Основы биотехнологии лекарственных препаратов

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЕРМСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАФЕДРА ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВ С КУРСОМ БИОТЕХНОЛОГИИ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Учебное пособие для студентов, обучающихся по специальности 060108 «Фармация» Пермь, 2014 г. 2 В подготовке учебного пособия принимали участие: профессора кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии Е.И. Молохова (лекции 1-5, 7,8,10), А.В. Казьянин (лекции 1,2,6), А.М. Николаева (лекции 11,12), , В.И.Решетников (лекции 9), доценты О.Ю. Соснина (лекция 2), Е.А. Хволис (лекции 13,14), ст. преподаватель Ю.В. Сорокина (лекция 5). Ответственный за выпуск: зав. кафедрой промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии, профессор Орлова Е.В. Издание 5, исправленное и дополненное. Рецензенты: - зав. кафедрой фармацевтической технологии Пермской государственной фармацевтической академии, доцент Н.А. Пулина - зав. кафедрой фармацевтической технологии Тюменской государственной медицинской академии, профессор Б.Н. Бекетов - зав. кафедрой фармацевтической технологии Сибирского государственного медицинского университета, профессор В.С. Чучалин Учебное пособие содержит краткий курс лекций по основным темам курса биотехнологии и составлено в соответствии с действующей программой по биотехнологии (Москва, 2003) и сборником «Типовые ситуационные задачи для итоговой государственной аттестации выпускников высших медицинских учебных учреждений по специальности 060108 (040600) «Фармация» / под ред. акад. РАМН проф., А.П. Арзамазцева, М:, ФГОУ «ВЦПМЦ Росздрава», 2007 288с. Утверждено и рекомендовано к изданию Ученым советом академии Пермской государственной фармацевтической академии (протокол № 11 от 26 мая 2005 г.) Рекомендовано к использованию Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по специальности 060108 (040500) - Фармация 3 Оглавление Лекция 1. Предмет, цель и задачи биотехнологии. Уровни развития биотехнологии. Лекция 2 Лекция 3. 4 Слагаемые биотехнологического процесса Объекты биотехнологии. Совершенствование биобъектов методами естественной селекции и мутагенеза Лекция 4. Создание новых биообъектов методами генетической инженерии. Лекция 5. Геномика и протеомика Лекция 6. Препараты крови человека. Биотехнологические аспекты получения Лекция 7. Интерфероны. Традиционные и генно-инженерные методы получения интерферонов. Лекция 8. Биотехнология растений в производстве фитопрепаратов Лекция 9. Биотехнология бактериофагов Лекции10 Производство фармацевтических препаратов на основе микробиологического синтеза Лекция 11 Антибиотики. Условия и пути их биосинтеза, основные этапы промышленного производства Лекция 12 Технология современных вакцин 102 Лекция 13 Биотехнология витаминов 194 Лекция 14 Экологические проблемы биотехнологии Тестовые задания 204 217 30 46 61 75 86 118 133 145 158 177 4 Лекция 1. Предмет и задачи биотехнологии. Уровни развития биотехнологии. План лекции Определение биотехнологии как науки Основные задачи биотехнологии История и уровни развития биотехнологии Применение биотехнологии в различных отраслях науки и промышленности 5. Перспективы биотехнологии 1. 2. 3. 4. Литература 1. Б. Глик, Дж. Пастернак //Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: Мир, 2002. 2. Егорова Т.А.-Основы биотехнологии. Учеб. для высш. пед. учеб. заведений - М.: "Академия", 2005 – 208 с. 3. Краснопольский Ю.М., Борщевская М.И. Биотехнология иммунобиологических препаратов. - Харьков: «Фармитэк», 2008. – 312 с. 4. Прищеп Т.П., Чучалин В.С., Зайков К.Л., Михалева Л.К.,Белова Л.С. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие. –Ростов н/Д.: Томск: Изд-во НТЛ,2006 - 256 с. 5. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И – Биотехнология: учеб. пособие для студ. ВУЗ – М.: Изд. центр «Академия», 2006.-256 с. Вопросы к лекции 1. Назовите основные задачи биотехнологии. 2. Охарактеризуйте периоды развития биотехнологии. 3. Укажите связь биотехнологии с другими дисциплинами. 4. Назовите объекты современной биотехнологии. 5 По определению ученых всего мира ХХI век будет веком биотехнологий. В сфере производства лекарственных средств биотехнология вытесняет традиционные технологии, открывает принципиально новые возможности. Биотехнология – это целенаправленное использование биологических объектов, систем или процессов для производства различных типов ценных продуктов. Биотехнология на сегодня является одной из самых наукоемких, перспективных и в экономическом плане высокорентабельных отраслей производства. Мировой рынок биотехнологической продукции составляет около 150 млрд. долларов в год и постоянно растет. Биотехнология - междисциплинарная область научно-технического прогресса, возникшая на стыке биологических, химических и технических знаний и призванная к созданию новых биотехнологических процессов, которые в большинстве случаев будут осуществляться при низких температурах, требовать небольшого количества энергии и будут базироваться преимущественно на дешевых субстратах, используемых в качестве первичного сырья. Биотехнология применяет методы, заимствованные из химии, микробиологии, биохимии, молекулярной биологии, химической технологии, компьютерной техники с целью создания новых разработок, развития и оптимального использования, существующих биотехнологических процессов. Схематически связь биотехнологии с другими науками отображена на рис. 1. ИСТОРИЯ И УРОВНИ РАЗВИТИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ Биотехнология включает многие традиционные процессы. Давно известные и используемые человеком, это пивоварение, хлебопечение, виноделие, производство сыра и т.д. Во всех перечисленных процессах использовались биологические объекты. И все эти процессы на протяжении многих лет совершенствовались, правда, эмпирически. Работы великого французского ученого Луи Пастера заложили фундамент практического использования достижений микробиологии и биохимии в традиционных биотехнологиях. И ознаменовали начала нового научного периода развития биотехнологии. Для этого периода характерно развитие промышленной биотехнологии в особенности ферментационных процессов в промышленных масштабах. Были разработаны стерильные процессы производства ацетона, глицерина путем ферментации. Заложены основы вакцинологии. После открытия Александром Флемингом пенициллина разрабатываются процессы и аппараты для глубинного культивирования продуцентов, что резко удешевило производство данного антибиотика и он стал доступным для широкого использования в клинической практике во время второй мировой войны. 6 Молекулярная биология Микробиология Биохимия Генетика Клеточная биология Химическая инженерия Молекулярная биотехнология Лекарственные препараты Высокопродуктивные с/х животные Вакцины Диагностические препараты Высоко урожайные с/х культуры Рис. 1. База и продукты биотехнологии (по Б.Глику, Дж.Пастернаку) После войны быстрыми темпами развивались процессы ферментации для производства антибиотиков, стероидных гормонов. Следующий этап развития биотехнологии связан с развитием генетики. Так в 1973 г. Коэн и Бойер получили рекомбинантные плазмиды и произвели ими трансформацию клеток кишечной палочки. В течение 4 лет после открытия рекомбинантных ДНКтехнологий появились штаммы бактерий продуцирующих инсулин и человеческий гормон роста. 7 Таблица 1 Основные уровни развития биотехнологии Эмпирический Использование спиртового и молочнокислого уровень (до 1865 г.). брожения при получении пива, вина, хлебопекарных и пивных дрожжей, сыра. Этиологический или Получение этанола, микробиологическое производство Пастеровский ацетона, глицерина, органических кислот, вакцин. (1866-1940 гг.). Аэробная очистка сточных вод. Производство кормовых дрожжей из углеводов, а также кормового белка. Биотехнический, Производство пенициллина и других антибиотиков включая период путем глубинной ферментации. Культивирование становления и животных клеток и получение вирусных вакцин. развития Микробиологическая трансформация стероидов. производства антибиотиков (19411960гг.). Период Получение чистых ферментов. Промышленное управляемого использование иммобилизованных ферментов и клеток. биосинтеза (1961- Получение витаминов В2, В12. 1975гг.). Геннотехнический Использование генной и клеточной инженерии в целях (с 1976 г.). получения агентов биосинтеза. Получение моноклональных антител, рекомбинантных белков и т.д. Во многих странах мира приняты национальные программы по биотехнологии. Так например, В США ежегодные затраты на биотехнологию составляют 2-3 млрд. долларов. ЗАДАЧИ БИОТЕХНОЛОГИИ Биотехнология имеет своей целью создание и практическое использование: - новых биологических активных веществ (БАВ) и лекарственных препаратов, используемых в здравоохранении для диагностики, профилактики и лечении заболеваний (интерферонов, инсулина, гормонов роста человека, моноклональных антител, вакцин и др); регуляторов роста растений, бактериальных удобрений, микробиологических средств защиты растений от болезней и вредителей, 8 новых высокопродуктивных и устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды сортов и гибридов сельскохозяйственных растений, полученных методом генетической и клеточной инженерии; - ценных кормовых добавок для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных (кормового белка, аминокислот, ферментов, витаминов, ветеринарных препаратов); - новых технологий создания и получения ценных продуктов для использования их в пищевой, химической, микробиологической, фармацевтической и др. отраслях промышленности; - эффективных технологий переработки сельскохозяйственных промышленных и бытовых отходов для получения продуктов, которые могут использоваться в других отраслях хозяйственной деятельности человека, например, биогазов, топлива для автомобилей. ОБЪЕКТЫ СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ Главным звеном биотехнологического процесса, определяющим всю его сущность является биологический объект, способный осуществлять определенную модификацию исходного сырья и образовывать тот или иной необходимый продукт. В качестве таких объектов биотехнологии могут выступать вирусы, бактерии, грибы, простейшие, клетки животных и растений, трансгенные животные и растения, а также многокомпонентные ферментные системы клеток и отдельные ферменты. Основы большинства современных биотехнологических производств до сих пор является микробный синтез, т.е. синтез разнообразных биологически активных веществ с помощью микроорганизмов. К сожалению объекты растительного и животного происхождения в силу ряда причин еще не нашли столь широкого применения. Независимо от природы объекта первичным этапом разработки любого биотехнологического процесса является получение чистых культур организмов - если это микробы; клеток или тканей – если это более сложные организмы растений или животных. Многие этапы дальнейших манипуляций с клетками растений и животных по сути дела являются принципами и методами, используемыми в микробиологическом производстве. 9 Объекты биотехнологии Грибы микромицеты, макромицеты) Чистые Клеточные органеллы, мембраны и т. д. Вирусы, бактерии культуры Ферменты нуклеиновой кислоты Культуры тканевых клеток Микроорганизмы Соматические Половые Культуры с заранее заданными свойствами Мутанты микроорганизмов Рис. 2. Объекты биотехнологических производств Главным критерием при выборе биотехнологического объекта, в данном случае микроорганизма-продуцента, является способность синтезировать целевой продукт. Однако помимо этого в технологии самого процесса могут закладываться дополнительные требования, которые в ряде случаев могут быть решающими. В общем, микроорганизмы должны обладать высокой скоростью роста, утилизировать необходимые для их жизнедеятельности дешевые субстраты, быть резистентными к посторонней микрофлоре. ПРИМЕНЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ В РАЗЛИЧНЫХ ОТРАСЛЯХ НАУКИ И ПРОМЫШЛЕННОСТИ В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в следующих отраслях:  в сельском хозяйстве (ветеринария, растениеводство, животноводство) -разработка в области растениеводства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты растений, бактериальных удобрений, микробиологических методов рекультивации почв; в области 10 животноводства- создание эффективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукции животных на основе эмбриогенетических методов;  в промышленности (пищевая, легкая, химическая, нефтегазовая и др.) - использование новых веществ на основе биосинтеза и биотрансформации;  в экологии – разработка экологически безопасных технологий очистки сточных вод, утилизация отходов, конструирование экосистем;  в энергетике - применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза, биоконверсии биомассы в биогаз;  в области медицины и фармацевтики – разработка медицинских и фармацевтических препаратов, моноклональных антител, диагностикумов, вакцин, синтез гормонов, ферментов, интерферонов, антибиотиков, аминокислот, витаминов, полисахаридов и других биологически активных веществ. ПРЕИМУЩЕСТВА БИОТЕХНОЛОГИИ ПЕРЕД ТРАДИЦИОННЫМИ МЕТОДАМИ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТА Преимущества биотехнологии перед традиционными методами производства: 1. Клетки являются своего рода биофабриками белков, жиров, углеводов, витаминов, аминокислот, нуклеиновых кислот, антибиотиков, гормонов, антител, ферментов, спиртов. 2. Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся (бактерии - за 20-60 мин, дрожжи - 1,5-2 часа, тогда как животная клетка -24 часа). 3. Биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и др., значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез. 4. Для биосинтеза используются отходы сельскохозяйственной, рыбной продукции, пищевой промышленности. 5. Возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ И РАЗДЕЛЫ БИОТЕХНОЛОГИИ 1. медицинская биотехнология 2. иммунобиотехнология 3. инженерная энзимология 4. биоэнерготехнология 5. генетическая инженерия 6. экологическая биотехнология 7. сельскохозяйственная биотехнология 11 8. промышленная биотехнология В настоящее время биотехнологические методы широко используются в некоторых отраслях народного хозяйства. Например, получение биогаза из органических отходов, получение моторного топлива, биологическая очистка стоков, газовых выбросов, получение кормового белка для откорма животных, красителей для тканей, создание биосенсоров – приборов для измерения концентрации различных веществ, сверхчувствительных фотоматериалов и т.д. ПРЕПАРАТЫ, ПОЛУЧАЕМЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ СПОСОБОМ Наиболее широко применяются в медицине следующие препараты, получаемые биотехнологическим способом. 1. Вакцины. Открытие Эдвардом Дженнером эффекта вакцинации явилось основой для проведения прививок не только против вирусов, но и бактерийных микроорганизмов. Были созданы вакцины, различающиеся по технологии приготовления:  живые вакцины,  инактивированные,  химические,  рекомбинантные,  анатоксины. 2. Антибиотики. Антибиотики специфические продукты жизнедеятельности различных групп микроорганизмов, низших и высших растений и животных, обладающие высокой физиологической активностью в отношении определенных групп микроорганизмов или злокачественных опухолей и избирательно вызывающие их гибель или угнетающие рост. Образование антибиотиков - наследственно закрепленная особенность метаболизма организма. Производство антибиотиков осуществляется путем направленного биосинтеза, Для микроорганизма - продуцента способность образовывать антибиотики важна не постоянно, а лишь в неблагоприятных условиях, например, при истощении среды питательными компонентами, при контакте со специфическими продуктами жизнедеятельности другого полусинтетическим (биологический+ химический) способом, путем химического синтеза. 3. Витамины. Витамины - группа незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. 4. Цитокины. Цитокины – это большая группа белков с различными 12 функциями, синтезируемая лимфоретикулярными клетками. Они представлены интерферонами и интерлейкинами. Цитокины участвуют во многих видах взаимодействий, обеспечивающих функционирование иммунной системы и контроль гемопоэза. 5. Иммунодепрессанты. Бывают случаи, когда требуется не стимулировать иммунную систему, а, наоборот, подавлять ее. Классический пример - пересадка органов: сердца, почек и других. 6. Кровезаменители. Во многих случаях при операциях человеку неоходимо переливание крови. Как уже упоминалось, кровь- большой дефицит. В связи с этим созданы различные кровезаменители, например полиглюкин, которые синтезируют с помощью специальных микроорганизмов. 7. Стероидные гормоны. В детстве многие страдают диатезом, иногда возникает и более тяжелое заболевание - экзема. Для лечения этих болезней используют мази, основанные на стероидных гормонах, при получении которых применяют процесс биотрансформации. 8. Медицинские ферменты. Ферменты - белковые вещества, выполняющие функции катализатора химических реакций и используемые в медицине, пищевой, фармацевтической и химической промышленности. В медицине используют следующие ферменты: - стрептокиназу - тромболитик прямого действия, способствует переходу плазмогена в плазмин и ведет к растворению фибринового сгустка в кровеносных сосудах, способен проникать внутрь тромба. На мировом рынке лидируют препараты стрептокиназы из микробного сырья. - бета-галактозидаза, помогает усваивать молочный сахар (лактозу) тем людям, у которых по генетическим причинам такой фермент в организме не вырабатывается; - протеазу используют для очистки гнойных очагов, а также для лечения ожогов; - L-аспарагиназу применяют для лечения рака: она лишает раковые клетки аминокислоты аспарагина; здоровым клеткам это не страшно - они сами синтезируют аспарагин. 9. Медицинские аминокислоты. Аминокислоты - структурные единицы белков. Подавляющее число природных аминокислот относится к L-ряду. Их применяют в медицине, животноводстве, пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленностях. По объему производства аминокислоты занимают первое место, а по стоимости занимают второе место после антибиотиков. 13 Природные аминокислоты используются для биосинтеза ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, токсинов и других азотсодержащих соединений. Практически половина белковых аминокислот в организме не синтезируется. Эти, так называемые незаменимые аминокислоты, поступают в организм с пищей. Их недостаток приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития. Ежегодно в мире производится более 800000т аминокислот стоимостью более 5 млрд. долларов. В промышленных масштабах аминокислоты получают: -гидролизом природного белоксодержащего сырья; -химическим синтезом; -микробиологическим синтезом; -биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов; -химико-микробиологическим методом. Производство аминокислот гидролизным методом позволяет создавать безотходные технологии, что способствует оздоровлению окружающей среды. При химическом синтезе аминокислот образуется смесь D и Lстереоизомерных форм, разделение и выделение L-форм является дорогой и чрезвычайно трудоемкой процедурой. Химическим синтезом получают метионин, метаболизм которого нестереоизбирателен. Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Более 60% всех производимых промышленностью белковых аминокислот получают этим способом, преимуществом которого является выделение L- аминокислот на основе возобновляемого сырья. Генетическая инженерия используется для создания высокопродуктивных штаммов промышленных микроорганизмов. Путем введения гена с заданной направленностью в геном бактерии изменяют регуляторные свойства ферментов, питательные потребности штамма. При получении ряда аминокислот химико-ферментативными способами используют энзимы микроорганизмов, принадлежащие к разным классам. Применение ферментов в производстве аминокислот обеспечивает нужную стереоспецифичность процесса и увеличивает выход конечного продукта. 10. Пептиды. Пептиды любого происхождения универсальны,они оказывают защитное действие на организм млекопитающих, стимулируя работу иммунной системы. К ним относятся ганглиин, молокин, вермин. Сырьем для получения пептидов являются гидробионты. Препараты применяют для устранения вторичных иммунодефицитов. 11. Подсластители. Биотехнология позволяет получать препараты на основе аминокислот, которые в 200 раз слаще сахара (аспартам). Они очень 14 подходят больным диабетом и людям, склонным к полноте,- это как бы безопасная сладость. 