равновесии. Для этого следует мысленно разделить всю н.с. на бесконечно малые элементы объема. (иллюстрация) Предположим, что все положения (соображения) равновесной термодинамики применимы к локально определяемым величинам небольшого элементарного объема. Отнесем локальные переменные к единице объема (т.е. плотности этих переменных). Тогда если  i - парциальная масса единицы объема (парциальная плотность) i-ого компонента, то     , а dV=U будут соответственно энтропией и энергией, отнесенной также к единице объема. Для каждого малого объема системы локальная энтропия Š связана с локальной энергией Ũ и парциальной массой  i соотношением, которое является частным случаем уравнения Гиббса: TdS  dU    i d i , i где  i - химические потенциалы, а весь второй член во второй части - это изменение внутренней энергии системы, связанное с совершением в ней "химической работы", пропорциональной изменению масс (число молей) всех компонентов системы.  dU    i   (в гомогенной системе)  d i   !S ,V Общая энтропия н.с. равна: S (t )   dV S (U , 1 ...  i ) V Из этого соотношения следует, что для оценки энтропии необходимо знать локальную функцию энтропии S  S (U , 1... i ) (т.е. уравнение состояния для каждого элемента объема). 14.3. Производство энтропии. Как уже было установлено, свойства необратимости процесса и неравновесности состояния выражаются термодинамически через 140 производство энтропии, которое является мерой изменения энтропийной функции во времени. Это означает, что необходимо каким-либо образом связать изменение локальной энтропии S(t) с физическими величинами, представляющими собой обобщенные силы (градиенты, сродство) и потоками, наличие которых фактически служит отличительным признаком необратимости процессов внутри системы. Продифференцировав S по dt, получим  dS dS    dt i  d i  d dS  dU  ; i   ; где  i - независимые переменные, сумма  dt dU dt    ...  U ,  i 1 i которых i  i в отличие от закрытых систем может быть постоянной. Из локального уравнения Гиббса легко определим, что    dS  1   i ;    T  dU  1 ...i T U ,  i Далее покажем, что d i dt и dU dt определяются на основании локальных  dS   d i уравнений сохранения массы и энергии для i-х компонентов н.с. 14.4. Уравнение баланса массы. Наиболее существенным признаком необратимого процесса является динамика – свойства н. системы постоянно изменяются во времени и пространстве. Однако основные законы сохранения должны выполняться. Это относится, в частности, к массе продуктов (веществ) в н.с. и поступающих (и уходящих) в нее из вне. Рассмотрим 6-гранный куб. Обозначим символом J i - направленный поток вещества через единицу поверхности в единицу времени. Чем больше скорость потока, тем больше вещества выходит из куба. Кроме того, очевидно, что поток J i будет пропорционален парциальной плотности вещества. В результате запишем: J i   iV Полный поток, направленный из куба (во вне) является векторной величиной и в декартовых координатах записывается так: J i   i v x   i v y   i v z  J xi  J yi  J zi Скорость изменения плотности вещества (компоненты i) связана с потоком следующим соотношением: dJ yi dJ zi   dJ d i   divJ i   xi   dt dx dy dz   Это уравнение позволяет определить и раскрывает смысл одного из слагаемых в выражении для локального производства энтропии в необратимых процессах. Если внутри объема V протекают химические реакции, то для каждого компонента этих реакций могут быть написаны соответствующие уравнения сохранения массы. При этом необходимо делать различия между двумя 141 вкладами в баланс массы, вносимым соответственно обменом веществом с окружающей средой и химическими реакциями внутри системы. Таким образом, общее изменение массы химических компонентов  i описывается уравнением баланса массы, имеющим два слагаемых, которые соответственно обозначают отрицательную дивергенцию потока i-ого компонента и изменение массы за счет протекания химических процессов (синтеза или деструкции) вещества. Если наблюдается r химических реакций, мы имеем (индекс М – масса): d i  divJ iM   ir v r , dt r где vr - скорость химической реакции типа r, а коэффициенты i-ого компонента в r-й степени.  ir - стехиометрические 14.5. Уравнение сохранения энергии. Аналогично можно вывести и уравнения сохранения энергии, т.е. описать изменение функции локальной внутренней энергии U во времени. В отсутствие процессов конвекции, механической работы или работы других внешних сил это изменение будет равно: ~   U  divJ э , где J э – направленный поток энергии через единичную t поверхность в ед. времени (индекс “э” – энергии). Если единственной формой энергии, переносимой через поверхность куба является теплота q, то написанное уравнение будет определять скорость теплопереноса. ~  U q   divJq t t 14.6. Уравнение баланса энтропии. Подставив соответствующие значения частных производных локальной энтропии и внутренней энергии в уравнение для скорости изменения локальной энтропии, после некоторых преобразований получим выражение для изменения локальной энтропии во времени: ~  S  divJ s   s] t Первое слагаемое – потоковый член, аналогичный рассмотренному ранее. Отметим, что не все “потоки” и “силы” являются направленными величинами. Обобщенные силы связывают с различными градиентами “параметров” и химическими реакциями, которые создают потоки, для того, чтобы отличить их от чисто механических, электрических и прочих сил. 142 Примеры обобщенных сил, имеющих место (“действующих”) в различных необратимых процессах, и порождаемых ими потоков (которые входят в уравнение ds ): dt Необратимый процесс диффузия Поток m J теплоперенос  Jq хим. реакция Vr Обобщ. сила  T grad(- ) grad 1 T Ar , где Ar  iVir T Локальное производство энтропии означает возникновение энтропии внутри малого элементарного объема за счет протекания необратимых процессов. Из таблицы видно, что  s определяется в понятиях реально измеряемых термодинамических величин. Напомним также, что при  термодинамическом равновесии значения всех величин J и X k становятся k S равными нулю. Конечная цель вычислить , т.е. изменение во времени t общей энтропии системы. На основании положений локальной термодинамики мы можем заключить, что общее изменение энтропии является суммой всех локальных изменений и поэтому: ~  S S   dV   dV (divJ s   s ( s)) t V t V  С теории о дивергенции объемный интеграл  divJ s dv может быть преобразован в поверхностный. Можно получить общий поток энтропии eS t через поверхность, окружающую объем V, приравнивая:   di S dS    s dv и e   ( J s dS )   divJs dv dt dt SV V V  dS d e S di S   dt dt dt Из этого уравнения видно, что общая энтропия данной системы может изменяться, только если существуют потоки энтропии через границы раздела или если она производится внутри системы. В равновесной системе потоки и Получим: силы отсутствуют, т.е. di S dS d e S 0 и  . Таким образом твердо установлено dt dt dt свойство равновесной системы, согласно которому единственным способом изменения энтропии является пересечение ею границ системы. 143 Если система изолирована, то dS d i S   0 . Знак неравенства возникает из-за dt dt того факта, что энтропия изолированной системы может только увеличиваться, т.е. di S  0 . Это утверждение эквивалентно:   J k X k  0 . V K В случае применимости локального описания необратимых процессов  s   J k X k  0 (*) получаем: k На основании этого (*) неравенства можно утверждать, что сумма всех значений величин J k X k не должна быть отрицательной, в то время как отдельные значения J k X k могут быть отрицательными. Данное соотношение (*) лежит в основе теории термодинамики необратимых процессов. Из него следует очень важный вывод: всякий раз, когда в системе протекают необратимые процессы, происходит возрастание локальной энтропии. Оно может быть вычислено путем умножения всех потоков на соответствующие обобщенные силы, откуда следует, что  s является билинейной функцией этих величин. Потоки и силы в таблице не единственные процессы, продуцирующие энтропию. Обычно эти две взаимозависимые величины проявляются как сложные и неизвестные функции одна другой. Поэтому для того, чтобы предсказать (поведение) неравновесность макроскопической системы, основное уравнение термодинамики необратимых процессов (*) используют лишь с некоторыми дополнительными допущениями, и здесь возможно два подхода: 1.Линейная связь между потоками и силами (теория термодинамики линейных необратимых процессов) 14.7. Термодинамика нелинейных необратимых процессов. Формализм равновесной термодинамики служит мощным средством для изучения физико-химических систем. Однако его использование ограничено тем, что не все системы находятся в термическом, механическом или химическом равновесии. Многие реальные процессы находятся в неравновесном состоянии, поскольку протекают под действием неравновесных сил, образующих в свою очередь потоки различного рода. Большинство явлений биологического характера как раз относятся к категории таких процессов. В термодинамическом отношении открытые (биологические) системы в процессе своего изменения проходят через ряд неравновесных состояний, что, в свою очередь, также сопровождается изменениями соответствующих термодинамических переменных. В целом поддержание неравновесных состояний в открытых системах возможно лишь за счет создания в них определенных потоков вещества и энергии. При этом параметры и свойства таких состояний, в общем случае, являются функциями времени. 14.8. Изменение энтропии в открытых системах 144 В системе, обменивающейся с внешней средой энергией и веществом, общее изменение энтропии dS может происходить либо за счет возникновения энтропии в самой системе вследствие внутренних необратимых процессов diS, либо за счет процессов обмена системы с внешней средой deS. Постулируется, что общее изменение энтропии в открытой системе складывается из двух независимых частей dS  d i S  d e S (1) В этом состоит исходное положение термодинамики необратимых процессов. Если внутри системы протекают обратимые изменения, то они не сопровождаются производством энтропии и diS = 0. Во всех случаях необратимых изменений diS > 0. Очевидно, что в изолированных системах, где deS = 0, соотношение (2.1) сводится к dS  d i S  0 , (2) что соответствует классической формулировке второго закона термодинамики для изолированных систем. Вклад в производство энтропии дают только необратимые процессы – теплопроводность, диффузия, химические реакции. В качестве полезного примера определим величину продукции энтропии в системе, если в ней происходят химические реакции. Изменение массы 1-го компонента при химическом преобразовании представим в виде dmi   i d i dmi   i M i d ; dni  (3) Mi где νi- - стехиометрический коэффициент; Мi – молекулярная масса; dni – число молей вещества; ξ – степень прохождения (координата) реакции, характеризующая изменение количества молей вещества, приведенное к стехиометрическому коэффициенту. Энтропия является полным дифференциалом и для определенного количества компонент ni, которые преобразуются в химических реакциях, изменение энтропии запишется как  S  dni d i S    (4)  n i  i  С учетом формулы для химического потенциала соотношение (4) может быть представлено в виде 1 d i S     i dni (5) T i Подставив второе соотношение из (3) в выражение (5), получим 1 d i S     i i d (6) T i Величина A    i i (7) i называется сродством химической реакции. Используя соотношения (1), (6), (7) и формулу deS = ΔQ/T, получим выражение для общего изменения 145 энтропии в открытой системе с учетом обмена энергией с внешней средой и продукции энтропии в результате химических реакций Q A dS   d (8) T T 14.9. Скорость продукции энтропии и диссипативная функция Одно из наибольших достижений термодинамики необратимых