12. Женьшень. Отечественными учеными получен препарат "Настойка Биоженьшень" на основе высокопродуктивного штамма культуры клеток женьшеня. Настойка широко применяется для повышения тонуса человека, снижения утомляемости, изготовления лосьонов, кремов. Комплекс гинзенозидов (сапонинов женьшеня), выделенный из культуры тканей, предлагается в качестве противоэпилептического средства. 13. Биоразлагаемые полимеры. Биотехнология позволила создать биоразлагаемые полимеры в виде материала, напоминающего по свойствам полипропилен и способного к формированию нитей, штифтов для соединения костей, пленок и других необходимых компонентов. Такой материал называется полигидроксибутират и получают его путем выращивания специальных бактерий, больше половины объема которых занимают как бы комочки пластмассы (это видно под электронным микроскопом). Этот прекрасный материал можно использовать и для создания лекарств более длительного действия (они выделяются из гранул с полигидроксибутиратом по мере их растворения), а также для аппликаций на раны или ожоги. 14. Нейропептиды. Ведут разработку биотехнологических методов получения естественных нейропептидов, которые ответственны в мозгу человека за сон, боль, память, удовольствие и т. д. Схема та же - с помощью генной инженерии «конструируют» микроорганизм, способный синтезировать соответствующий пептид. 15. Косметические токсины. В последнее время научились делать косметические средства, разглаживающие морщины и омолаживающие лицо, на основе ботулинических токсинов сильнодействующих ядов паралитического действия, продуцируемых палочкой ботулизма (интересная трансформация яда в лекарство!). Приведенные примеры, конечно, не исчерпывают всех перспектив биотехнологии в медицине, но они демонстрируют первостепенную важность биотехнологии для этого вида человеческой деятельности. На современном этапе актуально продолжение исследований в области направленного транспорта лекарственных средств, трансплантации органов, тканей, клеток, формирования нового класса медицинской техники - индивидуальных биотехнологических систем для контроля состояния организма. ПЕРСПЕКТИВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Моноклональные антитела Впервые методика получения моноклональных антител (МА) с помощью 15 гибридомной технологии была опубликована в 1975 г. Кёлером и Мильштейном. В 1984 г. ученые получили за ее создание Нобелевскую премию. Именно они, предварительно введя в организм антиген и вызвав, таким образом, иммунный ответ, извлекли лимфоидную клетку, продуцирующую соответствующие антитела, и объединили ее с клеткой опухоли (миеломы). В результате получился непрерывно делящийся клеточный гибрид (гибридома), способный синтезировать антитела с заданной специфичностью. МА - продукт одного клона плазматических клеток, имеющий постоянные физико-химические свойства и сродство к антигену, направленный к строго определенной антигенной детерминанте (пространственно организованный активный центр белковой молекулы, состоящий из аминокислотных остатков). Гибридомная технология позволяет продуцировать неограниченное количество МА к разнообразным антигенам. Их можно применять как препараты диагностического или лечебного назначения. МА имеют преимущества перед обычными сыворотками, являясь идеальными по специфичности реагентами на тот или иной антиген. МА применяются для определения иммунного статуса пациентов, диагностики и контроля эффективности лечения онкологических заболеваний, диагностики бактериальных и вирусных инфекций (гепатиты А, С, простой герпес, клещевой энцефалит, цитомегаловирусная инфекция, ВИЧ), для определения биологически активных веществ - белков крови, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и др. Для исследования локализации злокачественного новообразования и степени метастазирования используют метод введения в организм специфичных к определенной опухолевой клеточной популяции МА, связанных с радиоактивными изотопами. В настоящее время уже создано и успешно применяется в клинической практике несколько лекарственных препаратов, содержащих моноклональные антитела: - ритуксимаб (Мабтера) специфически связывается с определенными антигенами клеточных мембран нормальных и злокачественных В-лимфоцитов, запуская иммунные процессы, приводящие к гибели клеток злокачественных опухолей. Препарат применяется в онкогематологии; - абсиксамаб (Реопро) российского производства блокирует рецепторы IIb/IIIa тромбоцитов и используется в качестве антиагреганта; - муромонаб (Ортоклон) блокирует рецепторы Т-лимфоцитов, отторгающих пересаженный трансплантат. Используется как иммунодепрессант при 16 пересадке органов; - резоклон - человеческий моноклональный иммуноглобулин анти-резус. Вводится внутривенно. Применяется для предотвращения резуссенсибилизации (образования антител к резус-фактору) у резус-отрицательных женщин, вынашивающих резус-положительного ребенка с целью профилактики у него гемолитической болезни новорожденных. Препарат также используется для предупреждения гемолитической болезни у резусотрицательных лиц, получивших трансфузию крови или ее компонентов, содержащих резус-положительные эритроциты; - инфликсимаб (Ремикейд) - МА к фактору некроза опухоли-альфа применяется в лечении ревматоидного артрита; - базиликсимаб (Симулект) компании «Новартис фарма» - МА к рецептору интерлейкина-2, вызывают превращение В-лимфоцита в плазматическую клетку - непосредственного производителя антител против узнанного антигена; - трастузумаб (Герцептин) - МА, избирательно взаимодействующие с внеклеточным доменом рецептора эпидермального ростового фактора человека (HER2-neo). Применяется в онкологии. С МА связаны большие перспективы в лечении и предупреждении злокачественных новообразований. Создаются вакцины против общих для разных опухолей антигенов (или против антигенов онкогенных вирусов), вируса гепатита В, коллагенозов (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия, ювенильный артрит, системный гранулематоз Вегенера), болезни Крона, демиелинизирующего поражения нервной системы, стрептококковых инфекций, аллергических заболеваний и др. Предпринимаются попытки связать МА с противоопухолевыми препаратами, такими, как доксорубицин или рицины. Это обеспечит адресную доставку токсичного препарата к опухолевым клеткам, позволит «прицельно» (направленно) обнаруживать и уничтожать их, не повреждая здоровые ткани. Таким образом, работы по получению новых моноклональных антител в целях создания на их основе лекарственных и диагностических средств очень перспективны. Они позволят вывести практическую медицину на качественно новый уровень. Гибридомная технология стала прорывом в разработке препаратов для лечения злокачественных новообразований, вирусных, аутоиммунных и многих других заболеваний. Терапия с помощью МА эффективна, очень специфична, т.е. нацелена только на определенный патологический механизм, являющийся причиной заболевания, и, следовательно, сравнительно безопасна. Уже сегодня 20% разрабатываемых биофармацевтических препаратов являются продуктами гибридомной технологии. Всего в мире на различных стадиях разработки находится свыше 17 350 лекарственных средств, содержащих МА, 70 из них проходят клинические испытания. Рекомбинантные белки как лекарственные средства Успехи генетической инженерии привели к тому, что свыше 100 белков человека (биорегуляторов, корректоров гомеостаза, факторов врожденного и приобретенного иммунитета) могут сохранять свою видоспецифичность. Основным при получении рекомбинантных белков является решение проблемы дефицита сырья, так как из человеческих тканей в промышленном масштабе получать их, естественно, невозможно. При выборе микроорганизма (как продуцента чужеродного белка предполагаемого лекарственного препарата) необходимо: • наиболее полно изучить геном; • подробно исследовать метаболизм на уровне вида; • чтобы микроорганизм обладал умеренной патогенностью (в идеале предполагается ее полное отсутствие); • чтобы микроорганизм был способен расти в условиях производства на недефицитных и экономически доступных средах. Избранные в качестве предполагаемых продуцентов микроорганизмы оцениваются и изучаются уже на уровне конкретных штаммов. При необходимости штаммы-биообъекты (как носители чужеродного генетического материала и продуценты чужеродного белка) могут быть усовершенствованы методами генетической инженерии, что позволяет свести к минимуму вероятность протеолиза чужеродных белков, гидролиза чужеродной информационной РНК и «исключения» чужеродных генов из генома. Иногда чужеродный белок может откладываться в клетке продуцента в виде белковых гранул (в недоступной для протеаз форме), что характерно, например, для Е. coli. В качестве продуцентов рекомбинантных белков человека чаще других в настоящее время используются: Escherichia coli (кишечная палочка), Bacillus subtilis (сенная палочка), Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи). Инсулин. На первом месте по объему производства и стоимости продукции рекомбинантного белка как лекарственного средства находится хорошо известный гормон — инсулин, контролирующий уровень глюкозы в крови. Промышленное производство рекомбинантного инсулина было впервые начато в 1982 г. В настоящее время его годовой оборот составляет около одной трети общего оборота всех рекомбинантных белков, используемых в медицине. Инсулин - гормональный препарат, синтезируемый бета-клетками 18 островков Лангерганса поджелудочной железы и отвечающий за биосинтез нуклеиновых кислот, белков, обмен углеводов, липидов, продукцию высокоэнергетических соединений. Недостаток гормона вызывает заболевание - сахарный диабет. Первые препараты инсулина получали путем экстракции гормона из поджелудочной железы свиней. В дальнейшем совершенствовали технологию получения гормона, включая замену сырья свиного на говяжье; получение пролонгировапнных препаратов инсулина; приготовление кристаллических его форм; тщательную очистку от продуктов, вызывающих инсулиновую аллергию. Для снижения побочных явлений от гетерогенного инсулина необходим был гомологичный препарат - инсулин человека. С помощью технологии рекомбинантных ДНК, включающей внедрение клонированной ДНК гена человеческого проинсулина в Е.coli , наработку проинсулина и гидролиз его до инсулина получили препарат под торговой маркой «Хьюмулин». Полученный рекомбинантный человеческий инсулин был менее реактогенен, чем свиной. В настоящее время в производстве рекомбинантного инсулина конкурируют две принципиально разные технологии. Согласно первой в клетки микроорганизма-хозяина вводят плазмиду, содержащую последовательность нуклеотидов, соответствующую проинсулину (цепи А Спептиду, цепи В и далее лидерному пептиду и промоторному участку). В дальнейшем С-пептид отделяется. Особенность второй — раздельное получение цепи А и цепи В в двух микробных культурах, которые впоследствии объединяются. Гормон роста (соматотропин). СТГ - пептидный гормон, секретируемый передней долей гипофиза, содержит. Дефицит этого гормона приводит к гипофизарной карликовости, незаживающим переломам, язвам, ожогам, нарушению гемопоэза. Гормон видоспецифичен, поэтому для его приготовления использовали гипофиз, полученный из мозга умерших людей. Производимого фармацевтическим производством гормона хватало для лечения лишь 1/3 людей с гипофизарной карликовостью. При применении человеческого СТГ возникли проблемы, связанные с наличием в препарате нейротоксического вируса, а также появлением аллергических реакций, обусловленных реактогенностью трупного материала. С 1985 г. запрещено применение гормона, выделенного из человеческих гипофизов. В настоящее время СТГ синтезируют методами генетической инженерии в клетках E.coli в больших количествах. На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и, расщепляя рестрикционными эндонуклеазами, получали последовательность, которая кодирует 19 аминокислотную последовательность гормона, за исключением с 1 по 23 аминокислоту. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий этим аминокислотам. Два фрагмента объединяли и затем «подстроили» к паре промоторов и участку связывания рибосом в бактериальную клетку. Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках кишечной палочки, был биологически чистым, свободным от вирусных загрязнений. Конечный выход гормона составил 2.4 мкг на 1 мл культуры Е. соli. Эритропоэтин. Этот гликопротеин необходим для созревания (дифференцировки) эритроцитоидных клеток. Белок видоспецифичен, вырабатывается в почках. Эритропоэтин нужен при анемии, вызываемой почечной недостаточностью, а также при анемиях, которые могут наблюдаться при гемотрансфузии, облучении и химиотерапии опухолей, т.е. всюду, где может происходить угнетение кроветворения. В США свыше 100 тыс. человек получают по две инъекции эритропоэтина в неделю (ампулы эритропоэтина в цитратном буфере по 2 000 — 4 000 ЕД содержат также сывороточный альбумин). Отметим и такой своеобразный факт: во время олимпийских игр и других международных соревнований спортсменов, злоупотребляющих эритропоэтином, дисквалифицируют. Способ получения рекомбинантного эритропоэтина (необходимо подчеркнуть: гликопротеина) имеет важную особенность — ген эритропоэтина человека встраивается не в микробные, а в животные клетки (яйцеклетки китайского хомячка), где белок может быть гликозилирован. При этом продуцентом эритропоэтина является монослойная культура этих клеток. Пептидные факторы роста тканей. Эти многочисленные биорегуляторы обладают как видовой, так и тканевой специфичностью. Иногда применительно к ним используется определение: гормоны, образуемые вне желез внутренней секреции. Их наработка для медицинской практики возможна лишь путем микробиологического синтеза, т.е. как рекомбинантных белков. В настоящее время подробно изучены эпидермальный фактор роста (ЭФР) и некоторые другие. Исследования в этом направлении продолжаются, но уже сейчас получены положительные результаты в экспериментах (например, ускорение заживления ран при использовании ЭФР). 20 НАНОНАУКА И НАНОТЕХНОЛОГИЯ В ФАРМАЦЕВТИКЕ И МЕДИЦИНЕ Нанонаука – дисциплина, изучающая фундаментальные принципы молекул и структур, размер которых равен от 1 до 100 нанометров (нм). Эти элементы называются наноструктурами. Впервые термин «нанотехнология» применил Норио Танигучи, инженер из Токийского университета, в 1974 г. в статье, которая посвящалась обработке материалов. Прошло еще 20 лет, прежде чем термин был введен в широкий научный оборот. Нанотехнология – это применение данных наноструктур в полезных наноскопических устройствах. Таблица 2 Система измерения Единица СИ (аббревиатура) Описание метр (м) сантиметр (см) миллиметр (мм) микрометр (мкм) нанометр (нм) Приблизительно три фута или один ярд 1/100 метра, примерно полдюйма 1 / 1 000 метра 1 / 1 000 000 метра также называется микроном 1 / 1 000 000 000 метра, размер отдельных небольших молекул и сфера деятельности нанотехнологии Сегодня нанотехнологии являются одной из наиболее интенсивно развивающихся областей науки в самых разных отраслях, в т.ч. в медицине и фармации. Выделяют 5 основных областей применения нанотехнологий в медицине: доставка активных лекарственных веществ, новые методы и средства лечения на нанометровом уровне, диагностика in vivo, диагностика in vitro, медицинские имплантаты. Более 50% фармацевтических компаний-производителей, которые активно работают в области наномедицины, используют нанотехнологии для разработки систем доставки активных лекарственных веществ к органам и тканям-мишеням. Эти препараты дают сегодня 80% оборота в мировой наномедицине. Одной из ведущих областей применения таких систем является онкология. Использование систем доставки направлено на уменьшение неблагоприятных побочных эффектов ЛС. Среди этих нанопрепаратов уже 21 имеются два блокбастера, не считая других успешных препаратов, вместе их оборот составляет 5 млрд. долл. Значительно ниже доля предприятий, производящих на нанотехнологической основе имплантаты (19%) и средства для диагностики in vitro (17%). Наиболее сложными проблемами — разработкой методов и средств лечения на основе принципиально новых терапевтических концепций — занимаются лишь 3% компаний. СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Рис. 3. Наноносители лекарственных средств В 60-е годы прошлого века были получены липосомы, способные доставлять в орган-мишень лекарственное вещество. Различают два вида липосом: мультиламелларные липосомы, диаметр которых может составлять до 10 µm, и состоящие из одной ламеллы (пластинки) с диаметром примерно от 20 до 50 nm. Последние используются в качестве средства доставки активного лекарственного вещества. Полимерные наночастицы было предложено использовать в качестве систем доставки в 70-х годах XX в. Исходным материалом для них могут служить различные естественные или биоинертные синтетические полимеры, например, полисахариды, полимолочная кислота, полилактиды, полиакрилаты, акрилполимеры и др. Под термином «полимерные наночастицы» понимают два морфологически различных вида частиц: наносферы и нанокапсулы. Наносферы представляют собой сплошные полимерные матрицы, на которых распределяется активное вещество. Нанокапсулы состоят из полимерной оболочки, охватывающей наполненную жидкостью полость. Эти виды наночастиц различаются по высвобождению активного лекарственного вещества: из наносфер высвобождение протекает по экспоненте, а из нанокапсул — в течение длительного времени константно. 22 Еще один тип систем доставки лекарственных активных веществ обязан достижениям в области разработки дефинированных поливалентных и дендритических полимеров. Здесь примерами могут послужить полианионные полимеры — ингибиторы клеточных связей с вирусами, поликатионные комплексы с ДНК или РНК (т.н. полиплексы) и дендритные клетки. К сожалению, несмотря на высокий потенциал эффективности, системы доставки активных веществ в органы и ткани-мишени связаны и с нежелательными побочными эффектами. Так, фармацевтический гигант Novartis, концерн Ciba после анализа данных по безопасности различных систем доставки приняли решение сосредоточиться на разработке ЛС с расщепляемыми наноносителями, поскольку безопасность стабильных наночастиц вызывает сомнения и нужны дополнительные исследования для ее подтверждения. Поиск альтернативных систем продолжается. Наряду с совершенствованием известных систем доставки разрабатываются новые — соединения полимеров с активными веществами, полимерные мицеллы, неорганические наночастицы, твердые липидные наночастицы, фуллерены. Последние, по мнению экспертов, могут стать основой не только для систем доставки, но и для нового класса ЛС. На основе фуллеренов разрабатываются препараты — средства доставки ЛС для лечения ВИЧ-инфицированных пациентов и онкологических больных. Системы доставки имеют большое значение для ЛС на основе протеинов, действие которых зачастую снижается из-за ограниченного времени нахождения в крови, химической лабильности и способности провоцировать иммунную реакцию. С помощью систем доставки ученые пытаются улучшить аппликационные свойства протеиновых препаратов. Благодаря присоединению к протеину полимерной цепочки удается не только увеличить период их полураспада в крови, но и повысить их эффективность. Сегодня известны два бестселлера среди нанофармацевтических препаратов — полимер-протеиновый конъюгат Пегасис (Pegasys — пэги лированный альфа2а-интерферон) для лечения гепатита С и Нейласта (Neulasta — пегилированный hG-CSF) для терапии нейтропении. АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА И НОВЫЕ СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ Нанометровые молекулы могут применяться непосредственно в качестве активных веществ. В частности, интересным классом молекул с этой точки зрения являются дендримеры. Эти разветвленные, как крона дерева, молекулы (отсюда их название) могут достигать размера мелких протеинов. По сравнению с классическими полимерными молекулами они обладают тем преимуществом, что можно контролировать их синтез с заданными свойствами, 23 т.