процессов, в отличие от равновесной термодинамики, состоит в том, что она вводит понятие времени и рассматривает изменение энтропии во времени. Скорость продукции энтропии для открытой системы запишется в общем виде как dS d e S d i S   dt dt dt (9) Общая скорость продукции энтропии равна сумме потока энтропии через открытую систему (deS/dt) и скорости продукции энтропии в системе (diS/dt) в результате необратимых процессов. Для случая химических реакций в системе d i S A d A    , (10) dt T dt T где υ - скорость реакции. Возникает вопрос, возможно ли использование понятия энтропии, введенное в равновесной термодинамике, для описания процессов в неравновесных ситуациях. В термодинамике необратимых процессов допускается, что хотя система в целом неравновесна, каждая из подсистем, выделенная в элементарном объеме, находится в состоянии равновесия (принцип локального равновесия). Вводится важное понятие - локальная скорость продукции энтропии а в элементарном объеме dV. Тогда скорость продукции энтропии во всей рассматриваемой термодинамической системе di S   dV . (11) V dt Так как diS ≥ 0, то и локальная скорость продукции энтропии будет  0 (12) Перенесем в уравнении (2.10) температуру Т в левую часть и получим dS T i  A (13) dt Правая часть этого выражения представляет произведение двух величин, одна из которых является причиной или силой (химическое сродство A), вызывающей химическую реакцию, а вторая следствие (скорость реакции υ) действия данной причины. Произведение Т(diS/dt) называется диссипативной функцией. В наиболее общей феноменологической форме любой процесс можно характеризовать произведением обобщенной силы X (причина) на 146 обобщенный поток J (скорость процесса). В зависимости от процесса обобщенная сила X может иметь разную природу: в химических реакциях химическое сродство А, в механических процессах - сила F, в электрических явлениях - разность потенциалов Δφ, в процессах диффузии градиент концентраций Δc/Δx, в процессах теплопроводности градиент температуры ΔT/Δx. Рассмотрим несколько конкретных примеров, подтверждающих правильность заключения, о том, что Т(diS/dt) является универсальной характеристикой и представляется всегда произведением двух величин силы на скорость процесса. При перемещении тела на расстояние Δx под действием силы F мощность процесса N  ( F ) , (14) где υ - скорость движения тела. При прохождении электрического тока I мощность равна N  I , (15) где Δφ - разность потенциалов. Таким образом, произведение двух величин XJ характеризует мощность процесса. Посмотрим, как передается мощность в открытой системе при осуществлении необратимых процессов. По аналогии с техническими устройствами в биологических системах происходит преобразование одного вида энергии в другой - химической в электрическую (нерв), в механическую (мышца) и в световую (биолюминесценция светляка); световой в химическую (хлоропласт) и в электрическую (сетчатка глаза); механической в электрическую (улитка внутреннего уха). Важной характеристикой любого преобразователя энергии, в том числе и биологического, является изменение мощности на входе (NBX) и выходе (NВЫХ) открытой системы. В общем виде изменение мощности можно записать dS T i  N BX  N ВЫХ  JX , (16) dt Для неравновесных систем основной характеристикой выступает локальная продукция энтропии σ, и поэтому диссипативная функция запишется как T   J k X k , (17) k если в открытой системе проходит k процессов. Выражение (16) показывает, что протекание необратимых процессов в открытой системе всегда сопровождается диссипацией (рассеянием) энергии. Во всех преобразователях входная мощность превышает выходную мощность, а это значит, что происходит преобразование энергии высокого качества (электрической, световой, химической) в тепловую энергию-энергию хаотического движения. Диссипативная функция Тσ = 0 только в случае идеальных обратимых процессов. 147 14.10. Основные положения линейной неравновесной термодинамики Возникает вопрос о том, как связаны между собой потоки J и обобщенные силы X. В общем виде можно считать, что поток J зависит от силы X: J =f(X). Разложим J(X) в ряд Маклорена вблизи равновесия X = 0 : J ( X )  J (0)  J ' (0) J " (0) 2 X X  ... 1! 2! (18) В точке равновесия J(0) = 0. Производные в точке равновесия обозначаются соответственно постоянными J'(0) = L, J"(0) = L’ и т.д., которые принято называть феноменологическими коэффициентами. С учетом этих обозначений и пренебрегая членами выше первого порядка, получим (19) J  LX Таким образом, если система находится вблизи состояния равновесия, имеет место линейная связь между потоком и силой. Экспериментальным подтверждением основных положений линейной неравновесной термодинамики является ряд эмпирических законов, которые устанавливают линейные соотношения вида (2.19). Так поток вещества за счет диффузии описывается с помощью закона Фика dm dc   DS , (20) dt dt а в обобщенной форме J c  Lc X c , где m масса вещества; D - коэффициент диффузии; S - площадь переноса вещества; (dc/dt - градиент концентрации. Линейная связь между потоком диффузии (Jc) и обобщенной силой Хс осуществляется через феноменологический коэффициент Lc=-DS Перенос тепла описывается законом Фурье dQ dT  kS , ( J Q  LQ X Q ), dt dx (21) где k - коэффициент теплопроводности; (dT/dx) - градиент температуры. Объемный поток жидкости через трубку выражается формулой Пуазейля dV r 4  p, ( J V  LV X V ) (22) dt 8l где V - объем жидкости; r - радиус трубки; l - длина трубки; η - коэффициент вязкости; Δр - перепад гидростатического давления. Закон Ома устанавливает линейную связь между плотностью электрического тока jе и напряженностью электрического поля Е d je   e E   e , ( J e  Le X e ), (23) dx где σе - удельная проводимость вещества. 14.11. Соотношение взаимности Онзагера В сложной биологической системе протекают одновременно много процессов, которые между собой могут быть взаимосвязаны. Рассмотрим два 148 взаимосвязанных потока Jk и Jn. Если поток Jk с не сопряжен с потоком Jn, то он зависит только от обобщенной силы Хk :Jk = LkkXk. В случае сопряжения Jk с потоком Jn, он зависит также и от силы Хn, и эту связь устанавливает линейный сопряженный коэффициент Lkn. Тогда для двух сопряженных потоков запишем J k  Lkk X k  Lkn X n ; (24) J n  Lnk X k  Lnn X n Если поток Jk взаимосвязан с n потоками, тогда в общем виде J k   Lkn X n . (25) n В линейной неравновесной термодинамике особое значение приобретает соотношение взаимности Онзагера Lkn  Lnk , (26) показывающее, что если поток Jk сответствующий необратимому процессу k, испытывает действие силы другого необратимого процесса n, через посредство сопряженного коэффициента Lkn, то и поток Jn также испытывает влияние силы Хk через тот же коэффициент Lkn. Подставив уравнение (25) в диссипативную функцию (17), получим основное феноменологическое уравнение линейной неравновесной термодинамики T   Lkn X k X n . (27) k ,n 14.12. Принцип симметрии Кюри – Пригожина Различные процессы переноса, протекающие в неравновесных системах вблизи термодинамического равновесия характеризуются различной пространственной симметрией. Математически это выражается в том, что потоки, обобщенные силы и феноменологические коэффициенты могут быть как скалярными, так и векторными, тензорными и т.д. величинами в зависимости от свойств системы. Так, химическая сила Xr = A/T в уравнении (2.10), которая служат критерием возможности протекания химического процесса в данной точке системы также как и вызываемый ею поток Jr = , являются ненаправленными скалярными величинами. Неравновесная система, находящаяся вблизи термодинамического равновесия и описываемая уравнением (25), в котором сила и поток являются скалярными величинами, всегда изотропна, т.е. свойства системы одинаковы во всех направлениях (если только изотропно само равновесное состояние). Изотропные системы имеют высшую степень пространственной симметрии. Так как феноменологические коэффициенты рассчитываются в равновесном состоянии системы, то можно заключить, что они являются скалярами. С другой стороны, неравновесные системы, описываемые уравнениями (20) (23), не являются изотропными и характеризуются наличием в них направленных 149 потоков. Во многих случаях, особенно если речь идет о живых системах, одновременно протекает несколько химических реакций и других неравновесных процессов. При этом число феноменологических коэффициентов, описывающих систему и определяющих как прямые так и сопряженные процессы может быть очень большим. Однако во многих случаях это число может быть значительно понижено благодаря принципу симметрии Кюри-Пригожина, который формулируется следующим образом: внешние воздействия, вызывающие различные явления, не могут обладать более высокой симметрией, чем порождаемый ими эффект. Из данного утверждения, в частности, следует, что в неравновесной системе в случае изотропной среды химическая реакция, определяемая скалярной силой Хr не может вызывать какие-либо направленные процессы (например перенос тепла или диффузию), так как химическая сила более симметрична, чем направленные потоки JQ или Jc. Исходя из этого, можно заключить, что LQr  0, ( Lcr  0). Но согласно соотношениям взаимности Онзагера (26) LQr  LrQ  0, ( Lcr  Lrc  0). Поэтому сопряжение между векторными величинами (тепловыми потоками, потоками вещества) и скалярными величинами (химическими реакциями) исчезает и выражение (27) для диссипативной функции (а следовательно, и производство энтропии ) можно разложить на две независимые части: одна часть описывает производство энторопии направленным процессом (теплопереносом, диффузией), а другая – обусловленное только химическими реакциями. На этом простом примере мы показали, что в линейной области неравновесной термодинамики (и только в ней) не все необратимые процессы сопрягаются. Это обстоятельство существенно упрощает анализ таких процессов. Как правило, влияют друг на друга только процессы, характеризуемые одинаковой симметрией: скалярные процессы сопрягаются только со скалярными, а векторные с векторными. В нелинейной области свойство изотропии исчезает независимо от структуры среды в равновесном состоянии. В этом случае принцип Кюри Пригожина неприменим. 14.13. Термодинамика линейных необратимых процессов в биологических мембранах Распространение методов термодинамики линейных необратимых процессов на неоднородные системы позволяет широко использовать их для исследования биологических систем. Известно, что живые клетки представляют собой мозаику взаимосвязанных компартментов, разделенных мембранами различного сорта. Описанные выше методы могут быть непосредственно применены для анализа мембранных процессов, что дает возможность оценить такие свойства мембран, как мембранная проницаемость, мембранная фильтрационная способность или мембранная 150 проводимость. При описании перечисленных свойств мембран нет необходимости учитывать процессы, протекающие в самих мембранах; данные свойства рассматриваются только как свойства этих систем в целом. Биологические мембраны сильно отличаются от искусственных небиологических полупроницаемых мембран. Процессы транспорта веществ через биологические мембраны не могут быть объяснены только на основе процессов диффузии, поскольку наблюдаемые на мембранах диффузионные потоки гораздо более интенсивны, чем это предсказывается законом Фика. Иногда на биологических мембранах протекают процессы, называемые облегченным транспортом. В ряде случаев на биологических мембранах наблюдается, казалось бы, полное нарушение основного закона диффузии, а именно вещество начинает диффундировать из области более низкой концентрации вещества в область более высокой. В этом процессе вещество переносится против собственного