е. запрограммировать для определенного медицинского применения. Кроме того, на поверхности можно расположить специфическим образом определенные функциональные группы так, чтобы они особенно эффективно взаимодействовали с вирусами и клетками. Примером создания активного вещества на основе дендримера является препарат Vivigel -гель, способный защитить от ВИЧ-инфекции. Вивигель разработан австралийской биотехнологической компанией Starpharma, сейчас проходят его клинические исследования. Одним из новых принципов является размельчение активных лекарственных веществ до нанометровых размеров. Так пытаются решить проблему недостаточной растворимости ЛС: 40% новых активных веществ, которые сейчас находятся в разработке, растворяются плохо и, соответственно, обладают недостаточной биодоступностью. В 90-е годы удалось получить наночастицы активного лекарственного вещества, т.н. активные нанокристаллы, с помощью процессов размельчения или гипербарической гомогенизации. Эти наночастицы на 100% состоят из активного вещества и производятся в виде суспензии (наносуспензии), которую можно вводить внутривенно, а для перорального приема можно производить гранулы или таблетки из суспензии. При этом не нужна полимерная матрица, разрушение которой, как считают некоторые ученые, может оказывать токсическое действие на клетки. Обычный размер нанокристаллов составляет 200—600 nm. Для улучшения аппликационных свойств нанокристаллических ЛС проводят модификацию поверхности кристаллов. В этом направлении работают компании Wyeth-Ayers Laboratories (США), PharmaSol (ФРГ), SkyePharma (Великобритания), Merck&Co. (США) и многие другие. Одним из нанокристаллических препаратов, внедренных в клиническую практику в 2000 г., является Rapamune (Wyeth-Ayers Laboratories) — иммуносупрессивное ЛС, которое применяют после трансплантации органов. При производстве этого препарата была применена технология Nano-Crystal® (разработчик — Elan). А в 2003 г. фармконцерны Merck&Co. и Johnson&Johnson заключили контракт с компанией Elan на применение этой технологии при производстве других инновационных ЛС. Иная концепция заложена в основу термотерапии наночастицами. Например, новый способ лечения раковых опухолей заключается в том, что наночастицы вводят в опухоль, а затем либо за счет воздействия магнитного поля, либо лазерного облучения их нагревают, при этом опухолевые клетки разрушаются. Впервые эта медицинская технология была предложена более 15 лет назад учеными из университетской клиники Шарите (Берлин) под руководством д-ра Йордана (Jordan). За эту разработку в 2005 г. ученые были отмечены премией Frost&Sullivan Award for Technology 24 Innovation. В 2003 г. разработка была передана коммерческой нанотехнологической компании для доведения и внедрения. Тогда же начались клинические исследования термотерапии опухолей мозга и рака предстательной железы. Сегодня в этом направлении работает целый ряд компаний в Европе (например, Magnamedics, Ахен) и США (Nanospectra Bioscience, Хьюстон). ДИАГНОСТИКА IN VIVO Революционные достижения геномики и молекулярной биологии привели к лучшему пониманию молекулярных процессов, которые лежат в основе болезней. Диагностику, основанную на передаче визуальной информации о молекулярных структурах, можно назвать молекулярной визиографией. Здесь используется тот же принцип, что и при традиционных методах получения изображений — радиографии, эхографии, УЗИ и т.д., только требуется иное контрастное вещество, а также специальные медицинские приборы и системы обработки данных. Контрастное вещество для молекулярной диагностики состоит из наночастиц, с которыми соединены визуализирующие компоненты и определенные антитела либо какие-нибудь другие молекулы, способные отыскать цель. Когда контрастное вещество вводится в кровеносное русло, его поисковые компоненты взаимодействуют с целевыми структурами на поверхности больной клетки по принципу «ключ-замок», и визуализирующие компоненты попадают в больные ткани. После этого остается «считать» визуализированную информацию. Над этой концепцией работает компания Kereos (СтЛуис), которая разрабатывает контрастные вещества на основе наноэмульсии перфторкарбона, каждая капелька которой несет по нескольку тысяч атомов гадолиниума. Таким образом, резко повышается контрастность. Эти препараты компания разрабатывает в сотрудничестве с мировыми концернами Philips и Bristol-Myers Squibb. Сложные молекулярные контрастные вещества, создаваемые на основе нанотехнолоий, пока еще недоступны для клинической практики. Но уже внедрены простые контрастные вещества, которые состоят из наночастиц окиси железа. Они обеспечивают высокую контрастность в диагностике заболеваний печени. Такое контрастное вещество разработала и внедрила под торговой маркой Resovist® компания Schering. ДИАГНОСТИКА IN VITRO Эксперты указывают, что нанотехнологии способствовали ренессансу биосенсорики, т.к. они позволили осуществить совершенно новые сенсорные концепции. Нанотехнологии в диагностике in vitro развиваются в двух направлениях: 1) использование наночастиц как маркеров биологических 25 молекул; 2) применение инновационных нанотехнологических способов измерения. Фирма Nanosphere из Иллинойса разработала новые диагностические тесты для выявления онкологических заболеваний, болезни Альцгеймера и муковисцидоза. Причем заявлено, что новый диагностический тест для муковисцидоза будет стоить в 10 раз дешевле имеющихся сегодня. К новым наномедицинским диагностическим тестам относятся также сенсорные системы Cantilever и SPR (поверхностный плазменный резонанс). Сенсор Cantilever состоит из искусственных балок длиной от нескольких десятков до 200 µm и толщиной от нанометров до микрометров. Балки покрываются слоем молекул ДНК или протеинов, которые специфически взаимодействуют с целевыми биомолекулами в пробе. Это взаимодействие приводит к отклонению балки, движение которой улавливает лазерный детектор. По сравнению со многими оптическими методами сенсор Cantilever обладает тем преимуществом, что молекулы в пробе не требуют маркировки, и за счет этого процедура диагностики существенно упрощается. Сенсор SPR позволяет измерять взаимодействие между протеинами или протеинами и ДНК в режиме реального времени за счет определенного расположения нанослоев и разной интенсивности отраженного света в зависимости от массы биомолекул в слое. Эти приборы уже нашли широкое применение в медицинском материаловедении. Стоит упомянуть еще диагностическую систему Quicklab, предназначенную для экспресс-диагностики. Это малогабаритный электронный прибор с биочипом с нанометровыми электродами. Молекулы ДНК и протеины определяются биохимическим методом. Принцип разработан Институтом кремниевых технологий (Германия) и воплощен концерном Siemens Corp. Technology. Прибор предназначен для диагностики инфекционных заболеваний, заражения крови, воспаления легких, болезней мочеполовых путей. ИМПЛАНТАТЫ И БИОМАТЕРИАЛЫ Имплантология получила в последние десятилетия импульс для развития в связи с потребностью в способах и средствах восстановления или замещения органов и тканей. Ряд фирм уже давно работают с нанокристаллическими материалами и покрытием поверхности имплантатов гидроксилапатитом. Другим методом является нанокристаллическое алмазное покрытие, которое также обещает увеличить продолжительность функционирования и стабильность имплантатов. В экспериментах уже показано, что остеобласты распознают алмазные субмикроструктуры и могут закрепляться на них. Эти результаты указывают на прекрасную биосовместимость алмазных покрытий. Материалы из нанокристаллического гидроксилапатита применяются для лечения костных дефектов, причем благодаря нанокристаллической структуре в 26 таком имплантате процесс остеогенеза практически включает искусственный материал в естественную кость. Недавно начало развиваться еще одно направление нанотехнологических биоматериалов — нановолокна, которые ученые предполагают использовать при тканевом инжиниринге — создании искусственных тканей (в перспективе — возможно также и органов) на основе клеточных технологий. Таким образом, сегодня закладывается фундамент применения нанотехнологий практически во всех областях медицины. ЛИПОСОМЫ Создание искусственных мембран-липосом является одним из перспективных направлений современной нанобиотехнологии. Липосомальные носители обладают рядом несомненных преимуществ: — защищают клетки организма от токсического действия лекарственных средств; — пролонгируют действие введенного в организм лекарственного средства; — защищают лекарственные вещества от деградации; — способствуют проявлению нацеленной специфичности за счет селективного проникновения из крови в ткани; — изменяют фармакокинетику лекарственных препаратов, повышая их фармакологическую эффективность; — позволяют создать водорастворимую форму ряда биологически активных веществ, увеличивая тем самым их биодоступность. В связи с вышеизложенным, становится понятен интерес, который возник в последнее десятилетие к липосомам, как к перспективным адъювантным компонентам. Одно из основных требований к адъювантам — их способность расщепляться и выводиться из организма. Липосомы в полной мере отвечают этим требованиям. Состоящие из природных или (реже) синтетических фосфолипидов (фосфатидилхолина, фосфатидилинозита, фосфатидилсерина и др.) с определенным количеством природного холестерина, липосомы легко биодеградируемы и безвредны. Кроме того, методы очистки липидов позволяют получать высокоочищенные компоненты, в которых количество примесей не превышает 5—10 %, причем эти примеси также фосфолипидной природы. Субстанции для липосом апирогенны и нетоксичны. Немаловажным является возможность получения вакцин с липосомальными адъювантами, которые могут легко подвергаться стерилизующей фильтрации, в отличие от минеральных сорбентов. Это, в свою очередь, позволяет проводить стерилизующую фильтрацию на каждом этапе получения вакцинных препаратов, что может позволить отказаться в ряде случаев от консерватов. 27 Липосомы снижают токсичность встроенных антигенов и обладают хорошей биосовместимостью. Особый интерес представляют данные, полученные исследователями при изучении иммуногенности липосомальной вакцины с антигенными пептидами, выделенными из гликопротеина вируса лимфоцитарного хориоменингита. Инкапсулированные в липосомы пептиды обладали высокой иммуногенностью при внутрикожном введении и вызывали защитный противовирусный иммунитет. После внутрикожной инъекции липосомы образовывали депо антигена, которое облегчало длительную загрузку антигена дендритными клетками практически только в местные лимфоузлы. Иммуногенностъ липосомальной пептидной вакцины еще более повышалась при введении в липосомы иммуностимулирующих олигонуклеотидов, что также приводило к значительному активированию дендритных клеток. Предложенная липосомальная пептидная вакцина вызывала защитный противоопухолевый иммунитет. Учитывая, что реакции противоопухолевых и противовирусных Тклеток вызываются, в основном, дендритными клетками, транспортирующими антиген с периферии в организованные лимфоидные ткани, можно предположить, что активирование дендритов липосомальными пептидными вакцинами свидетельствует об их высокой иммуногенности и возможности создания защитной противовирусной или противоопухолевой иммунной реакции. Существующие вакцины против гриппа, применяемые в настоящее время, представляют собой преимущественно вакцины из инактивированного вируса. Существует три вида вакцин: вакцины из цельного вируса, вакцины из фрагментированного вируса и вакцины на основе отдельных антигенных фрагментов вируса гриппа, например, гемагглютинина и нейраминидазы. Для повышения иммуногенной активности используют адъюванты липосомальной природы. Изучение безвредности и иммуногенности коммерческих противогриппозных вакцин проводили на двух группах больных. Первой группе вводили вакцину, содержащую гемагглютинин, а второй группе лиц вводили вакцину, полученную путем введения гемагглютинина в мембрану липосом, состоящих из природного фосфатидилхолина. Для исследования использовали трехвалентную вакцину. Обе вакцины вызывали одинаковый достоверный подъем среднего титра противогемагглютининовых антител. Однако достоверно большее количество лиц, иммунизированных липосомальной вакциной, демонстрировали более чем четырехкратное повышение титра против вируса штаммов Сингапур и Пекин по сравнению с коммерческой вакциной. Процент больных, у которых титр при иммунизации липосомальной вакциной достигал защитной величины, был также значительно 28 выше. Особое клиническое значение имел тот факт, что у 68,4% лиц, иммунизированных липосомальной вакциной, достигался защитный уровень антител против всех трех компонентов вакцины в отличие от 38% при вакцинации обычной вакциной. Так, например, вакцина Invivac (Solvay Pharma), используемая с 1997 года и представляющая виросому (размер менее 200 нм), содержащую гемагглютинин и нейраминидазу, находящихся в липидном бислое, имитирует частицу вируса гриппа. В настоящее время проводится изучение интраназального применения противогриппозной вакцины Invivac вместо общепринятого внутримышечного или подкожного. Ключевыми аспектами, влияющими на разработку новых эффективных адъювантов и вакцин, предназначенных для человека, являются безопасность, высокая степень очистки и физико-химические характеристики окончательного состава адъювантов. Липосомы проявляют свою безопасность в клинических условиях при использовании их как адъювантов вакцин для вирусных и бактериальных антигенов. Были подтверждены в клинических условиях тесты контроля качества, установившие высокую степень очистки, безопасность и стабильность липосомальных вакцин. Липосомы можно рассматривать как основные кандидаты для улучшения иммуногенности как антигенов с гидрофобными участками, так и растворимых немембранных протеинов. Расположение антигена, т. е. абсорбирован ли он или присоединен к липосомальной поверхности при помощи ковалентных связей, или инкапсулирован во внутренний объем липосомы, имеет важное значение и определяет в значительной степени иммунобиологические свойства вакцин. Таким образом, накопленные в литературе данные свидетельствуют о высоком адъювантном действии липосом. Отрицательно заряженные липосомы стимулируют более высокие показатели титров антител, чем положительные. На интенсивность иммунного ответа влияет также способ введения препаратов. Наиболее высокие титры антител выявляются при подкожном введении липосомальных вакцин. В отличие от других адъювантов в месте инъекции образования гранулем не происходило. Еще одно преимущество применения липосом как иммунологических адъювантов состоит в том, что если антиген заключен внутрь липосомы, то можно в значительной степени избежать реакций гиперчувствительности. В заключение, хотелось бы отметить, что преимуществом липосомальных адъювантов является следующее: антигены с низкой иммуногенностью могут быть превращены в высокоэффективные антигены, в липосомы можно включать гидрофобные антигены; с помощью липосомальных вакцин можно достигнуть длительного продолжения специфического действия антител; 29 использование липосом позволяет уменьшить токсичность и пирогенность антигенов и адъювантов. Являясь по своему строению близким аналогом цитоплазматической мембраны клеток, липосомы позволяют предохранить антиген не только от разрушения, но и от взаимодействия с компонентами крови, а также осуществить направленный транспорт к клеткам ретикулоэндотелиальной системы. Немаловажным является наличие липидных субстанций для получения липосомальных структур. Липиды высокой степени чистоты производятся многими специализированными фирмами, которые предлагают природные фосфолипиды, выделенные из различных источников. Так, например, фирма «Iipoid» (Германия) выпускает фосфатидилхолин из яичного желтка и сои с содержанием основного вещества 94-96%. Препараты характеризуются отсутствием бактериальных контаминантов, с достаточно низким содержанием эндотоксинов и количеством тяжелых металлов, не превышающим 10 ррт. Препараты характеризуются стандартным жирнокислотным составом, перекисным и йодным числом, содержанием фосфора (3,8-4,0%) и нейтральных липидов (не более 1,0%). По нашему мнению, указанные липидные субстанции могут быть использованы для получения липосомальных адъювантов. Липосомальные адъюванты нашли широкое применение при вакцинации человека и животных. В настоящее время ведутся разработки липосомальных вакцин против гриппа, дифтерии, столбняка, гепатитов А и В, кишечных инфекций и ряда других. 30 Лекция 2. Слагаемые биотехнологического процесса План лекции 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Типовая схема и основные стадии биотехнологических производств. Подготовительные стадии. Биотехнологические стадии. Разделение жидкости и биомассы. Выделение продуктов биосинтеза. Очистка продукта. Концентрирование продукта. Получение готовой формы продукта. Очистка стоков и выбросов. Литература 1. Бирюков В.В. «Основы промышленной биотехнологии». - М.: «КолосС» «Химия», 2004. 2. Егорова Т.А.-Основы биотехнологии. Учеб. для высш.пед. учеб. заведений М.: издат центр "Академия", 2005 – 208 с. 3. Евтушенков А.Н.,Фомичев Ю.К.- Введение в биотехнологию: курс лекций Мн.: БГУ, 2004 – 94 с. 4. Краснопольский Ю.М., Борщевская М.И. Биотехнология иммунобиологических препаратов. - Харьков: «Фармитэк», 2008. – 312с Вопросы к лекции 1. Типовая схема и основные стадии биотехнологических производств. 2. Процессы, осуществляемые на подготовительной стадии биотехнологического производства. 3. Биотехнологическая стадия производства, отличия процессов ферментации, биокатализа и биотрансформации. 4. Классификация процессов ферментации. 5. Преимущества и недостатки периодического процесса ферментации. 6. Преимущества и недостатки непрерывного способа культивирования. 7. Процессы, используемые на стадии разделения жидкости и биомассы. 8. Основные методы выделения продуктов биосинтеза. 9. Способы очистки и концентрирования продукта. 31 Самым главным направлением биотехнологии является всемирная интенсификация производственных процессов, что достигается, с одной стороны, внедрением новых высокопродуктивных биологических объектов (продуцентов), а также широким применением эффективных технологических приемов (технологических режимов). Достижение указанной цели обеспечивается подбором подходящего сырья (субстрата для выращивания продуцента), разработкой наилучшей конструкции биореактора (ферментатора), оптимизацией условий культивирования продуцента, обеспечением эффективного контроля за самим технологическим процессом, а также усовершенствованием способов выделения и очистки целевого продукта. Многочисленные продукты биотехнологии получают по индивидуальным технологиям со своими биологическими агентами, сырьем, числом стадий производства и их технологическими режимами. Тем не менее, можно представить себе обобщенную типовую схему биотехнологических производств. Подготовительные стадии Биотехнологические стадии Разделение жидкости и биомассы Выделение внеклеточных продуктов Выделение внутриклеточных продуктов Очистка Концентрирование Изготовление готовой формы продукта Рис. 4. Типовая схема биотехнологического производства Схема состоит из стадий, в каждой из которых сырье претерпевает определенные технологические воздействия и последовательно превращается во все более сложные полупродукты и, наконец, в конечный продукт. Эта схема включает следующие стадии: Подготовительные стадии Биотехнологические стадии 32 Разделение жидкости и биомассы Выделение продуктов биосинтеза (внеклеточных и внутриклеточных) Очистка продукта Концентрирование продукта Изготовление готовой формы продукта Далее мы остановимся коротко на каждой стадии. Подготовительные стадии: 1. Приготовление питательной среды По составу питательные среды могут быть синтетическими и натуральными. Натуральные питательные среды для выращивания объектов биотехнологии, т.е. продуцентов тех или иных соединений, могут быть неопределенного состава и включать различные биогенные добавки (растительные, животные или микробные) - мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.п. Применяются также среды из чистых химических соединений определенного состава, так называемые синтетические. Компонентный состав сред определяется питательными потребностями продуцента. Во многих процессах используют в качестве объектов организмы, ранее называвшиеся гетеротрофами, которые в настоящее время подразделяются на: органоавтотрофы (употребляющие органические вещества как источники энергии), литогетеротрофы (использующие органические вещества как источники углерода) и органогетеротрофы (для которых органические вещества служат и источниками энергии, и источниками углерода). Питательные среды призваны обеспечивать жизнеспособность, рост и развитие соответствующих продуцентов, а также синтез целевого продукта с максимальной эффективностью. Требования к питательным средам, используемым в биотехнологии, ничем не отличаются от требований, предъявляемым к питательным средам, применяемым в микробиологии для культивирования тех или иных микроорганизмов. Для приготовления питательных сред в биотехнологии используются разнообразные субстраты, которые должны удовлетворять определенным критериям. Субстрат представляет собой сырье для получения целевого продукта и должен быть недефицитным, дешевым, по возможности легкодоступным. Растительная биомасса и в меньшей степени биомасса животных организмов представляют собой достаточно хорошо утилизируемые источники углерода для биотехнологических целей. На основе этих источников основано давно существующее производство алкоголя из зерна и сыра из молока. Растительные 33 источники могут рассматриваться как практически неистощимые. Первичная продукция фотосинтеза (рост растений за счет использования солнечной энергии) на земле обеспечивает 2х1011т вещества (биомассы) в год в пересчете на сухой вес! Наибольшая доля биомассы (около 44 %) образуется в виде древесины. Вызывает удивление факт, что продукция сельского хозяйства составляет лишь 6 % первичной продукции за счет фотосинтеза, хотя именно из этого количества получается основная часть пищи для людей и животных, а также многие необходимые материалы (например, для текстильной и бумажной промышленности). В будущем значительная часть традиционных сельскохозяйственных продуктов сможет производиться с использованием современной биотехнологии. В частности, новые биотехнологическис подходы позволят обеспечить утилизацию большого количества отходов сельского хозяйства, которые в настоящее время не находят применения, и использовать их для приготовления питательных продуктов. Биомасса сельского и лесного хозяйства в настоящее время является значительным экономическим потенциалом во многих национальных экономиках, в первую очередь в тропических и субтропических регионах. Превалирующим компонентом всех (или почти всех) биотехнологических процессов является вода. В лабораторных условиях можно легко определить специфические потребности любого конкретного организма и затем (с известной долей приближения) экстраполировать на производственный уровень. Если процесс крупномасштабный, то важным моментом будет доступность субстрата для культивирования (наличие его в требуемых количествах, стабильность, восполняемость, легкость в обращении и сохранении). Стоимость материалов является важным фактором, поскольку внедрение любого биотехнологического процесса в значительной степени зависит от его стоимости по сравнению с существующими методами производства этого же продукта. Неотъемлемым фактором является здоровье работников, особенно при манипуляциях с порошковыми материалами. Приготовление питательных сред для ферментационных процессов обычно рассматривается как мало интересная часть общей задачи, но фактически оно является краеугольным камнем, обеспечивающим успех всех последующих этапов. Среды неподходящего состава обусловят низкий уровень ростовых процессов и, следовательно, низкий уровень выхода целевого продукта. 34 Стерилизация сред. Под термином стерилизация понимают полное освобождение от вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов питательных сред, растворов, используемого в работе материала. В биотехнологическом производстве чаще всего стерилизацию осуществляют путем воздействия высоких температур. Для стерилизации жидких питательных сред применяют стерилизаторы непрерывного и периодического действия, ферментаторы. Непрерывный процесс стерилизации имеет ряд преимуществ перед периодическим методом. Основными из них являются возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды. Подготовка и стерилизация газов (обычно воздуха) необходимых для протекания биотехнологического процесса. Чаще всего подготовка воздуха заключается в очистке его от пыли и влаги, обеспечении требуемой температуры и очистки от присутствующих микроорганизмов, включая споры. Подготовка посевного материала. Для проведения микробиологического процесса или процесса культивирования изолированных клеток растений или животных необходимо подготовить посевной материал – предварительно выращенное малое по сравнению с основной стадией количество биологического агента. Подготовка биокатализатора. Для процессов биотрансформации или биокатализа необходимо предварительно подготовить биокатализатор либо фермент в свободном или закрепленном на носителе виде, либо биомассу микроорганизмов, выращенную предварительно до состояния, в котором проявляется ее ферментативная активность. 2. Биотехнологическая стадия Основной стадией в биотехнологическом производстве является собственно биотехнологическая стадия, поскольку на этой стадии происходит преобразование сырья в полуфабрикат целевого продукта и включает в себя не только синтез новых органических соединений, но и другие процессы. В биотехнологии приготовления лекарственных средств можно выделить три основных процесса:  Ферментация (культивирование) биомассы микроорганизмов,  Биотрансформацию,  Биокатализ. Ферментация (синонимы культивирование, выращивание микроорганизмов, биосинтез) - процесс, при котором происходит 35 преобразование исходного сырья в продукт с использованием биохимической деятельности микроорганизмов или изолированных клеток. Биокатализ - химические превращения вещества, протекающие с использованием биокатализаторов (ферментов или биомассы микроорганизмов) для синтеза продуктов из исходного сырья и реагентов. Биотрансформация - процесс изменения химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов. В этом процессе обычно не происходит накопления клеток микроорганизмов, а химическая структура вещества меняется незначительно. Вещество в основном готово, биотрансформация осуществляет химическую модификацию: добавляет или отнимает радикалы, гидроксильные ионы, дегидратирует и т.п. Следует отличать ферментацию от биокатализа (в котором уже полученый ранее фермент или биомасса микроорганизмов используется как катализаторы биохимического процесса, синтеза продукта из исходного сырья и реагентов) и от биотрансформации (в этом процессе также применяется биокатализатор в виде фермента или биомассы микроорганизмов, но исходное вещество по химической структуре мало отличаются от продукта биотрансформации). Далее более подробно остановимся на процессе ферментации, который наиболее часто используется при получении биотехнологических продуктов. Биотехнологические процессы принципиально отличаются от процессов химического синтеза и могут быть двух типов: периодическими и непрерывными. Специфика биотехнологических процессов состоит в том, что в них участвуют живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из клеток ферменты и их комплексы. Это оказывает довольно существенное влияние на процессы массопередачи (обмена веществ между различными фазами - перенос кислорода из газообразной фазы в жидкую) и теплообмена (перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами). Поэтому одним из важнейших компонентов биореакторов является система перемешивания, обеспечивающая однородность условий в аппарате, оптимальность массопередачи между фазами реактора, между культуральной жидкостью и клетками и т. д. Другим существенным различием между биотехнологическими и химическими процессами является необходимость создания аэробных или анаэробных условий, требуемых для культивирования соответствующего организма. Поэтому в определенных случаях необходимо подавать кислород и 36 удалять образующиеся газообразные продукты иного рода, в первую очередь двуокись углерода (СО2). Системы аэрации зачастую бывают очень сложной конструкции, поскольку они должны обеспечить баланс между расходом О2 и его поступлением в нужных количествах, учитывая тот факт, что потребность в кислороде не одинакова на различных стадиях культивирования. Крайне важным является обеспечение должного уровня теплообмена в биореакторах, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность объектов зависит в значительной степени от колебаний температуры. Поддержание температуры в определенном узком диапазоне диктуется: 1) резким снижением активности ферментов по мере падения температуры 2) необратимой инактивацией (денатурацией) макромолекул (в первую очередь белков) при ее повышении до критических значений. Температурный оптимум у каждого организма лежит в определенных пределах. Большинство биотехнологических процессов осуществляется в мезофильных условиях (30-50 °С). С одной стороны, это имеет преимущество, потому что лишь в редких случаях приходится обеспечивать повышенный подогрев реакторов. Однако, с другой стороны, возникает проблема удаления избыточного тепла, выделяющегося при интенсивном росте культивируемых клеток, поэтому биореактор должен быть оснащен эффективной системой охлаждения. Еще одной серьезной проблемой при культивировании в биореакторах является пенообразование, связанное с необходимостью аэрирования содержимого, в котором постоянно присутствуют поверхностно-активные вещества (ПАВ) - продукты распада жиров (мыла) и белки (составные компоненты субстрата, например, белки соевой и кукурузной муки и т. п.). Образующийся слой пены опять же, с одной стороны, способствует росту аэробных микроорганизмов, а с другой сокращает полезный объем реактора и способствует заражению культуры посторонней микрофлорой. Это заставляет интенсивно разрабатывать эффективные системы пеногашения. Специфическим элементом биореактора является система, обеспечивающая стерильность процесса. Стерилизация осуществляется на разных этапах процесса, как до его начала, так и при осуществлении и после окончания. Иными словами, в биотехнологическом производстве важное место отводится принципу асептики, выдвинутому еще в 60-е годы XIX в. Луи Пастером. В последнее время в биотехнологию внедряется принцип дифференцирования режимов культивирования: разные этапы одного и того же процесса осуществляются при различных условиях - температура, рН, аэрация и т.п. Естественно, это создает новые (дополнительные) требования при 37 конструировании реакторов. Таким образом, в соответствии с основными принципами реализации биотехнологических процессов современные биореакторы должны обладать следующими системами: эффективного перемешивания и гомогенизации среды выращивания; обеспечения свободной и быстрой диффузии газообразных компонентов системы (аэрирование в первую очередь); теплообмена, обеспечивающего поддержание оптимальной температуры внутри реактора и ее контролируемые изменения; пеногашения; стерилизации сред, воздуха и самой аппаратуры; контроля и регулировки процесса и его отдельных этапов. Биотехнологически ценные продукты синтезируются как в экспоненциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так называемые первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (антибиотики, пигменты и т. п. - так называемые вторичные метаболиты). Довольно широко в биотехнологии используется периодическое культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесения питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивирования в аппарат через определенные интервалы добавляют питательные вещества либо порциями, либо непрерывно "по каплям". Существует также отъемно-доливочное культивирование, когда часть содержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное количество питательной среды. Такой прием обеспечивает регулярное "омолаживание" (обновление) культуры и задерживает (отдаляет) ее переход в фазу отмирания. Этот прием иногда называется полунепрерывным культивированием. Модификацией периодического культивирования является культивирование с диализом, при котором питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность. Помимо этого, диализ удаляет из культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса концентрированную биомассу. В непрерывных процессах культивирования клетки постоянно поддерживаются в экспоненциальной фазе роста. С этой целью в биореактор непрерывно подается свежая питательная среда и обеспечивается отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов (как уже отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом 38 биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный режимы непрерывного культивирования. При хемостатном режиме культивирования саморегулируемая система возникает в силу следующих причин: если первоначальное поступление свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток, то в результате разбавления культуры снижается концентрация веществ, ограничивающих ростовые процессы и скорость роста культуры повышается; увеличивающаяся популяция начинает активнее "выедать" субстрат, что в свою очередь приводит к торможению роста культуры. Конечным итогом этих процессов является (после серии затухающих колебаний) установление равновесия между скоростью роста культуры и ее разбавлением. Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, называют хемостатом. Его конструкция предусматривает наличие: 1) приспособления для подачи питательной среды; 2) устройства, обеспечивающего отток культуральной жидкости вместе с клетками; 3) системы, контролирующей концентрацию элементов питательной среды и управляющей скоростью подачи питательной среды. Последнее является наиболее важным и наиболее сложно осуществимым устройством. Турбидостатный режим культивирования базируется на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространенным методом ее определения является измерение светорассеивания с помощью фотоэлементов. Повышение концентрации клеток и соответственно оптической плотности автоматически ускоряет проток жидкости и наоборот. По своей конструкции турбидостаты отличаются от хемостатов лишь системами контроля скорости протока. Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малым протоком, когда концентрация клеток изменяется незначительно с изменением скорости протока, что облегчает саморегулировку системы. Область использования турбидостатов - высокие скорости разбавления, обусловливающие быстрое и резкое изменение концентрации биомассы. С технической точки зрения турбидостат может применяться только для культивирования одноклеточных микроорганизмов. При длительном культивировании в турбидостате возникает довольно серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу. Однако имеются и определенные преимущества. Так, например, если засевается смешанная культура, то в турбидостате автоматически отбирается более быстро растущий вид, что может использоваться для предохранения от массивного 39 заражения посторонней микрофлорой (если, конечно, она растет медленнее) и селекции определенных форм. Непрерывное культивирование в одном биореакторе называется одностадийным. Многостадийное выращивание предусматривает последовательное или каскадное расположение биореакторов, позволяющее обеспечивать внедрение принципа дифференцированных режимов в непрерывные биотехпологические процессы, основанные на создании системы биореакторов. При разработке новых биотехнологических процессов сначала прибегают к периодическому культивированию. На непрерывный режим пока еще переведено небольшое число процессов, однако перспективность его не вызывает сомнений, несмотря на более сложные конструкции аппаратов и систем контроля. Конечно, и периодическое культивирование еще не исчерпало своих возможностей. Пока что выбор режима (периодическое или непрерывное культивирование) подчиняется (да и будет подчиняться в дальнейшем) соображениям экономической целесообразности. Периодическое культивирование включает: а) стерилизацию сред и всего оборудования; б) загрузку биореактора питательной средой; в) внесение посевного материала (клеток или спор); г) выращивание культуры (это может совпадать во времени с последующим этапом или предшествовать ему); д) синтез целевого продукта; е) отделение и очистку готового продукта. Все этапы представлены во временном аспекте; после окончания последнего этапа производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу. При этом типе культивирования рост клеточной популяции подразделяется на несколько фаз: 1) лаг-фаза, или фаза задержанного роста, при которой клетки растут медленно и адаптируются к новой среде обитания в объеме ферментатора; 2) экспоненциальная фаза, характеризующаяся интенсивным делением клеток и сбалансированностью роста всей популяции; 3) фаза замедленного роста, связанная с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма; 4) стационарная фаза, при которой прирост новых клеток количественно равняется числу погибающих; 5) фаза отмирания, характеризующаяся прогрессирующей гибелью клеток. 40 Все формы и виды ферментационных систем создаются, имея основной целью обеспечение одинаковых условий для всех компонентов содержимого реактора. В ферментаторах биокатализаторы суспендированы в жидкой среде, содержащей необходимые субстраты для обеспечения роста организмов и образования нужного целевого продукта. Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо точно придерживаться следующей генеральной линии: 1. Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранение требуемой микрофлоры. 2. Объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, т.е. чтобы не было утечки или испарения содержимого. 3. Уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней аэрирования культуры аэробных организмов. 4. Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т.п., должны постоянно контролироваться. 5. Культура при выращивании должна быть хорошо перемешиваемая. К материалам, используемым при конструировании сложных, прецизионно работающих ферментаторов, предъявляются определенные требования (порой весьма строгие): а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающимися в биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения металлами даже в следовых количествах; б) материалы должны быть нетоксичными и, чтобы даже при самой малой растворимости, они не могли бы ингибировать рост культуры; в) компоненты и материалы биореактора должны выдерживать повторную стерилизацию паром под давлением; г) перемешивающая система биореактора и места поступления и выхода материалов и продуктов должны быть легко доступными и достаточно прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механических воздействиях; д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой так, что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть прозрачными. Для оптимизации биотехнологических процессов требуется постоянный и тщательный контроль за изменяющейся картиной ферментации, что обеспечивается наличием в биореакторах соответствующих датчиков, позволяющих осуществлять избирательный анализ определенных параметров 41 ферментационного процесса. Неотъемлемой частью большинства ферментаций является та или иная степень компьютеризации. За последние десятилетия форма биореакторов существенно изменилась. Первые (исходные) ферментационные системы представляли собой неглубокие емкости, перемешивание в которых осуществлялось либо путем их встряхивания, либо посредством перемешивания содержимого вручную. На основе первичных систем в последующем были созданы аэрируемые башенные конструкции, которые в настоящее время доминируют в промышленном производстве. Системы перемешивания являются важным классификационным принципом биореакторов различного типа. Правда, поскольку биореакторы являются многопараметровыми аппаратами, они могут классифицироваться и по другим критериям: размерам, целевым назначениям (лабораторные, опытнопромышленные или пилотные, промышленные), режиму работы (периодического и непрерывного действия), условиям культивирования (аэробные и анаэробные, мезофильные и термофильные, для поверхностного и глубинного выращивания, для жидких и твердых питательных сред, газофазные). И все же система перемешивания имеет не последнее значение в классификации. По способу перемешивания и аэрации биореакторы подразделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием. Переходим теперь к стадии, следующей за биотехнологической. Разделение жидкости и биомассы Чаще всего целевой продукт находится либо в самой биомассе, либо в жидкости. В обоих случаях необходимо сначала разделить эти две фазы. В зависимости от свойств биомассы и жидкости для этих целей могут быть использованы различные процессы. Отстаивание – разделение под действием гравитационных сил. Фильтрация – пропускание суспензии через фильтрующий материал, на котором задерживаются частицы твердой фазы – биомасса. Сепарация (центрифугирование) – разделение под действием центробежных сил. Микрофильтрация, ультрафильтрация – пропускание суспензии через мембрану с малым размером пор, обеспечивающее удержание клеток микроорганизмов на мембране и получение раствора, свободного от взвешенных клеток. 