градиента концентрации, и такой процесс называется активным транспортом. Примером активного транспорта могут служить процессы обмена живой клетки ионами калия и натрия с окружающей ее средой. Если перенос через мембрану носит активный характер, то он совершается за счет энергии метаболических процессов, что становится возможным только благодаря сопряжению химических реакций внутри клетки с процессами мембранного транспорта. Факт такого сопряжения твердо установлен на молекулярном уровне. Методы термодинамики линейных необратимых процессов весьма плодотворны при исследовании как активного, так и облегченного транспорта, а также многих других свойств биологических мембран. Несколько подобных примеров приводятся в книге Качальского и Курана, 1965. Рассмотрим активный транспорт ионов для иллюстрации природы сопряжения химических реакций и процессов переноса. Для этого определим производство энтропии в системе (Рис.), состоящей из трех частей А, В и М (сама мембрана). Потоки ионов калия и натрия через мембрану существуют благодаря разности их электрохимических потенциалов, которые складываются из химического потециала и электрического потенциала фазы. Рис. Обобщенная сила Хобм, описывающая общий ионный обмен через мембрану, можно представить через разности химических потенциалов Δμ K+ и 151 ΔμNa+. X обм   Na   K  . (28) Наличие суммарного потока Jобм означает, что ионы калия K+ обмениваются на ионы натрия Nа+. Все процессы, происходящие внутри мембраны, могут быть сведены к химическому потоку Jr и сопряженным силам Хr. Следовательно, диссипативная функция, определяющая производство локальной энтропии внутри мембраны, будет выражаться как (29) T  J r X r  J обм X обм и соответственно уравнения для сопряженных процессов в линейном приближении (30) J обм  L11 X обм  L12 X r ; J r  L21 X обм  L22 X r . Уравнения (2.30) не нарушают принципа симметрии Кюри Пригожина, который запрещает прямое сопряжение между процессами переноса и химическими реакциями в изотропных средах, потому что мембраны неоднородны и анизотропны. Этой особенностью мембран определяется, в частности, их высокая избирательность по отношению к тем веществам, которые проходят через мембраны. Поэтому внутри таких анизотропных структур, какими являются биологические мембраны, ничто не препятствует сопряжению химических реакций и транспорта необходимых для метаболизма веществ. Такое сопряжение, как мы отмечали, лежит в основе активного транспорта. Однако сопряженные феноменологические коэффициенты должны быть при этом векторными величинами, поскольку они должны отражать предпочтительную направленность потоков различных веществ, которыми клетка обменивается с окружающей средой. По определению в активном транспорте поток Jобм направлен против действия сил Хобм : JобмХобм < 0 - процесс идет против градиента движущей силы за счет энергии второго сопрягающего процесса (JrXr > 0). Это возможно только тогда, когда L12 = L21, и эти коэффициенты не равны нулю. Количественной мерой сопряжения этих процессов является величина k = L12/(L11L22)1/2 которая меняется в пределах –1 ≤ k ≤ +1. При k = 0, L12 = L21 = 0 оба процесса полностью не зависят друг от друга, а их потоки пропорциональны значениям "собственных" сил: Jобм=L11Xобм и Jr=L22Xr. Значения k = ±1 достигаются только для полностью сопряженных систем. При k < 0 увеличение движущей силы одного процесса приводит к уменьшению потока сопряженного с ним процесса. Эффективность сопряжения зависит от соотношения "мощностей": |JобмXобм/JrXr| и может достигать значений 80 - 90% (например, для окислительного фосфориллирования). Из уравнения (28) следует, что активный транспорт вносит отрицательный вклад в производство энтропии, таким образом уменьшая ее значение. Заметим, что без сопряжения потоков и сил различного рода процессы, приводящие к понижению энтропии, были бы невозможны. Рассмотрим другой пример применимости соотношения взаимности Онзагера для анализа сопряженных необратимых процессов, которые имеют место в 152 биологических системах. Водный раствор сахарозы находится в двух отсеках А и В, разделенных мембраной (рис.). Мембрана частично проницаема для молекул сахарозы и полностью проницаема для молекул растворителя (воды). В результате на мембране устанавливаются два потока - растворенного вещества Jс и воды Jв. Используя соотношение (17), запишем диссипативную функцию для этих двух потоков как (31) T  J c X c  J в X в . В изотермических условиях движущая сила для обоих потоков будет состоять из двух составляющих (32) X  V p   , где Δр - разность гидростатических давлений в двух отсеках; Δμ - разность  химических потенциалов вещества по обе стороны мембраны; V парциальный молярный объем вещества. Тогда T  J c V c p   c   J в V в p   в  (33) или T  J c V c p  J в V в p  J c  c  J в  в  -  ( J c V c  J в V в )p  J c  c  J B  в . (34) Разность химических потенциалов Δμс должна быть связана с осмотическим давлением Δπ, которое компенсирует разницу в концентрациях растворов по обе стороны мембраны. Согласно закону Вант-Гоффа   RT ccA  ccB   RTcc (35) Дифференциал от химического потенциала μ d  d 0  RTd (ln c)  RT dc , c (36) где dμ0 = 0. Для нашего случая представим dμс через небольшое приращение химического потенциала  c  RT cc cc (37) , где с с - средняя концентрация сахарозы в системе cc    1 A cc  ccB . 2 Подставим в уравнение (2.37) из формулы (2.35) Δπ и получим  c   cc (38) Связь двух сопряженных потоков, растворенного вещества и растворителя подчиняются уравнению Гиббса-Дюгема c c  c  c в  в (39) Из этого уравнения находим, что  cв  в   c cc (40) Подставив соотношение (40) в равенство (38) и заменив V в = 1/ c в, получим  в  V в  (41) 153 Теперь подставим Δμс из (38) и Δμв из (41) в уравнение (34):   J в Vв   cc J   J c V c  J с V в p   c  J в V в   cc  T  ( J c V c  J в V в )p  J c   (42) Таким образом, диссипативная функция Тσ представлена обобщенными силами (Δp и Δπ) и новыми потоками новыми J p  JcV c  JвV в ; Jd  Jc cc  JвV в (43) где Jр - объемный поток; Jd - диффузионный поток. С учетом новых обозначений T  J p p  J d  (44) Для сопряженных потоков Jр и Jd в соответствии с феноменологическими уравнениями (2.24) имеем J p  L pp p  L pd  J d  Ldp   Ldd  (45) Определим смысл феноменологических коэффициентов в предложенном опыте. 