42 Ультрафильтрация задерживает не только клетки, но и крупные молекулы растворенных веществ. Коагуляция – добавление в суспензию реагентов, способствующих образованию и осаждению более крупных клеточных агломератов и отделение от жидкости путем отстаивания. Флотация – захват биомассы микроорганизмов пузырьками пены и выделение ее из пенной фракции. Выделение продуктов биосинтеза Эта стадия имеет определенные отличия, связанные с тем являются продукты внеклеточными или внутриклеточными. Так, для внутриклеточных продуктов необходимо разрушить клеточную оболочку одним из методов, среди которых можно назвать следующие: Дезинтеграция клеток. Этот процесс разрушения клеточной оболочки может осуществляться физическими методами (с помощью мелющих тел, путем замораживания и продавливания, воздействием ультразвуком, методом декомпрессии — резкого сброса давления) или химическими и биотехнологическими методами. Гидролиз — разрушение клеточных оболочек под действием химических реагентов и температуры. Ферментолиз — разрушение клеточных оболочек под действием ферментов при повышенной температуре. Автолиз — разновидность ферментолиза, когда используют собственные ферменты клетки. После проведения предварительной операции разрушения клеток выделение целевого продукта осуществляется из раствора методами, которые являются общими для внеклеточных и внутриклеточных продуктов. Экстракция — переход целевого продукта из водной фазы в несмешивающуюся с водой органическую жидкость (экстрагент). Наиболее известно выделение жироподобных веществ жидкими углеводородами (типа бензина), но применяются и многие другие виды экстрагентов (хлороформ, эфир, бутилацетат) Экстракция прямо из твердой фазы (в том числе и биомассы микроорганизмов) называется экстрагированием. Осаждение — выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящего его в твердую фазу. Центрифугирование, ультрацентрифугирование используют для выделения вирусов, клеточных органелл, высокомолекулярных соединений. Адсорбция — перевод растворенного в жидкости продукта в твердую фазу путем его сорбции на специальных твердых носителях (сорбентах). 43 Ионный обмен — то же, что адсорбция, но в этом случае в твердую фазу переходят ионы (катионы или анионы), а не целиком молекула целевого продукта или примеси. Ультрафильтрация, нанофильтрация и обратный осмос применяются для выделения высокомолекулярных соединений (белков, полипептидов, полинуклеотидов). Обратный осмос и нанофильтрация позволяют отделять даже небольшие по размеру молекулы. Очистка продукта На стадии выделения продукта главная задача — отделить основную часть продукта, пусть даже и с некоторыми примесями. Получается как бы неочищенный продукт. Поэтому, когда необходимо получать биопродукты высокой кондиции, добавляют еще стадию очистки продукта. Задача этой стадии — убрать примеси, сделать продукт максимально чистым. Эта задача решается с помощью разнообразных процессов, в числе которых многие из тех, что уже были рассмотрены ранее . Это экстракция и экстрагирование, адсорбция, ионный обмен, ультрафильтрация и обратный осмос, ректификация и ферметолиз. Кроме этих процессов используют и следующие: Хроматография — процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, но не одно, а несколько, часто близких по структуре. Например, смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков. При адсорбции они и десорбируются вместе. А вот при хроматографии они выходят из сорбента как бы по очереди, что и позволяет их разделять и, значит, очищать друг от друга Диализ — процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут проходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от солей и низкомолекулярных растворимых примесей. Кристаллизация – этот процесс базируется на различной растворимости веществ при разных температурах. Медленное охлаждение позволяет формировать кристаллы из растворов целевых продуктов, причем чистота их обычно очень высока. Вся «грязь» остается в маточном растворе. Таким образом, например, получают кристаллы пенициллина. Можно даже получить еще более чистый продукт, если кристаллы pacтворить в воде или растворителе, а потом снова кристаллизовать (т е. провести процесс перекристаллизации). 44 Концентрирование продукта После очистки продукта он часто находится все-таки в pacтворе с небольшими концентрациями примесей. Дальнейшая задача — обеспечить его концентрирование. Кстати, необходимо рассмотреть, как обычно меняется концентрация целевого продукга от биотехнологической стадии до готовой формы продукта. На выходе из биотехнологической стадии суспензия обычно содержит целевого продукта примерно 0,1—1%, после стадии отделения биомассы — 0,1—2%, после стадии выделения— 1—10%, после очистки — 50—80% и, наконец, после концентрирования — 90--100%. На стадии концентрирования применяют такие процессы, как выпаривание, сушка, осаждение, кристаллизация с фильтрацией получившихся кристаллов, ультрафильтрация и гиперфильтрация или нанофильтрация, обеспечивающие как бы «отжим» растворителя из раствора. Получение готовой формы продукта На завершающей стадии производства продукт приобретает товарную форму за счет проведения процессов гранулирования (формирование гранул из порошка или прямо из раствора), дражирования, таблетирования (формирование драже, таблеток), розлива или фасовки, ампулирования (затаривания в ампулы). Очистка стоков и выбросов Таким образом, мы рассмотрели схему основного биотехнологического производства, которое на некоторых стадиях, если не на всех, имеет определенные стоки и выбросы в атмосферу. Очистка этих стоков и выбросов — специальная задача, которая обязательно должна решаться в наше экологически неблагополучное время. По существу очистка стоков — это отдельное биотехнологическое производство, имеющее свои подготовительные стадии, биотехнологическую стадию, стадию отстаивания биомассы активного ила и стадию дополнительной очистки стоков и переработки осадка. Очищенная вода иногда может быть возвращена в основное производство. Так организована, например, безотходная технология получения кормового белка из парафинов нефти. На заводе в г. Кириши после создания такой схемы удалось полностью ликвидировать технологические стоки в реку Волхов, а реально — просто заглушить трубопровод большого диаметра. И свежая вода стала забираться из реки Волхов только для компенсации потерь воды за счет испарения из градирен и с готовым продуктом (кормовой белок имеет влажность до 10%). Из рассмотренного материала следует, что биотехнологические производства включают в себя как специфические для биотехнологии стадии 45 (культивирование или ферментация), биокатализ, биотрансформация, стерилизация среды и воздуха, дезинтеграция микроорганизмов, так и множество стадий, встречающихся в химической технологии: фильтрация, сепарация, кристаллизация, ультрафильтрация и т.д. Эти стадии, конечно, имеют свою специфику в биотехнологических производствах в связи со специфическими свойствами биологического объекта, его лабильностью и вариабельностью. Поэтому задачей дальнейшего изучения курса будет рассмотрение отдельных процессов биотехнологических производств лекарственных средств. 46 Лекция 3. Объекты биотехнологии. Совершенствование биообъектов методами естественной селекции и мутагенеза План лекции 1.Структурно-функциональные особенности различных биообъектов. 2.Понятие изменчивости биообъектов. Виды изменчивости. 3. Мутагенез: спонтанный и индуцированный. Природа и механизм действия мутагенов. 4.Ступенчатый отбор – основа селекции. Ферментативный механизм регулирования биосинтеза. Литература 1. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. - Санкт-Петербург, Наука,1995 г. – 600 с. 2. Алиханян С.И. Селекция промышленных микроорганизмов. – М.: Наука. 1968 г. -392 с. 3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.- М: Мир, 2002 . Вопросы к лекции 1. Укажите основные отличия прокариот от эукариот применительно к биотехнологическому процессу. Особенности строения клеточной оболочки различных биообъектов. 2. Дайте понятие «тотипотентность», важность этого явления для биотехнологии. 3. Объясните различия между фенотипической и генотипической изменчивостью. Суть ступенчатого отбора. 4. Охарактеризуйте виды мутагенеза. Назовите основные физические и химические мутагены. Объясните механизм мутагенного действия «температурного шока», 5 аминоурацила и антибиотиков. 5.Изложите принципы ретроингибирования. 47 При выборе объекта основная задача биотехнолога – отбор (селекционирование) более продуктивных объектов с качествами, повышающих возможность их использования в промышленном производстве. К наиболее важным критериям отбора относят: - устойчивость к инфекции - рост на менее дефицитных средах - большее соответствие требованиям промышленной гигиены. Чтобы с максимальной продуктивностью использовать биообъект в процессе, необходимо знать и учитывать его структурно-функциональные особенности применительно к конкретным условиям производства. Совершенно очевидно, что подходы здесь к акариотам, прокариотам и эукариотам должны быть различными, поскольку первые, например, являются облигатными паразитами и могут развиваться лишь в живых клетках (тканях), бактерии структурно менее дифференцированы, чем эукариоты и поэтому они в большинстве своем менее требовательны к условиям обитания, чем растительные и живые организмы. Аукариоты. В биотехнологии широко используют ряд бактериофагов, вирусов растений и млекопитающих, особенно – в рДНК – биотехнологии. У них наследственный материал устроен наиболее просто и работа с ним по этой причине облегчается, хотя понятно, что она, на самом деле, «ювелирная». Необходимо подчеркнуть, что вирусы не размножаются, а репродуцируются, то есть правильно говорить не об их потомстве, а об их «копиях» (братьях и сестрах). Репродукция происходит только в живых клетках (тканях) и поэтому биотехнологические процессы, основанные на использовании вирусов, исключительно дорогостоящие. Достаточно сравнить, например, кишечную палочку и вирус гриппа. Первая растет на мясо-пептонном бульоне, второму необходимы куриные эмбрионы, чтобы проконтролировать рост кишечной палочки и увидеть ее в среде, необходим обычный «световой» микроскоп, а чтобы увидеть вирусные частицы, нужен электронный микроскоп. Вирусы прокариот, или бактериофаги, в большинстве своем имеют структурно-функциональное сходство. В частности, они содержат лишь один какой-то тип нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК в качестве генетического материала (у большинства фагов имеется двунитевая ДНК). Нуклеиновая кислота упаковывается в головку фага, преобладающее большинство фагов имеет хвостовой отросток для прикрепления к поверхности реципиентной клетки. Бактериофаги - сходны по характеру индуцируемых ими событий, развивающихся в клетке после ее заражения, и фаги являются облигатными паразитами. 48 Различия бактериофагов обусловлены тонкой структурой нуклеиновых кислот (в последовательности нуклеотидов, наличием или отсутствием липких концов, линейной или кольцевидной замкнутости и т.д.), типами молекулярной симметрии капсидов, деталями строения хвостовой части, специфичностью действия в отношении чувствительных клеток. Известны три состояния, в которых могут находится недефектные фаги и три типа влияния фаговой инфекции на судьбу зараженной клетки. К числу состояний относят: свободное состояние, вегетацию и состояния профага (для так называемых умеренных фагов). К числу основного состояния относят гибель зараженной клетки (фаги при этом называют частично вирулентными), переход клетки, несущей умеренный фаг (профаг), на путь лизогенного развития. При третьем типе фаговой инфекции не наблюдается каких-либо заметных отклонений в характере поведения зараженных клеток – гибели их не происходит, фаги при этом могут высвобождаться из клеток или постоянно реплицироваться, находясь внутри их, слегка замедляя скорость размножения клеток. Учитывая сказанное, следует подчеркнуть, что бактериофаги имеют большое значение в биотехнологии еще и потому, что они могут выступать ощутимыми вредителями в микробиологических производствах, базирующихся на эксплуатации прокариотических организмов. Клетки прокариот Почти во всех таксономических группах прокариот имеются представители, с успехом использующихся в соответствующих биотехнологических процессах как сапрофитные, так и патогенные виды. Для сравнения можно указать на лактобактерин и туберкулезные микобактерии. Первые используются для приготовления молочнокислых продуктов и в силосовании кормов, вторые – для приготовления вакцины ВСG и туберкулина (диагностическое средство при туберкулезе). Из археобактерий большое имеют метаногенные бактерии – продуценты метана. Пневмоккки используются для изготовления полисахаридных вакцин, применяемых для профилактики и лечения заболеваний, вызванных различными Streptococucus pneumoniae. В эволюционном плане наиболее древними среди клеток прокариот являются археобактерии, которые заметно отличаются от других прокариот по химическому составу клеточной стенки и клеточной мембраны, последовательностями нуклеотидов в рибосомных нуклеиновых кислотах или рРНК. Так, в клеточной стенке у них отсутствует типичный пептидогликан – муреин. У метанококков клеточная стенка формируется из белка, у метаносарцин - из нейтральных углеводов, урановых кислот и аминосахаров, у метаноспирил имеется полипептидный чехол. Эти особенности объясняют 49 неэффективность пенициллина, цефалоспорина и Д-циклосерина против этих микроорганизмов, так как для данных антибиотиков отсутствуют мишени в клетках археобактерий. Все остальные прокариоты, кроме археобактерий, относятся к бактериям. Их подразделяют на две группы-фототрофные и хемотрофные. Фототрофы используют кванты солнечного света, тогда как хемотрофы – энергию химических связей в различных химических соединениях. Среди фототрофов различают оксигенные цианобактерии, в процессе жизнедеятельности которых выделяется молекулярный кислород, и аноксигенные пурпурные и зеленые бактерии, не выделяющие кислорода. Цианобактерии являются важными поставщиками кислорода в атмосферу (см. реакцию 1), а из атмосферы они поглощают (фиксируют) молекулярный азот В качестве доноров электронов в биохимическом цикле аноксигенных бактерий выступают сероводород, газообразный водород и изопропанол (см. реакцию 2, 2а, 2б, 2в). Это играет важную роль в переработке отходов при решении различных экологических проблем. 1. 6H2O + 6CO2 hs (СН2О)6 + 6О2 цианобактерии 2. 2H2S + CO2 hs CH2O + H2O + 2S пурпурные, серные и зеленые серные бактерии Сера затем окисляется до сульфата. Тогда суммарная реакция будет следующей: 2а) H2S + 2CO2 + 2H2O 2б) 2H2 + CO2 hv (CH2O)2 + H2SO4 hv CH2O + H2O пурпурные несерные и зеленые несерные бактерии 2в) 2CH3CH(CH)CH3 + CO2 hv CH2O 2(CH3)2CO + H2O изопропанол ацетон пурпурные несерные бактерии 50 Хемотрофные бактерии могут образовывать (или не образуют) эндоспоры. Клетки их весьма разнообразны по морфологии: прямые, прогнутые, палочковидные, круглые, овальные, нитевидные и др. Важным параметром, характеризующим большинство прокариотических клеток, является скорость их размножения, измеряемая минутами (в среднем от 8-10 мин. до 30-40 мин.). Это особенно важно в тех случаях, когда биомасса клеток является целевым продуктом, или, когда количество образующегося метаболита находится в прямопропорциональной зависимости от количества нарастающих клеток за конкретный временной интервал. Все обменные процессы в развивающихся прокариотических клетках осуществляются с участием клеточной мембраны. Через мембрану поступают внутрь клетки питательные вещества, через нее же секретируются определенные продукты в окружающую среду, мембраны участвуют в регуляторных процессах и энергообеспечении клеток. Из метаболических процессов нельзя исключать и клеточную стенку прокариот, хотя главная ее функция – поддержание формы клетки и защитная роль. Клеточная стенка и мембрана вместе формируют оболочку. В эволюционно-биохимическом классе клеточная стенка у прокариот претерпела структурные изменения в следующем направлении: археобактерии – грамположительные бактерии – грамотрицательные бактерии. У археобактерий нет типичного пептидогликана, хотя задатки к нему имеются. Пептидогликан у грамположительных бактерий многослоен, тогда как у грамотрицательных бактерий он - однослоен. Лишая клетки прокариот клеточной стенки, их относительно легко удается получать в виде протопластов или сферопластов для использования в клеточно-инженерных работах. В клеточной стенке грамположительных бактерий сосредоточен пептидогликан – муреин , имеются тейхоевые кислоты, белки. У стрептококков группы А в диффузно-распределенном виде в наружном слое клеточной стенки находятся также М- протеин, являющийся фактором вирулентности этих микробов. М- протеин может быть гидролизован с помощью трипсина без нарушения жизнеспособности клеток. У грамотрицательных бактерий четко выделена трехслойность клеточной стенки: липополисахаридный слой (0 - антиген), наружный слой (нередко обозначенный как «внешняя мембрана»), состоящий из фосфолипидов, и подлежащий липопротеиновый слой. Липополисахарид занимает пограничное положение между внешней средой и фосфолипидами и проявляет свойства эндотоксина. 51 Липополисахариды получают в производственных условиях в качестве средств, обладающих различными биологическими свойствами: токсическими (связанными с липидом А в липополисахариде), пирогенными, митогенными, стимуляторами развития клеток костного мозга, активаторами фактора VII свертывания крови в тромбоцитах. Липополисахарид в концентрации 1 х 10-12 вызывает свертывание лизата амебоцитов крабов-мечехвостов Limulus poliphemus. Эта реакция широко используется при выявлении липополисахарида в каких-либо субстратах, лекарственных средствах и др. При этом взаимодействие между эндотоксином и лизатом амебоцитов протекает по следующей схеме: эндотоксин LaL = профермент активированный(-е) фермент (ы) коагулоген Активированные ферменты белковые агрегаты помутнение определение визуальная вязкости оценка определение определение спектро- светорассеяния белка фотометрия (тест на гелеобразование) методы оценки Рис.5 Механизм действия Lal- теста Среди протеинов клеточной стенки грамотрицательных бактерий обнаруживаются многие ферменты (аспарагиназы, фосфатазы, эндонуклеазы и др.), которые имеют большое практическое значение. Отдельные прокариоты образуют внутриклеточные споры (эндоспоры). Аэробные из них представлены видами родов Bacillus и Sporosarcina, микроаэрофилы – видом Sporolаctobacillus inulinus, анаэробные – видами родов Clostuidium. Эндоспоры – сложные образования, формирование которых диктуется неблагоприятными условиями. В белках оболочек отмечается повышенное количество гидрофобных аминокислот и цистеина. В связи со спорообразованием культуры ряда бацилл и клостридий образуют белки, 52 обладающие высокой биологической активностью (циклопептидные антибиотики, эндобактерин). С другой стороны, спорообразующие прокариоты могут быть вредителями биотехнологических процессов. Споры обладают высокой устойчивостью к различным внешним факторам, хорошо переносят их воздействия и потому могут попасть в ферментационные среды или в готовый продукт при несоблюдении правил асептики, антисептики и стерилизации. Клетки эукариот. В биотехнологии используют эукариотические клетки различного происхождения. Источниками их являются виды, относящиеся к царствам Mycota, Plantiae и Animalia. К настоящему времени ассортимент первых более широкий, чем ассортимент растительных и животных клеток, эксплуатируемых в производстве. Клетки грибов и растений обладают прочной клеточной стенкой, которая отсутствует у клеток животного происхождения. При этом маркерной структурой для большинства грибов становится хинин, для большинства растений – целлюлоза. Помимо этого, в составе клеточной стенки растений входят и другие углеводные полимеры – гемицеллюлозы, пектины. К гемицеллюлозам относятся полисахариды (гликоны), входящие в состав клеточных стенок растительных тканей и способные растворяться в разбавленных растворах щелочей и гидролизоваться разбавленными растворами кислот в мягких условиях. К ним относятся ксиланы , маннаны, фруктаны, которые имеют широкое применение в народном хозяйстве. Пектины – это полигалактурониды, входящие в состав клеточных стенок и сока всех высших и низших растений. Галактуроновая кислота - главный мономер пектинов (до 92%). Пектины широко используются в пищевой промышленности, в последние годы установлена их высокая биологическая активность. При характеристике растительной клетки необходимо выделить лигнинполимер полифенольной природы, образующийся только у растений. Его содержание у некоторых видов может достигать 38% , с ним связано одревеснение растений (лигнификация). По распространенности среди природных биополимеров он уступает место лишь гликанам. Лигнин относится к неразветвленным полимерам, состоящим преимущественно из остатков замещенных фенолспиртов: nгидроксикоричного, 3,5 – диметокси – 4 гидроксикоричного , 3 – метоксигидрокоричного. 53 CH=CH – CH2OH CH3O CH=CH – CH2OH OCH3 CH=CH – CH2OH OCH3 ОH n – гидро спирт ОH ОH 3-4 диметоксин 3- метоксигидро 4 – гидрокси спирт спирт В древесине он связан с гликанами и в медицине используется в качестве энтеросорбента. Клеточные стенки растений могут покрываться снаружи такими липидами, как воск и кутин, которые выполняют главным образом защитную роль. Животные клетки, в отличие от растительных, лишены клеточных стенок. Лишь отдельные простейшие способны в определенных условиях образовывать так называемые цисты (дизентерийная амеба, кишечная балантидия и др.), которые покрыты одно-трехслойной, преимущественно белковой природы, оболочкой. Для грибов и растений типичным является образование тканей. Ткань – это большая группа клеток единого происхождения, обладающих сходными генетические и структурно-функциональные свойствами. Среди тканей растений наибольший интерес в качестве объектов биотехнологии представляют образовательные ткани, или меристемы (от греч. meristos – делимый). Они состоят из активно метаболизирующих клеток, способных делиться и образовывать новые клетки. У грибов настоящие меристемы не развиты, деление клеток сосредоточено на верхушках гиф. Клетки меристемы тотипотентны (от лат. totum – все, целое: patentium – способность, потенциал), т.е. они полностью реализуют свой потенциал развития с образованием целого организма. В биотехнологии особое значение приобрела верхушечная меристема, так как она всегда остается свободной (здоровой) от фитопатогенных микроорганизмов, например, вирусов (даже в тех случаях, когда все растение поражено патогеном). Культивирование in vitro верхушечных меристемных клеток от больного растения в стерильных 54 условиях завершается получением здорового растения – посадочного материала. Известны еще, так называемые раневые меристемы, образующиеся в местах повреждения органов и тканей растений. В таких поврежденных участках образуются однородные паренхимные клетки, покрывающие повреждения. Такие ткани называются каллусами (лат. сallus - мозоль). Каллусные ткани широко культивируют на питательных средах с целью получения посадочного материала, а так же ценных метаболитов. Клетки млекопитающих существенно различаются по составу, поскольку они достаточно сложны по набору органелл, а кроме того, специализированы в соответствии с принадлежностью к органам и системам. Хотя клетки животных выращивать сложнее, к настоящему времени разработаны методические подходы, которые позволяют успешно культивировать in vitro клетки и ткани животного происхождения. Это имеет большое значение в биотехнологии. Особенности объектов, применяемых в биотехнологии, определяет возможность их изменчивости. Под изменчивостью понимают возможность возникновения организмов с новыми свойствами (признаками) среди существующего разнообразия живых организмов. Различают 2 основных вида изменчивости: - модификации, - мутации. Длительная модификация присущи только клеточным формам. При этом генотип клеток остается неизменным, а измененный фенотип, проявляющийся в формировании какого-либо устойчивого метаболического цикла, кажущегося независимым от внешних условий, выступают мерилом внутриклеточной среды. При многократных пересевах происходит как бы разбавление цитоплазмы в ряду последующих поколений клеток и исходные метаболиты материнской клетки достигают порогового предела, когда указанный выше метаболитический цикл исчезает. В других случаях такой же эффект наблюдается при создании окружающих условий, не поддерживающих один из типов метаболизма и клетки из состояния длительно модификации в исходное с присущей виду комбинацией признаков (фенотип). Таким образом, при возникающих или исчезающих модификациях наблюдаются массовые однонаправленные изменения клеток однородного генотипа, находящихся в среде обитания. 55 С длительными модификациями связаны 2 подхода, используемых в селекционной работе: (select) 1. Отбор естественных штаммов, обладающих ценными признаками, проявляющихся в конкретных условиях существования. При размножении такой культуры наступает популяционное давление, когда наиболее приспособленная форма вытесняет исходную в популяции. Этот прием селекции носит название естественного отбора. 2. Искусственный отбор биообъектов с полезными для человека признаками, возникающими на основе естественной изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для объекта. При этом трудно создать условия выращивания культуры, в которых относительно легко удавалось бы выделять нужные варианты. Необходимо проверить большое количество клонов и субклонов и, если вариации между ними по контролируемому признаку невелики, то успех выборки оказывается маловероятным или небольшим. Гораздо выше эффективность селекции биообъектов при использовании такого вида изменчивости как мутации. При мутациях изменяется генотип или наследственная конституция клетки (организма). Мутации могут быть неконтролируемыми (спонтанными) и контролируемыми (индуцированными). Первая происходит с частотой 1:10-5 – 1*10-7 на одну генерацию для разных организмов. Это значит, что за одну генерацию ненаправленно изменяется одна клетка из 106 клеток. Частота индуцированных мутаций возрастает в десятки - тысячи раз. Факторы, вызывающие мутации, относят к разряду физических, химических или биологических, и называют мутагенами. Мутагены по действию подразделяют на два класса – прямого, действующие непосредственно на нуклеиновые кислоты и непрямого, или опосредованного действия, оказывающие влияние на первичные метаболиты или белки. В качестве физических мутагенов могут быть использованы повышенная или пониженная температура, различного рода излучения (ультрафиолетовое, ионизирующее), ультразвук. При температурном воздействии на клетки более нестабильными в составе ДНК оказываются пуриновые основания, вследствие чего могут возникнуть апуриновые сайты (выпадение пуринов из ДНК). Так называемый «температурный шок» приводит к существенным изменениям в клетках – возрастает частота летальных и видимых мутаций. При этом летальные мутации, получаемые при длительном воздействии умеренных температур, 56 мало чем отличаются от мутаций, возникающих после температурного тока. Температурно-чувствительные мутанты являются важным инструментом при изучении клеток различных органов. Излучения с длиной волны 260 нм (ультрафиолетовые УФЛ) поглощаются ДНК, при этом разрываются водородные связи между комплементарными нитями ДНК. Расположенные рядом тиминовые основания образуют ковалентно связанные димеры, останавливающие репликацию ДНК. Ядро теряет способность к делению и клетка погибает. В настоящее время установлено, что УФЛ действует на разные гены по разному и поэтому сущность такого мутагенеза остается до конца не разрешенной. Кроме того, известны организмы естественно устойчивые к УФЛ, например Salmоnella typhimurium. В отличие от УФЛ, излучения типа быстрых электронов, позитронов, протонов, -частиц, нейтронов, рентгеновских и -лучей относятся к ионизирующим. Их первичный биологический эффект связан с ионизацией в тканях высших эукариот, а вторичный эффект является следствием теплового возбуждения молекул. Косвенный эффект излучений проявляется в возникновении из клеточной воды свободных радикалов, вступающих в реакции с кислородом клеточных структур (образование перекисей), с органическими молекулами или взаимодействующих между собой. Происходит окисление или передача энергии молекулам ДНК (РНК). Свободно-радикальные процессы могут завершиться дезаминированием и дегидроксилированием оснований, разрывом N-гликозидных связей между основаниями и пептозой, деструкцией пиримидинов, окислением пептозы и высвобождением пирофосфата. Вот почему излучения могут индуцировать самые разнообразные мутации. Применительно к ультразвуковым колебаниям (акустические колебания частотой свыше 2х10 4 герц) считают, что под их влиянием наблюдаются последовательные изменения, вначале в пиримидинах, а затем – в пуринах. Становление и развитие работ по химическому мутагенезу связано с исследованиями отечественных генетиков: В.В. Сахарова (1933), М.Е. Лобашова (1934), И.А. Рапопорта (1938). Последний в 1966 году предложил термин « супермутагены» для веществ, обладающих исключительно высокой мутагенностью, и заметно не влияющие при этом на жизнеспособность клеток и организмов. К химическим мутагенам относят: - ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот (в основном, производные пуринов и пиримидинов); - аналоги азотистых оснований, в том числе и кофеин; 57 - алкилирующие агенты (фенол, формальдегид, иприт, нитрозоединения); - группа окислителей (азотистая кислота, гидроксиламин, диоксид водорода); - удлинители сетей ДНК – акридиновые красители; - ингибиторы синтеза РНК и оказывающие комплексное действие на ДНК (антибиотики – актиномицеты и стрептомицины). На примере 5-аминоурацила, аналога урацила, можно показать путь возникновения 50% потомков после двух циклов репликации мутировавшей клетки под действием мутагена. 5-аминоурацил по химическому строению близок к тимину и поэтому легко комплексируется с аденином. Кето-форма 5-аминоурацила более стабильна, чем его енольная форма, однако последняя образуется и существует какое-то время в течение, которого он может спариваться с гуанином – это так называемая «ошибка включения». Тогда очевидно, что вместо пары Г-Ц (гуанин – цитозин) появляется пара А-Т ( аденин-тимин) или А- 5аминоУ (аденин – 5 аминоурацил). OH H 2N O N N N HN O H 5-аминоурацил (енольная форма) HN N H H гуанин Рис. 6. Механизм мутагенного действия 5- аминоурацила N H 58 В основе алкилирования нуклеиновых кислот лежат реакции депуринизации с разрывом сахарно-фосфатной цепи в ДНК, взаимодействия алкилирующих агентов с адениловой, цитидиловой и тимидиловой кислотами с последующей утратой способности алкилированных аденина, цитозина и тиамина спариваться с комплеметарными основаниями и взаимодействия в фосфатными группами и нуклеофильными группами ДНК. Так, например, в случае удаления или добавления гуанина из ДНК под влиянием какого-либо алкилирующего агента могут образовываться различные варианты изменения: - восстановление пары Г Ц , ее выпадение, перекрестная замена Г Ц на Т=А или на Ц Г, простая замена Г Ц на А=Т. К группе алкилирующих агентов относятся большинство мутагенов, вызывающих до 24 % летальных мутаций. Антибиотики, как мутагены, обладают различными механизмами действия. Так, например, митоцин С подобен алкилирующим агентам. Он расщепляет двойную спираль ДНК за счет образования перекрестных связей. Антибиотики из группы актиномицинов (дактинолицин) ингибируют ДНК-зависимый синтез РНК. Гликопептидные антибиотики (блеомицины) ингибируют синтез ДНК и клеточный митоз. Аминогликозидные антибиотики ( гигромицин В, стрептомицин) являются непрямыми мутагенами. Они нарушают белковый синтез и предотвращают связывание отдельных тРНК. При этом неправильно считываются пиримидиновые основания. Мутагенным действием обладают ряд алкалоидов высших растений из родов гелиотроповых и крестовниковых, а также некоторые синтетические лекарственные вещества (изониазид, хлорпромазид, нитрофураны и т.д.). К биологическим мутагенам относятся вирусы (фаги), живые вакцины, некоторые биотоксины, образуемые грибами, простейшими и гельминтами. Так изменения в хромосомах вызывают цитомегаловирус, вирус простого герпеса, герпетиформный вирус, вирус Сендай, и т.д. Из грибных токсиновмутагенов – афлатоксин В. Фагоустойчивые мутанты актиномицетов и лактобактерий представляют интерес для соответствующих производств (например, антибиотиков и молочнокислых продуктов). Мутагены различных классов используют в работе с биообъектами. При этом стремятся получить штаммы либо с какими-то маркерными признаками, важными для расшифровки механизмов мутагенеза, либо штаммы – суперпродуценты БАВ, существенно увеличивающие выход конечного продукта в сравнении с контролем. 59 Метод искусственного отбора форм с применением мутагенов носит название ступенчатой селекции. С помощью мутагенов увеличивают изменчивость тест-культур, а среди последних отбирают наиболее перспективные. Такой подход, как правило, используют многократно (ступенчато), добиваясь существенного возрастания контролируемого показателя (активности, продуктивности и др). В качестве примера можно указать на успехи с селекцией мутантов пеницилла, исходный штамм которого выделенный из воздуха А.Флемингом в 1928 году, продуцировал лишь 50 единиц антибиотики пенициллина в 1 мл культурной жидкости. Вторая мировая война 1939-1945 гг. вынудила ученых вернуться к этому виду гриба и заняться генетико-селекционной работой с ним. В 1951 г. путем рассева естественной популяции клеток, выросших в глубинных условиях культивирования Penicillium chrysogenum, был выделен штамм № 1951 с активностью 100 ед/мл. Колония этого штамма стала родоначальницей всех производственных штаммов в различных странах мира. Используя селекцию и комбинированное воздействие различными мутагенами (преимущество – УФЛ и алкилирующими агентами) уже в начале 60-х годов удалось передать в производство штамм, образующий пенициллин в количестве 5000 ЕА и более в 1 мл культурной жидкости. В настоящее время используются штаммы, продуцирующие десятки тысяч единиц антибиотика в 1 мл среды. Таким образом, суть селекции – направленный отбор мутантов, т.е. организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение вследствие структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. При ступенчатом отборе на конечном этапе из популяции микроорганизмов отбираются наиболее высокоэффективные штаммы. Достижения молекулярной генетики позволили ввести в практику целенаправленные методы отбора продуцентов. Один из них – по их устойчивости к структурным аналогам целевого продукта. Метод основан на регуляции ферментов по принципу обратной связи с конечным продуктом биосинтетического пути (В.Г. Дебабов, 1984 г.). Повышение концентрации метаболита ингибирует активность фермента, участвующего в синтезе метаболита или репрессирует синтез этого фермента. 60 синтез Еа репрессия ингибирование ЕА А ЕВ В ЕС С ЕД Д Рис.7. Ретроингибирование конечным продуктом биосинтетического пути. А; В; С; Д – продукты реакции, контролируемые ферментами ЕА, ЕВ, ЕС, ЕД. В этих условиях выживают лишь некоторые клетки. Это мутанты с нарушенной регуляцией активности и синтеза ферментов. Интерес представляют те мутанты, у которых 1. Фермент ЕА сохранил функциональную активность, но потерял чувствительность к ингибирующему действию конечного продукта или его аналога. 2. Синтез фермента ЕА устойчив к избытку продукта или его аналога. Мутации подобного типа ведут к появлению сверхпродуцентов, синтезирующих целевой метаболит в аномально высоких концентрациях. Способ регуляции активности ферментов по принципу обратной связи является наиболее гибким и широко распространенным способом контроля метаболизма в клетке. 61 Лекция 4. Создание новых биообъектов методами генетической инженерии План лекции 1.Генетическая инженерия. Сущность и основные определения. 2.Особенности планирования генно-инженерных работ. Техника безопасности. 3.Основные этапы получения генно-измененных клеток. 4.Биотехнологические методы, используемые при получении инсулина. Литература 1. Биохимия : учебник для вузов / П.Комов, В.Н. Шведова. М.,2004 С.449-461, 494-507. 2. Елинов Н.П. Основы биотехнологии - СПб, 1995 г. – 600 с. 3. Рыбчин В.И. Основы генетической инженерии - СПб, 1999.- 522 с. 4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.- М: Мир, 2002 -589 с. Вопросы к лекции: 1.Охарактеризуйте основные составляющие генетической инженерии. 2.Назовите основные этапы метода рекомбинации ДНК in vitro. Поясните механизм экспрессии генов. 3.Дайте понятие термину «вектор-носитель». Укажите типы, характеристики, достоинства и недостатки. 4.Расскажите о роли внехромосомных носителей ДНК. 5.Дайте сравнительную характеристику получения нативного и генноинженерного инсулина. 62 Генетическая инженерия – это методы получения рекомбинантных ДНК, объединяющих последовательности разного происхождения (методы рДНК – технологии). Генетическую инженерию подразделяют на генную инженерию, геномную инженерию и хромосомную инженерию. Сущность генной инженерии состоит в целенаправленном использовании перестроек естественного генома, осуществляемых in vivo или in vitro, для изменения генетических характеристик известных вирусов и клеток. В качестве примеров генной инженерии in vivo можно назвать транслокацию (перемещение) в вирусные геномы некоторых клеточных генов, придающих вирусам свойство онкогенности. Примером генной инженерии in vitro является создание молекулярных химер из фрагментов ДНК разного происхождения, включение их в реципиентные клетки E. coli, B.subtilis и др. с последующим культивированием этих организмов в целях получения необходимых белковых продуктов (пептидных гормонов, ферментов и т.д.). Сущность геномной инженерии заключается в целенаправленной глубокой перестройке генома акариот, прокариот или эукариот, вплоть до создания новых видов. При геномной инженерии добиваются внесения большого количества дополнительной генетической информации и в результате получают гибридный организм, отличающийся от исходного по многим признакам. Гибриды оказываются жизнеспособными лишь в тех случаях, когда они содержат все безусловно необходимые (облигатные) гены, когда у них налажены и согласованы регуляторные связи между совмещенными генами и когда имеется структурное соответствие между продуктами матричного синтеза (белками). При геномной инженерии возможно получение половых (слияние гамет) или соматических гибридов. Половые гибриды получают либо в естественных, либо в экспериментальных условиях. Соматические гибриды у клеточных форм способны формироваться лишь в искусственных условиях. Примером естественной (природной) геномной инженерии является рекомбинация геномов вирусов гриппа, относящихся к типу А. Впервые соматические гибриды клеток млекопитающих были использованы при получении гибридом, продуцирующих моноклональные антитела. В организме антитела образуются плазматическими клетками, возникающими в результате дифференциации В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию. Если В-лимфоцит перерождается и трансформируется in vivo в злокачественную опухоль, то такая опухоль- 63 миелома синтезирует большое количество антител, специфичность которых неизвестна. Однако возникают и такие варианты миеломных клеток, в которых отсутствует экспрессия генов в отношении синтеза тяжелых и легких целей иммуноглобулинов. Миеломные клетки могут поддерживаться в культуре неопределенно долго. Совместив способности мнелом к длительному культивированию в условиях in vitro, а способность В-клеток продуцировать моноклональные антитела, Келер и Мильштейн получили гибрид, секретирующий мноноклональные антитела. Для этих целей они использовали мышиные клетки миеломы и нормальные В-клетки селезенки мыши, иммунизированной заданным антителом (схема представлена на рис.7). Подобные гибридные широко структуры используются теперь для получения различного рода моноклональных антител, применяемых в диагностических, лечебных и других целях. 64 АС 1 2 3 4 5 6 7 мышь 9 Ig ас 8 10 11 стабилиза ция Ig кж 10→11→12 12 Рис. 8 Схема получения моноклональных антител с помощью гибридомной техники (Н.П.Елинов,1995 г) АС – агент слияния клетки, 1- В-клетки из селезенки иммунной мыши,2культура миеломных клеток мыши, 3 –гибридизация, 4-гибридомы, 5 –селекция и клонирование гибридом, 6 –гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 введение гибридом, образующих моноклональные антитела в организм сингенной мыши, 8 –клетки гибридомы, образующие моноклональные вещества, культивируемые в виде культуры ткани, 9выращивание гибридомных клеток, образующих моноклональные антитела в ферментаторе., Ig кж –иммуноглобулины культуральной жидкости, Ig ас – 65 иммуноглобулины в асцитической жидкости, 10- высаливание Ig–ов аммония сульфатом, 11- стандартизация Ig–ов, 12- лиофилизация Ig–ов. Материальной базой генетической инженерии послужило расшифровка двоичной спирали ДНК, осуществленная Дж.