1. Наложим следующее ограничение по обе стороны мембраны: сA = сB . Это означает, что Δπ = 0. Подставив в систему уравнений (45) Δπ = 0, получим Jр = LppΔp и Jd=LdpΔπ. Таким образом, разница в гидростатическом давлении Δр вызывает объемный поток Jр и добавочный диффузионный поток Jd, который приводит к перераспределению сахарозы. Появляется снова разница в концентрациях сахарозы. Это явление известно как улътрафилътрация (Ldр коэффициент улътрафилътра-ции). 2. В случае равенства гидростатическиих давлений Δр = 0, Jр = LppΔπ и Jd=LdpΔπ. Ldd соответствует коэффициенту проницаемости вещества через мембрану. Добавочный объемный поток Jр называют осмотическим потоком, где Ldp - коэффициент осмотического потока. Используя соотношение взаимности Онзагера (2.26), получим следующую связь между потоками:  Jp  J   Ldp   d   L pd    p        p ( 46) Теперь мы можем из феноменологических коэффициентов определить свойства мембраны. Рассмотрим возможное стационарное состояние, когда объемный поток Jр = 0. Тогда из системы уравнений (45) находим L pp p  L pd  Коэффициент отражения мембраны k=-Lpd/Lpp зависит от ее свойств. Запишем объемный поток с учетом этого коэффициента J p  L pp (p  k ) (47) Теперь можно определить идеальную полупроницаемую мембрану, для которой k = 1 и растворенное вещество не проникает через нее (полностью 154 "отражается" на мембране): Jр = Lрр(Δр — Δπ). Полностью проницаемая мембрана характеризуется k = 0 и Jp=LppΔp. Коэффициент отражения k в уравнении (47) показывает механизм переноса вещества через мембрану: k = 0, когда Lpd = 0. Это означает, что сопряжение между потоками Jр и Jd отсутствует - поток растворителя существует независимо от потока растворенного вещества. В реальных ситуациях k ≤ 1 и Lрd≠ 0, что указывает на связь между потоками Jр и Jd. Это существенное обстоятельство, которое часто игнорируется, когда рассматривают процессы переноса воды и веществ в клетку независимо друг от друга. Только применение положений линейной неравновесной термодинамики и использование соотношения взаимности Онзагера к явлениям переноса через клеточные мембраны позволяют правильно количественно описывать транспорт веществ в клетку. Измеренные коэффициенты отражения k представлены в таблице. Приведенные в ней данные показывают, что различные клеточные мембраны значительно отличаются по проницаемости веществ. Таблица Коэффициенты отражения k для различных мембран (по Качальскому, Курану, 1965) Мембрана Эритроциты человека МНеПа 1гап81исеп8 Кожа жабы Вещество Мочевина Этиленгликоль Этанол Метанол Мочевина Ацетамид Тиомочевина k 0,62 0,63 0,44 0,50 1,00 0,89 0,98 14.14.Теорема Пригожина Наиболее важным результатом линейной неравновесной термодинамики явилось определение критерия установления стационарного состояния. Как было показано в ранее, основным критерием равновесной термодинамики является стремление энтропии к максимальному значению -Smax Рассмотрим теперь открытую систему, в которой проходят два необратимых сопряженных потока - теплоты J1 и вещества J2. Согласно соотношению (7), с точностью до постоянного множителя Т, локальная продукция энтропии а запишется   J1 X 1  J 2 X 2  0 (48) а сопряженные потоки 155 J 1  L11 X 1  L12 X 2 (49) J 2  L21 X 1  L22 X 2 II. Тогда   ( L11 X 1  L12 X 2 ) X 1  ( L21 X 1  L22 X 2 ) X 2  L11 X 12  L12 X 2 X 1  L21 X 1 X 2  L22 X 22 Учитывая соотношение взаимности Онзагера L12=L21 получим   L11 X 12  2L12 X 1 X 2  L22 X 22  0 (50) где L11 > 0, L22 > 0 и L12 > 0. Допустим, что в открытой системе устанавливается стационарное состояние и количество вещества, поступающее в систему, равно количеству вещества, выходящего из системы, в результате чего поток вещества J2 = 0. Исследуем на экстремум величину σ в стационарном состоянии. Находим производную от σ по Х2 при Х1 = const:   2 L12 X 1  2 L22 X 2  2( L12 X 1  L22 X 2 )  2 J 2  0 X 2 Это соответствует экстремальной точке. Вторая производная от σ  2  2 L22  0 X 22 (51) Таким образом, экстремальная точка соответствует минимуму функции σ. Рис. Теорема Пригожина: в стационарном состоянии при фиксированных внешних параметрах локальная продукция энтропии в открытой системе стремится к минимальному значению (52)   min или для конечного объема V продукция энтропии в системе стремится к минимальному значению (Рис.): di S  min dt (53) Теорема Пригожина о минимуме продукции энтропии в стационарном состоянии представляет собой количественный критерий эволюции открытой системы. 14.15. Устойчивость стационарного состояния 156 Системы в термодинамическом равновесии или стационарном состоянии являются устойчивыми. В равновесной термодинамике хорошо известен принцип устойчивости Ле-Шателъе: всякая система, находящаяся в состоянии химического равновесия и отклонившаяся от этого состояния под воздействием внешнего возмущения, стремится самопроизвольно вернуться в равновесное состояние за счет изменения параметров в направлении, противоположном тому, которое вызвало возмущение. Для анализа устойчивости вблизи равновесия подействуем на систему небольшим возмущением, т.е. незначительно выведем систему из равновесия. Математическая запись соответствует тому, что мы производим разложение энтропии в ряд вблизи равновесия: 1 S  S max  S  ( 2 S )  ... 2 (54) Поскольку разложение S происходит вблизи экстремальной точки Smax то член первого порядка малости δS обращается в нуль и, таким образом, устойчивость термодинамического равновесия определяется знаком члена второго порядка малости (δ2S). Переход закрытой системы в равновесное состояние определяется стремлением энтропии к максимальному значению (55) d i S  0 и Si  max Устойчивость термодинамического равновесия определяется соотношениями  2S  0 и dS 1 d 2 ( S )  i   J n X n  0 2 dt dt n (56) Основным критерием перехода открытой системы в стационарное состояние есть стремление локальной продукции энтропии σ к минимальному значению d i  0 и   min dt (57) Устойчивость стационарного состояния определяется следующим образом: 1 d 2 ( S )   J nX n  0 2 dt n (58) Величина ΣnδJnδXn называется избытком производства энтропии. Величины δJn и δXn представляют собой отклонения от значений J n и Xn в стационарном состоянии в результате действия внешнего возмущения. Принцип минимума продукции энтропии определяет авторегуляцию открытой системы: если открытая система в результате внешнего возмущения выведена из стационарного состояния, то в ней возникают силы, которые будут так и до тех пор изменять протекающие в ней процессы, пока локальная продукция энтропии а не достигнет минимального значения, т.е. пока система не перейдет в состояние наименьшей диссипации энергии. 14.16. Нелинейная термодинамика необратимых процессов Большинство процессов в биологических системах проходит при условиях, далеких от равновесия, когда отсутствуют линейные связи между скоростями и силами. Для описания таких процессов используется нелинейная 157 термодинамика. Напомним, что в равновесной термодинамике критерием направленности эволюции является увеличение энтропии (dS > 0) изолированной системы и стремление S → mах в термодинамическом равновесии. В линейной неравновесной термодинамике критерием направленности развития системы служит уменьшение продукции энтропии в ней (dσ < 0) и стремление σ → min в стационарном состоянии. Можно ли получить такой критерий для эволюции системы вдали от равновесия? П. Глендсдорф и И. Пригожин расширили принцип минимума продукции энтропии в нелинейную область, положив, что стационарное состояние при постоянных потоках характеризуется минимумом продукции энтропии. Разложим локальную продукцию энтропии на две составляющие dX k dJ k d d    Jk X k    Jk X  dt dt  k dt k dt k  k d  d j (59)  x  dt dt dJ При постоянстве потоков k  0 dt d d x   (60) dt dt Установлено, что d x 0 dt (61) Это неравенство отражает наиболее универсальный эволюционный критерий открытой системы вдали от равновесия. Знак равенства соответствует стационарному состоянию. Условие устойчивости стационарных состояний вдали от равновесия запишется как  x    J k X k  0 (2.62) k Это соответствует положительным флуктуациям. В стационарном состоянии положительные флуктуации (δxσ > 0) локальной продукции энтропии быстро исчезают вследствие принципа минимума продукции энтропии и система возвращается к исходному стационарному состоянию (Рис.). Но возможны и отрицательные флуктуации (63)  x  0 которые свидетельствуют о неустойчивости стационарного состояния. Такие флуктуации будут нарушать это состояние и в конечном счете приводить к новому стационарному состоянию с уменьшенной энтропией (Рис.) (Si  0) 158 Рис. Рис. Рассмотрим ряд особенностей, которые проявляются при использовании нелинейной термодинамики. Пусть имеется некоторый параметр λ (разность концентраций или другие величины), который описывает отклонение системы от состояния равновесия (рис.6). Равновесное состояние определяется условием λ = 0. При небольших отклонениях от равновесия параметра λ в общем случае имеет место набор устойчивых стационарных состояний, которые образуют так называемую термодинамическую ветвь. Вблизи от состояния равновесия термодинамическая ветвь устойчива, так как она удовлетворяет условию δxσ > 0. Но при значительном удалении параметра λ от равновесия термодинамическая ветвь становится неустойчивой. Переход на новую, нетермодинамическую ветвь происходит при определенном критическом значении параметра λ = λ с, когда флуктуации локальной продукции энтропии изменяют знак: δxσ < 0. Такую критическую точку называют бифуркацией. В бифуркационной точке система теряет устойчивость и переходит в новое состояние. На Рис. показаны бифуркационные диаграммы простая (надкритическая) и сложная (субкритическая). Рис. Бифуркационная диаграмма: а - надкритическая: б - субкритическая. (Сплошными и штриховыми линиями показаны устойчивые и неустойчивые решения соответственно). Для сложных бифуркаций возможно проявление множественности стационарных состояний для одного и того же параметра, когда λ = λ с. 159 Экспериментально это подтверждено для автокаталитических реакций при синтезе полинуклеотидов в проточном реакторе. 14.17. Нелинейная термодинамика и диссипативные структуры Особый интерес вызывают бифуркации, когда вдали от равновесия в результате нарушения устойчивости системы (δxσ < 0) могут возникать новые устойчивые пространственные, временные и пространственно-временные структуры. Неравновесность, значительные флуктуации приводят к возникновению динамических упорядоченностей, называемых диссипативными структурами. Поддержание диссипативных структур достигается за счет непрерывного обмена с окружающей средой энергией и веществом. Возможны различные типы диссипативных структур. Один класс таких структур связан с бифуркациями, которые ведут к спонтанному нарушению пространственной однородности раствора (нарушение пространственной симметрии). Примером такого явления является реакция БелоусоваЖаботинского. Если в пробирку слить в определенных пропорциях Се2(SО4)3, окислитель КBrО3, восстановитель СН2(СООН)2 (малоновая кислота) и добавить несколько капель ферроина, индикатора окислительновосстановительной реакции, то в гомогенном растворе образуются четко разделенные зоны с синей и красной окраской. Происходит спонтанное нарушение пространственной симметрии, ведущее к