Уотсоном и Ф.Криком в 1953 году. При планировании генно-инженерных работ необходимо учитывать следующие особенности структуры и функции генотипа различных видов организмов. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ГЕНОТИПА 1. Геном акариот и прокариот, а также митохондрий и пластид эукариот является компактной совокупностью генов с небольшим содержанием структурных повторов, что характеризует его экономичность. Он кольцевидно замкнут (непрерывен), интервалы между генами минимальны. 2. Ядерные структуры прокариот состоят из нуклеотидов, включающих в себя участок бактериальной клетки – кольцевидную хромосому, содержащую до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий. Во многих бактериях обнаружены внехромосомные молекулы ДНК, представленные плазмидами, транспозонами и инсерционными (вставочными) последовательностями. 3. Генетический аппарат в клетках эукариот организован в форме нескольких линейных хромосом, в которых ДНК прочно связана с белками – гистонами, обеспечивающими упаковку и упорядочение ДНК в виде структурных единиц – нуклеосом. 4. Гены эукариот, нередко располагаясь в хромосомной ДНК рядом, образуют мультигенные семейства, состоящие из небольшого числа родственных последовательностей. Например, гены, кодирующие РНК у млекопитающих, обнаруживаются в геноме сотнями своих копий, сгруппированных в зоны, а это свидетельствует об избыточности генетических программ у высших организмов (создание «повышенной прочности»). 5. Представители микробного, растительного и животного мира имеют в составе генетического материала одни и те же строительные блоки, то есть их «кодовый словарь» в основном однотипен, или универсален, и функционирует преимущественно в соответствии с центральными постулатами молекулярной генетики, сформулированным Ф. Криком в 1967г. Генетическая информация переносится по схеме: ДНК РНК Белок 6. Каждый ген проявляет себя (экспрессируется) путем образования или биосинтеза РНК (транскрипция гена) с последующим переводом (трансляции) информации в специфическую полипептидную цепь, фактически 66 являющуюся продуктом гена. Ген и его продукт комплементарны, то есть последовательность триплетов в гене точно соответствует последовательности аминокислот в белке. 7. Ген кодирует строение белковой молекулы и регулирует процесс ее синтеза. Меры безопасности работы с генно-инженерными штаммами. Генетическая инженерия с момента зарождения привлекала внимание ученых и широких кругов общественности потенциальной опасностью некоторых исследований. Это опасение было высказано в 1974 году, вскоре после первых успешных экспериментов по получению рекомбинантных молекул ДНК методом in vitro. Группа известных молекулярных биологов во главе с П.Бергом призвала ученых к ограничению проведения ряда генноинженерных экспериментов. Характер высказанных опасений был двоякого рода. Прежде всего указывалось на реальную возможность «утечки» клеток с рекомбинантными молекулами ДНК за пределы лаборатории или промышленных производств и, следовательно, угрозы внесения в организм человека или животных вредных чужеродных, либо «собственных» продуктов (например, гормонов), но не в неконтролируемых концентрациях. А это, естественно, может привести к негативным последствиям, которые трудно предсказать. Во-вторых, отсутствие достаточных знаний о структуре и функциях генов, находящихся в клонируемом фрагменте ДНК, может привести к тому, что при внесении их в реципиентные клетки они начнут синтезировать не только желаемое вещество, но и какие-либо опасные продукты (токсины, продукты онкогенов и т.п.). Правила были установлены в последующие годы в Англии, СССР, США, Франции и других странах. Неоднократно они пересматривались в сторону смягчения, так как постепенно накапливающиеся данные свидетельствовали о неоправданной их строгости, особенно в отношении работ с традиционными лабораторными штаммами. В настоящее время в России работы генно- инженерного плана регулируются Федеральным законом, принятым в 1996 году. Эти работы подразделяются на 2 типа – ведущиеся в «закрытых» или «открытых» системах. В закрытых системах работы ведутся таким образом, чтобы существовал химический, биологический или физический барьер между генно-инженерными организмами и окружающей средой. В открытых же системах такой контакт осуществляется (например, культивирование генно-инженерных овощей). Работы в закрытых системах в зависимости от степени риска подразделяются на четыре категории. 67 1. категория. Работа не представляет опасности здоровью человека. Меры безопасности сравнимы с теми, которые установлены при работе с непатогенными микроорганизмами. 2. категория. Работа представляет незначительную опасность здоровью человека. Меры безопасности сравнимы с теми, которые установлены при работе с микроорганизмами, потенциально патогенными лишь при определенных обстоятельствах. 3. категория. Работа представляет умеренный риск здоровью человека. Меры безопасности сравнимы с теми, которые установлены при работе с микроорганизмами, потенциально способными к передаче инфекционных заболеваний. 4 категория. Работа представляет значительную опасность здоровью человека. Меры безопасности сравнимы с мерами при работе с патогенами, вызывающими особо опасные болезни. На практике меры, обеспечивающие безопасность опытов с рекомбинантными молекулами ДНК, включают приемы, обычные в микробиологических исследованиях, а также меры по физической и биологической защите. Под мерами физической защиты понимается создание и использование специальных устройств, предотвращающих распространение биологических агентов в окружающем пространстве. Эти меры по своему характеру сближаются с мерами, действующими уже многие годы в медицинских, микробиологических и вирусологических лабораториях при работе с опасными микроорганизмами. Минимальный (Ф1) уровень физической защиты (работа без специального защитного оборудования) применяется в случае манипуляций с безопасными микроорганизмами. Низкий (Ф2) уровень физической защиты предусматривает более строгую изоляцию биоматериалов путем устройства боксов с отрицательным давлением воздуха и надежной герметизацией сосудов, содержащих рекомбинантные ДНК. Средний (Ф3) уровень физической защиты необходим при экспериментах с опасными объектами. Он достигается герметизацией всей лаборатории, но без ее изоляции от других помещений. При работе с микроорганизмами, особо опасными для человека, животных или растений, должен быть обеспечен высокий (Ф4) уровень физической защиты, для чего помимо выполнения требований уровня Ф3, лаборатории полностью изолируют. Для биологической защиты в зависимости от степени потенциальной опасности создаваемых рекомбинантных ДНК предусмотрены три уровня. Уровень Б1 (наиболее слабая защита) обеспечивается при использовании клеток E.coli К-12 и векторов, полученных на основе неконъюгативных 68 плазмид и бактериофагов, а также других клеток и векторов, обладающих сходной степенью безопасности. Уровень Б2 обеспечивается применением таких векторов и клеток, у которых вероятность заражения составляет менее 10-8. Уровень Б3 предусматривает использование систем вектор-клетка типа Б2, но испытанных на животных, включая и приматов, или апробированных в естественных экологических условиях. Выбор уровня физической и биологической защиты определяется видовой принадлежностью клонируемой ДНК, ее длиной, степенью очистки, генетическими характеристиками и т.п. Более подробно разберем методы генной инженерии как хорошо отработанные и в настоящее время широко используемые в производстве лекарственных препаратов. Методы генной инженерии основаны на технологии рекомбинатных ДНК. Согласно определению ЮНЕСКО, рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные in vitro путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами ДНК, способными реплицироваться в клетке. Основу экспериментов составляет встраивание природной или чужеродной ДНК в вектор, который предоставляет собой бактериальную плазмиду или геном вируса. Затем с помощью вектора рекомбинантную ДНК вводят в клетку, где она реплицируется. Клетка, содержащая такую ДНК, размножается, образуя клон трансформированных клеток. Таким образом, метод рекомбинации ДНК in vitro состоит из следующих этапов: - выделение ДНК из разных видов живых организмов или синтеза ДНК-гена; - получение гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК; - введение рекомбинантных молекул ДНК в живые клетки; - отбор клеток, в которых проявляется признак, специфически кодируемых данным геном. Выделение генов, представляющих собой сегменты ДНК. Осуществляется на основе биохимических методов. Сложность выделения зависит от величины генома. – Определенный ген вируса выделить относительно просто. Для гена человека эта задача представляет большие трудности. Для того, чтобы экспрессировать фрагмент гена человека в клетку прокариот необходимо провести операцию – сплайсинга (от англ. splising – сплетения, сливания) (рис. 9). Для этого исследователи часто прибегают к косвенному методу, основанному на выделении матричной РНК (мРНК), что гораздо доступнее. Используя РНК и фермент под названием обратная транскриптаза, можно получить ДНК-копию, которая по структуре и длине в 69 значительной степени соответствует структурному гену данного белка. Такой метод имеет еще одно важное преимущество. Как известно, в клетках животных информация о структуре белка может кодироваться не одним непрерывным участком ДНК, а несколькими сегментами, называемыми экзонами, чередующимися с неинформативными участками ДНК, носящими название интроны. В ядрах клеток эукариот иРНК подвергается процессингу, в ходе которого интроны удаляются. Образующаяся мРНК обладает как последовательностью, кодирующей включение аминокислот в белок, так и последовательностями, содержащими регуляторные сигналы, необходимые для начала и прекращения процесса трансляции. Поэтому ДНК-копия, синтезированная на мРНК обратной транскриптазой, идеально отвечает условиям экспрессии данного гена в бактериальную клетку. Рис. 9 Сплайсинг (процессинг) РНК: 1 – транскрипция 2 – трансляция а,б,в – экзоны, г,д – интроны I – ДНК, II – РНК, III – мРНК, IV – белок. экзоны – кодирующие области ДНК. интроны – некодирующие области ДНК. Второй вариант выделения сегментов ДНК – их синтез. Эти успехи опираются на достижения молекулярной биологии в исследовании структур белков и нуклеиновых кислот. В 1976 году Гилберт и Максам разработали быстрый метод химического анализа ДНК, вследствие чего появилась реальная возможность определения последовательности до 1000 нуклеотидов. После определения структуры мРНК Корана в 1972 году осуществил синтез ДНК, т.е. ген, соответствующего этой мРНК. Используемый им метод синтеза ДНК, названный фосфорноэфирным, вскоре был усовершенствован (фосфотриэфирный метод, фосфитный метод), в настоящее время является основным для проведения такого рода работ. 70 В 1980 году Итакура создал первый синтезатор генов. Вскоре после этого компания «Био-Лоджикалс» (Канада) выпустила прибор, сконструированный Огилви. Прибор был способен за 6 часов синтезировать 12-членный олигонуклеотид с заданной последовательностью. И если в мае 1979 года для синтеза гена длиной в 120 нуклеотидов требовалось 2 года, то уже в 1981 году эту задачу можно было решить с помощью синтезатора за 3 дня. Химический синтез ДНК, помимо прикладных задач, связанных с генной инженерией, создает предпосылки для изучения регуляции синтеза нуклеиновых кислот (НК), так как при химическом синтезе имеется возможность вносить изменения в ДНК и изучать их влияние на биологическую функцию НК. Получение гибридных рекомбинантных молекул ДНК и введение ДНК в бактериальные клетки. Получение гибридных молекул ДНК стало возможным после открытия в 1972 году Арбером и Слитом (лауреаты Нобелевской премии 1978 года) ферментов рестрикции, которые расщепляют одну из комплементарных сетей ДНК в специфических участках с последовательностью из 5-6 пар нуклеотидов, называемых палиндромами. Например, E.coli продуцируют эндонуклеазу рестрикции EcoRI, действующую на последовательность – ГААТЦ- и расщепляющую связь Г-А. Такая последовательность называется палиндромной, так как в антипараллельной цепи, прочитанная справа налево, она дает тот же тест. В результате действия фермента рестрикции в несовпадающих положениях обеих цепей на концах вновь образующихся фрагментов ДНК возникают последовательности, называемые липкими концами. Липкие концы обусловливают возможность узнавания и реконструкции фрагментов ДНК. Для реконструкции фрагментов используются ферменты под названием лигазы, способных сшивать фрагменты ДНК Рис. 10 Схема образования «липких концов» ДНК при действии рестриктаз. 71 Введение рекомбинантных молекул ДНК в живые клетки. Для введения ДНК (генов) в клетки бактерий используются два метода: первый основан на применении в качестве вектора - плазмиды, второй – бактериофагов. Причем использование вектора на основе плазмиды предпочтительней вектора на основе фазовой ДНК вследствие отсутствия лизиса клетки хозяина и большой величины размера плазмиды. Такой метод клонирования основан на том факте, что химерные и гибридные молекулы ДНК могут быть включены в состав веторов, к которым относятся бактериальные плазмиды, фаги или космиды, способные к репликации в хозяйских клетках под контролем собственных регуляторных элементов. Таким путем добиваются амплификации химерной ДНК. Общая схема процесса клонирования представлена на рис. 11. Плазмиды найдены почти у всех видов бактерий. Они представляют собой кольцевые молекулы ДНК. По размеру составляющие 1-3% генома бактериальной клетки. Эта малая часть наследственного аппарата клетки кодирует такие важные генетические признаки, как информацию необходимую для конъюгации бактериальных клеток, позволяющую клеткам использовать многие сложные соединения в качестве источника питания и обеспечивать устойчивость ко многим токсическим агентам, в том числе к антибиотикам. Экспериментально было показано, что при конъюгации микроорганизмов может происходить обмен плазмидами. Такой обмен приводить к переносу генов, находящихся в плазмиде, из одного вида клеток в другой при совместном росте и конкуренции, в результате чего реципиентные клетки приобретают способность выживать за счет донорских клеток. Для встраивания ДНК-копии в плазмиду ее сначала обрабатывают ферментом – концевой трансферазой, которая наращивает на концах ДНК короткую последовательность нуклеотидов. Плазмиду расщепляют в определенном участке рестрикционной эндонуклеазой. После расщепления плазмиды на ее концы с помощью концевой трансферозы наращивают последовательности из 4-х комплиментарных нуклеотидов. После этого концы двух полученных молекул ДНК могут соединяться благодаря взаимодействию комплементарных последовательностей и нуклеотидов (Г Ц). С помощью бактериальной ДНК-лигазы осуществляют сшивку ДНК-вставки с плазмидой 72 ДНК. Полученная новая кольцевая молекула уже представляет собой молекулу рекомбинантной ДНК. Обычно молекулы таких рекомбинантных ДНК не проникают сквозь клеточную стенку бактерий, однако разбавленный раствор хлористого кальция делает клетки проницаемыми, и некоторые из них приобретают новую плазмиду. Рис.11 Введение гена в плазмиду и его клонирование в клетках E.coli Отбор трансформированных клеток, которые приобрели новую плазмиду. Осуществляется с использованием генетического маркера. Например, для отбора рекомбинантов в качестве вектора плазмиды рВ 322 используется ген устойчивости к тетрациклину, характерный для данной плазмиды. В настоящее время с помощью генно-инженерной технологии осуществляется производство инсулина, соматостатина, соматотропина, интерферонов. Основным преимуществом получения видоспецифических для человека белков путем микробиологического синтеза являются исключение дефицитного сырья и снятие этических проблем. На основе 73 генно-инженерных методов можно конструировать микробные клетки, способные синтезировать структуры растительного и животного происхождения, имеющих важное значение для медицины. Биотехнология инсулина. Биосинтез инсулина человека в клетках кишечной палочки – одно из величайших достижений генной инженерии, поставленных на службу человечеству. Так, в 1985 году было во всем мире зарегистрировано 70 млн. больных диабетом, из них только 4 млн. получали препарат инсулина. Инсулин – гормон, вырабатываемый эндокринными железами, открыт в 1900 году нашим соотечественником Л.В. Соболевым. В его работах впервые было показано, что уровень сахара в крови человека, регулируется специальным гормоном, продуцируемым особыми клетками поджелудочной железы. Через 21 год английские исследователи Бантинг и Бест выделили из этих клеток инсулин. В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы собаки, был впервые введен девятилетнему мальчику, больному диабетом. Результат превзошел все ожидания. Уже через год американская компания «Эли Лилли» выпустила первый препарат животного инсулина. Обычно животный инсулин получают из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Опытный персонал на бойнях по разработанной методике осуществляет извлечение желез из туш, быстрое их замораживание. Затем в вагонах-рефрижераторах сырье отправляется на фармацевтические предприятия. Поджелудочная железа коровы весит 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 1000 кг исходного сырья. Инсулины животных, в силу видовой специфичности, обладают негативными побочными эффектами: нарушение работы почек, расстройство зрения, аллергические проявления. Аминокислотная последовательность человеческого инсулина была определена Сэнгером еще в 1955 году. В 1963-1965 годах коллективами исследователей в США, ФРГ и Китае был проведен синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина. Однако осуществить в промышленном масштабе дорогостоящий и сложный синтез, который включает 170 химических реакций, оказалось трудно. Получение этого гормона генно-инженерным способом представлялось весьма перспективным и было выполнено в начале 80-х гг. В качестве компетентной клетки использовали Е. coli, гены обеих цепей молекулы 74 человеческого инсулина были получены методом химического синтеза. Эти гены присоединяли к 3´ - концу гена, кодирующего белок β – галактозидазу, и вводили в векторную плазмиду. Трасформированные клетки Е. coli синтезировали химерные белки , состоящие из А- или В-цепи инсулина, присоединенной через метионин к β – галактозидазе. При помощи бромциана, специфически расщепляющего белки по остатку метионина, выделяли индивидуальную цепь инсулина. Далее цепи соединяли в активную молекулу инсулина. Образование дисульфидных связей in vitro являлось лимитирующей стадией всего процесса, причем выход был незначительным. В связи с этим был разработан метод получения проинсулина человека с последующим созреванием его in vitro. Были синтезированы несколько десятков олигонуклеотидов, соединенных затем при помощи ДНК-лигазы. Полученные двухцепочечные фрагменты ДНК, соответствующие гену, кодирующему человеческий инсулин, были встроены в плазмиду, а затем перенесены в Е. coli. Полученные рекомбинантные клетки синтезировали проинсулин, который затем in vitro превращали в инсулин. В настоящее время генно-инженерный инсулин широко применяется в медицинской практике. Рис.12. Получение инсулина человека генно-инженерным методом ( по В.А.Ефимову). 75 ЛЕКЦИЯ 5. Геномика и протеомика План лекции 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Определение, цель и основные направления геномики. Секвенирование генов. Проект «Геном человека». Протеомика. Понятие «модельный организм». Таргетный скрининг. Понятие «ivi и house keeping gens». Метод IVET (выявление и выделение ivi-генов). Литература 1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология: принципы и применение. – М.: Мир, 2002 2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учебное пособие. – Новосибирск, 2004 3. Гуттман Б., Гриффитс Э., Сузуки Д., Куллис Т. Генетика. – М.: ФАИРПРЕСС, 2004. – 448 с. 4. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Биотехнология. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 256 с. Вопросы к лекции 1. Укажите отличия таких научных направлений, как геномика и протеомика. 