образованию упорядоченных пространственных структур. При непрерывном подводе реагентов и отводе продуктов в проточном реакторе продолжительное время происходят циклические изменения цвета (от синего к красному и наоборот) с частотой 0,01 Гц. Циклическое изменение окраски раствора связано с попеременным изменением степени окисления церия Ce 3  Ce 4 Другой класс бифуркаций приводит к нарушению временной симметрии (бифуркации Хопфа). В этом случае образуются новые упорядоченные во времени диссипативные структуры. В особенности такие бифуркации характерны для многих биохимических реакций. При определенном критическом значении λ = λс система становится неустойчивой и возникает новое состояние, в котором наблюдаются периодические во времени осцилляции концентраций. К числу наиболее значительных колебаний относятся колебания активностей ферментов в метаболических процессах, в гликолитическом цикле. Период таких колебаний составляет минуты и часы. Молекулярные осцилляции представляют собой элементы биологических часов, которые работают в отсутствие внешних датчиков ритма. Многие реакции идут как автокаталитические с наличием обратных связей. В этом случае наблюдаются периодические изменения концентраций в реакционной системе. Колебательные модели широко используются в биологии. 160 Поведение автокаталитической реакции с обратной связью и динамика численности популяций описываются системой нелинейных дифференциальных уравнений. Рассмотрим это на примере наиболее хорошо изученной модели Лотки Волътерра, описывающей взаимодействие хищникжертва. Если X - число травоядных, а Y число хищников, то кинетические уравнения для этой модели записываются следующим образом: dX  k1 X  k 2 XY dt dY  k 2 XY  k 3Y dt (64) где k1 - константа естественного размножения жертв; k2 константа взаимодействия хищник-жертва; k3 - константа естественной смертности хищников. Это нелинейные дифференциальные уравнения. В стационарном режиме левые части этих уравнений приравниваются к нулю и находятся координаты стационарной точки X0  k3 k2 и Y0  k1 k2 (65) Для линеаризации системы (64) представим решение в следующем виде: X  X 0  xet Y  Y0  yet и (66) где х и у - достаточно малые отклонения от стационарной точки X0 и Y0: х< 0) с одинаковой частотой ω вокруг стационарной точки Х0 и Y0. Изменения X и Y удобно представлять на фазовой плоскости (рис.). Система вращается с частотой ω на фазовой плоскости вокруг особой точки, называемой центром, которая характеризует стационарное состояние системы 161 с Х0 и Y0. Колебания численности обусловлены взаимодействием между хищниками и жертвами. Если хищники поедают много жертв, то численность жертв уменьшается, что в конечном счете приводит к сокращению популяции хищников. В свою очередь, уменьшение численности хищников способствует росту жертв и т.д. (рис.). Возникают циклические колебания X и Y, смещенные по фазе друг относительно друга. Близкие к модели Лотка - Вольтерра фазовые траектории наблюдаются для многих автокаталитических реакций. Рис. Для некоторых сопряженных нелинейных дифференциальных уравнений dx/dt=f(x,y) и dy/dt=f(x,y) имеют место совершенно особые решения для колебательных явлений. В противоположность уравнениям Лотки - Вольтерра конечный результат не связан с заданными начальными условиями и независимо от своего начального состояния система приходит к одному и тому же колебательному движению, называемому предельным циклом (рис.). Существование подобных периодических колебаний имеет решающее значение для регуляторных процессов в живых организмах, которые могут зависеть только от некоторых параметров системы и совершенно не зависят от начальных условий. Возможны более сложные типы диссипативных структур, когда в результате временных изменений концентраций и нарушения пространственной гомогенности возникают бегущие волны, распространяющиеся в объеме. Такие волны могут образовывать различной формы вращающиеся спирали (рис.). Автоволновые процессы проявляются во многих активных биологических системах. Первая простейшая модель возбудимой среды была предложена Н. Винером и Ф. Розенблютом (1946). Передача волн возбуждения наблюдается в живой ткани, состоящей из возбудимых клеток. Возникновение волн возбуждения и их распространение определяются характерными свойствами элементов активной среды. Каждый из них может находиться в трех состояниях: возбуждения, рефрактерности и покоя. Каждый элемент имеет запас энергии (в виде мембранного потенциала или энергии окисления), которая используется для распространения возбуждения. Переход между этими состояниями происходит с определенной 162 периодичностью, что и определяет автоволновой процесс в активной среде. Рис. Рис. Рис. В литературе широко обсуждаются вопросы о возможной роли диссипативных структур в эволюционных процессах биологических структур. Согласно И. Пригожину, происхождение жизни может быть связано с серией последовательных бифуркаций, которые привели к созданию систем с повышенной упорядоченностью. М. Эйген выдвинул гипотезу о специальных диссипативных структурах, так называемых гиперциклах, образование которых явилось необходимым этапом в ходе эволюционного развития биологических объектов (рис.). Гиперцикл - это объединение самовоспроизводящихся единиц ограниченной длины в новую устойчивую систему, способную к согласованной эволюции. 163 Дополнительная литература [1] А.Баблоянц. Молекулы, динамика и жизнь. М: Мир, 1990. [2] Костюк П.Г и др. Биофизика. Под общ. ред. Костюк П.Г. Киев: Вища шк. Головное изд-во, 1988.- 490 с. [3] Колебания и бегущие волны в химических системах. Сб. под ред. Р.Филд и Бургер. М: Мир, 1988. [4] Лупичев Л.Н., Каданцев В.Н. Введение в общую синергетику (Учебное пособие). М.: МГИРЭА(ТУ), 2007 [5] Каданцев В. Н. Устойчивость и эволюция динамических систем (Основы синергетики). В двух книгах.М.: Изд-во МГТУ МИРЭА, 2012 164