2. Поясните суть медицинской геномики. 3. Приведите примеры модельных организмов. 4. Перечислите этапы таргетного скрининга. 5. Охарактеризуйте метод IVET. 76 Геномика – научная дисциплина, возникшая в конце XX века с целью познания генома, то есть всей совокупности генов в организме. Применительно к фармации геномика позволяет выявлять новые гены – мишени для действия лекарственных средств или гены, с продуктами которых могут взаимодействовать лекарства. Для осуществления генетической характеристики клетки проводится определение количества и последовательности генов, их строения и функций. Цель геномики – получение информации о всех потенциальных свойствах клетки, которые не реализуются на данный момент, например, «молчащие гены». Направления геномики Геномика подразделяется на пять направлений: структурную, функциональную (метаболическую), сравнительную, эволюционную, медицинскую геномику. Структурная геномика характеризует геном по молекулярной массе, количеству генов и их нуклеотидной последовательности. Функциональная (метаболическая) геномика устанавливает зависимость между генами и метаболическими реакциями. Сравнительная геномика изучает сходства и различия в организации геномов разных организмов с целью выяснения общих закономерностей их строения и функционирования. Эволюционная геномика объясняет пути эволюции геномов, происхождение генетического полиморфизма и биоразнообразия, роль горизонтального переноса генов. Медицинская геномика решает прикладные вопросы клинической и профилактической медицины на основе знания геномов человека и патогенных организмов (например, диагностика наследственных болезней, генотерапия, причины вирулентности болезнетворных микроорганизмов). Секвенирование генов. Все шаги эволюции живой природы, несомненно, должны были закрепляться в информационной системе ДНК (а для некоторых существ - в РНК), а также в организации её в клетке для выполнения консервативной функции сохранения наследственности и противоположной функции - поддержания изменчивости. Такое представление о формировании генома каждого вида наиболее обоснованно. Применительно к геному человека можно сказать, что эволюция человека - это эволюция генома. Такое представление подтверждается теперь многочисленными молекулярногенетическими исследованиями, поскольку стало возможным сопоставление геномов разных видов млекопитающих, в том числе человекообразных обезьян, а также в пределах вида Homo sapiens геномов разных рас, этносов, популяций человека и отдельных индивидов. Минимальные геномы микроорганизмов состоят из нескольких сотен генов. Размер генома человека приближается к ста тысячам генов. Размеры одного гена варьируют, начинаясь с 1000 нуклеотидов 77 и выше. Следовательно, для полного знания генома необходимо определить последовательность нескольких миллионов пар нуклеотидов. Ключевой операцией для характеристики геномов различных организмов является секвенирование. Секвенирование – определение последовательности нуклеотидных пар в ДНК. Методы секвенирования были разработаны в конце 70-х гг прошлого века. Вслед за этим были определены последовательности нуклеотидов многих генов млекопитающих, включая гены кодирующие гемоглобин, инсулин, цитохром с, полный геном вируса Эпштейна-Барр, полный геном хлоропластов растений. Эти методы целесообразно использовать не только для выявления последовательности нуклеотидов, но и для установления последовательности аминокислот в белковой молекуле. Считывание ДНК принципиально может происходить с 6 рамками считывания (по три в каждой цепи) истинную рамку считывания определяют по числу стоп-кодонов, они должны встречаться как можно реже. В настоящий момент широко применяется два подхода секвенирования ДНК: химический и ферментативный. Химический метод включает в себя следующие этапы: выделение идентичных молекул ДНК, - плавление молекулы ДНК (плавление – воздействие на двухцепочечную молекулу ДНК высокими температурами, следствием чего является разрушение связей между комплементарными цепями ДНК), рестрикция молекулы ДНК, - разделение фрагментов методом электрофореза. Анализу подлежат одноцепочечные фрагменты ДНК полученные в результате рестрикции по определенному нуклеотиду. Процесс рестрикции представляет специфическое разрезание молекул нуклеиновых кислот ферментами рестриктазами. В норме рестриктазы вырабатываются бактериями для защиты от возможного проникновения чужеродной ДНК. Каждый фермент распознает специфическую последовательность из 4 - 6 нуклеотидов. Соответствующие фрагменты в собственной ДНК замаскированы метильными радикалами. Рестриктазы способны расщеплять ДНК с образованием серии различных фрагментов, что позволяет создавать рестрикционные карты, где показано положение каждого сайта рестрикции относительно других. Такой анализ показывает степень родства между генами без установления нуклеотидной последовательности. Таким образом, было показано, что гены человека, шимпанзе и орангутана, кодирующие цепи гемоглобина, сохранились в практически неизменном состоянии. 78 Для секвенирования используют 4 одинаковые пробы, в каждую пробу вносят рестриктазу расщепляющую ДНК по одному из нуклеотидов. Полученные пробы подвергают параллельному электрофорезу. Ферментное секвенирование включает в себя следующие этапы: выделение молекулы ДНК, репликация молекулы в присутствии дидезоксирибонуклеотидов, разделение фрагментов методом электрофореза. Ключевым моментом при данном подходе является использование дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов, при встраивании в цепочку ДНК останавливает процесс репликации ДНК. Используют 4 пробы, куда вносят разные дидезоксирибонуклеозиды. После чего проводят параллельный электрофорез всех проб. Таким образом, можно установить последовательность нуклеотидов в цепочке нуклеиновых кислот, а, следовательно, не только строение гена, но и степень гомологии между разными генами. Степень родства генов интересна не только с точки зрения филогенетики, с целью установления родства организмов, но и в практических целях. Так в случае поиска ингибитора данного гена у патогенных организмов с целью создания на его основе лекарственного средства необходимо знать есть ли ген с такой или близкой последовательностью в организме хозяина. Это позволяет сделать вывод о безопасности лекарственных средств. Проект «Геном человека» Разработка быстрых методов секвенирования сделала возможным определение нуклеотидных последовательностей крупных молекул ДНК, а не только их фрагментов. В 1978 году Ф. Сэнгер с соавторами опубликовали первую полную последовательность одноцепочечной ДНК бактериофага ϕ Х 174, имеющей размер 5386 нуклеотидов. До 1995 года наиболее крупными геномами с известной последовательностью нуклеотидов были ДНК цитомегаловируса и ДНК вируса осповакцины. Появление высокопроизводительных методов секвенирования ДНК позволило определять последовательности более крупных геномов. Значительная роль в этом принадлежит автоматизации всего процесса секвенирования, начиная от приготовления матрицы и заканчивая занесением определенных последовательностей ДНК в компьютер без непосредственного участия оператора. Расшифровка крупных геномов прокариотических и эукариотических клеток потребовала объединения усилий разных лабораторий и формирования геномных проектов. В начале 1990 гг в США была принята официальная программа по расшифровке генома человека «Human Genome Project, HGP», в рамках которой планировалось при вложении 3 млрд долларов США завершить секвенирование 79 полного генома человека в течение 15 лет. В 2001году участники американской программы HGP и Международного консорциума по секвенированию генома человека независимо объявили о завершении секвенирования большей части (более 95%) генома человека. Компанией Celera Genomics в рамках проекта по секвенированию генома человека использовалось пять образцов человеческой ДНК от двух женщин и трех мужчин. Среди этих людей были один афроамериканец, один китаец, один испано-мексиканец и двое европейцев. На основании данных секвенирования пяти образцов ДНК была рассчитана консенсусная последовательность генома человека длиной 2,91 млрд полинуклеотидов. Компъютерный анализ позволил обнаружить 26588 транскрибируемых и транслируемых в белки генов, а также еще около 12 тыс. предсказанных генов. Экзоны занимают лишь 1,1% генома, в то время как интроны – 24%. Остальная часть генома (75%) представлена межгенными последовательностями. Интересно, что число обнаруженных генов в геноме у человека лишь в два раза больше, чем у нематоды Caenorhabditis elegans. В 2003 году проект «Геном человека» был успешно завершен. Широкое распространение получили также проекты по секвенированию и анализу полных геномов патогенных микроорганизмов. Полученные данные используются для разработки экспресс-методов типирования бактерий и оценки риска бактериальной контаминации; для создания лекарств, направленных на специфические мишени, блокирующие работу генов патогенности; для более целенаправленного создания вакцин. Практическое приложение сведений о нуклеотидной последовательности геномов многих патогенных вирусов уже широко реализуется. Генноинженерным путем создаются непатогенные фрагменты геномов вирусов. Такие фрагменты способны к экспрессии в высоких концентрациях белков вирусов, которые необходимы для приготовления диагностических и вакцинальных препаратов. Развивается технология приготовления ДНК-вакцин против СПИДа, гепатита С и других вирусных инфекций. Протеомика – научное направление молекулярной биологии, занимающееся сравнительным изучением клеточных протеомов, то есть наборов белков данной клетки в данной фазе ее развития в определенный момент времени. В клетках любых организмов, будь это бактерия или человек, никогда не происходит экспрессия (то есть выражение) всех имеющихся в наличии генов, а лишь части из них. Заключительной стадией генной экспрессии является образование биологически активного генного продукта, которым в подавляющем большинстве случаев является белок. Белки или протеины (отсюда протеом) способны выполнять в клетке и многоклеточном организме в целом самые разнообразные биологические функции: быть ферментами, 80 ростовыми гормонами, рецепторными и регуляторными белками. При этом общий состав клеточных белков постоянно меняется в зависимости от фазы цикла клеточного деления, тканевой принадлежности и стадии дифференцировки в случае многоклеточных организмов, внешних воздействий. Кроме того, помимо набора, меняется еще и количество белков: от нескольких молекул до нескольких тысяч на клетку. Основная задача протеомики - предсказание функциональной роли отдельных белков путем экспериментального сопоставления их качественного и количественного состава в клетке на разных стадиях и в разных состояниях ее развития. Помимо этого, в задачу протеомики входит установление взаимосвязи между структурой белка и его функциями, что вплотную сближает это направление с функциональной геномикой. В настоящее время, в связи с завершением работ по первичному установлению нуклеотидной последовательности геномов ряда организмов (включая человека), особую актуальность приобрела задача использования полученной при этом информации для детального понимания функционирования живой материи на молекулярном уровне. Поскольку биологическая функция закодированных в геномах белков определяется, прежде всего, их пространственным (трехмерным) строением, то задача определения закономерностей фолдинга белка (т.е. складывания полипептидной цепи в функционально активную трехмерную структуру) исходя из закодированной в гене его аминокислотной последовательности является сейчас центральной. Понимание механизмов фолдинга также важно для биотехнологии и развития белковой инженерии. Кроме того, возникновение многих нейродегенеративных заболеваний у человека и животных (наиболее яркий пример - коровье бешенство) связано с наличием в их организме прионов - белков с ненормальным фолдингом. На данный момент существует несколько основных методов предсказания пути фолдинга и трехмерной структуры белков. Первый из них, называемый моделированием по гомологии первичной структуры, заключается в сравнении аминокислотных последовательностей моделируемого белка и белков с экспериментально установленным пространственным строением (т.н. шаблонных белков). Основным ограничением этого подхода является наличие хотя бы 25-30% идентичности аминокислотных последовательностей моделируемых и шаблонных белков, что выполняется обычно только в ряду эволюционно и функционально родственных белков. В основе второго подхода, получившего название "протягивание нити" (threading), лежит предположение, что одинаковый путь фолдинга могут иметь белки и с негомологичными аминокислотными последовательностями. Основное преимущество этого подхода перед 81 предыдущим заключается в возможности проводить надежное моделирование пространственного строения белков даже при отсутствии какой-либо гомологии первичной последовательности с белками-шаблонами. Таким образом, два обозначенных выше способа теоретического предсказания трехмерной структуры белков основаны на статистической обработке огромного объема молекулярно-биологических данных. При этом часто используются нейронные сети, обученные на богатом эмпирическом материале. Еще один интересный подход предсказания пространственной структуры белков был предложен в работах российских ученых: Л. Меклера и Р. Идлис. Метод основан на отказе от принципа "объемного распознавания" аминокислотными остатками друг друга в молекуле белка и предположении существования линейной стереохимической комплиментарности аминокислотных остатков. На основе разработанной теории авторами был предложен и довольно успешно опробован на нескольких объектах (белки: тахиплезин, лизоцим) алгоритм предсказания пространственной структуры белков. "Проблема фолдинга" до сих пор является одной из самых сложных и трудно решаемых задач современной молекулярной биологии. К сожалению, без ее решения невозможно в полной мере воспользоваться последними достижениями биологии для решения практических вопросов (медицина, сельское хозяйство и т.д.). Именно поэтому протеомика становится первоочередным направлением в биологических исследованиях. Недавно консорциум ведущих биотехнологических компаний ("Celera Genomics", "Proteome Sciences" и "Roche") объявил о создании Human Proteome Organisation (HUPO). Цель проекта "Протеом человека" - построение всеобъемлющей базы данных по белкам человеческого организма. В проекте также участвуют такие известные исследовательские центры как Harvard Medical School, University of Michigan, Scripps Research Institute, University of Utrecht, University of Tokyo и London's Imperial College School of Medicine. Понятие «модельный организм» Модельные организмы — организмы, используемые в качестве моделей для изучения тех или иных свойств, процессов или явлений живой природы. Модельные организмы интенсивно изучаются, причем одна из причин этого — надежда на то, что открытые при их изучении закономерности окажутся свойственны и другим более или менее похожим организмам, в том числе и человеку. Часто модельные организмы используются в тех случаях, когда проведение соответствующих исследований на человеке невозможно по техническим или этическим причинам. Использование модельных организмов 82 основано на том, что все живые организмы имеют общее происхождение и сохраняют много общего в механизмах хранения и реализации наследственной информации, метаболизме и др. В качестве модельных выбирают обычно организмы, которых легко содержать и разводить в лабораторных условиях (Escherichia coli, Tetrahymena thermophila, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Mus musculus). Дополнительными преимуществами является короткое время генерации (быстрая смена поколений), возможность генетических манипуляций (наличие инбредных линий, в случае многоклеточных возможность получения стволовых клеток, разработанные методы генетической трансформации). Дополнительными причинами для выбора данного объекта в качестве модельного может служить его положение на филогенетическом древе: например, макак-резус является важным модельным организмом для медицинских исследований из-за своего относительно близкого родства с человеком (по той же причине для полной расшифровки был выбран геном шимпанзе). Исторически сложилось, что модельные организмы (кишечная палочка, дрожжи, дрозофила) стали первыми среди соответствующих групп организмами, геном которых был полностью секвенирован. В дальнейшем наличие полностью секвенированного и расшифрованного генома стало важным требованием для использования организма в качестве модельного в биохимии, генетике, молекулярной биологии и большинстве других областей. По этой причине иногда выбор организма был обусловлен особенностями его генома: так, рыба-фугу Fugu rubripes была выбрана в качестве модели для изучения генома благодаря его малым размерам (низкий процент некодирующих последовательностей). Mycoplasma genitalium — «минимальный организм», имеет один из самых маленьких геномов среди всех клеточных организмов; в 2007 году близкий вид использован Крейгом Вентером для пересадки генома, в результате которой один вид бактерий был превращен в другой. Кроме организмов, модельными объектами могут служит и биологические системы других уровней организации — молекулы, клетки и их части (например, гигантский аксон кальмара), клеточные линии (например, линия клеток человека HeLa), органы (например, упомянутый в списке беспозвоночных - стоматогастрический ганглий десятиногих раков), популяции и экосистемы. 83 Таргетный скрининг Особое значение применительно к фармации функциональная геномика имеет при установлении так называемой «существенности» генов. Под существенностью понимается необходимость гена для существования организма. Так при создании антимикробных лекарственных препаратов именно существенные гены должны быть мишенями для антимикробных веществ. Для доказательства существенности гена применяется технология выбивания гена, с последующей проверкой выживаемости организма. Традиционная схема отбора антимикробных препаратов проводится путем испытания их действия на рост тест-культуры микроорганизма. Высокоактивные вещества, отобранные на этом этапе проходят следующие испытания, в частности определяется антимикробный спектр их действия и активность в опытах на животных, а также токсичность для макроорганизма в целом. По завершении доклинических испытаний в случае получения положительных результатов ставится вопрос о передаче препарата в клинику. Затем начинается более глубокое изучение механизма действия на субклеточном и молекулярном уровне, то есть ведется поиск его внутриклеточной мишени – таргета. Далее выясняется ген, кодирующий эту молекулу. По новой технологии скрининга используют информацию о полностью секвенированном геноме патогена и наличие в нем существенных генов. В лаборатории, работающей над созданием антимикробного препарата определяется ген, продукт которого будет выступать в качестве таргета. Таргетный скрининг позволяет в соответствии с выбором гена отбирать биологически активные вещества с запланированным механизмом действия. Этапы таргетного скрининга: 1. выделение гена 2. амплификация выбранного гена, встраивание в вирусный вектор, который затем встраивается в плазмиду 3. конструирование бесклеточной системы, где полученная матрица служит для получения и-РНК, специфичной для гена 4. бесклеточная система служит для наработки белкового продукта, кодируемого данным геном 5. Когда белок наработан необходимо установить его функции, в данном случае можно использовать модельный организм. Если сходства не установлено выявляют в составе какой полицистронной РНК он транскрибируется, по набору белков, кодируемых данной РНК можно установить функцию интересующей нас молекулы. 6. 84 Понятие «ivi и house keeping gens». Полное секвенирование генома вносит свой вклад в фармацию еще в одном отношении. У патогенных микроорганизмов открыты гены «существенные» для протекания инфекционного процесса, но несущественные при росте ин витро – на искусственных питательных средах. Скрытые или молчащие ин витро гены получили название ivi генов – генов вирулентности. К ним относятся ферментные системы и белковые переносчики, позволяющие клетке жить и размножаться в условиях макроорганизма. В качестве примера можно привести следующий: в условиях макроорганизма бактериальные клетки испытывают недостаток ионов железа, чего не бывает при культивировании ин витро. В этом случае клеткой синтезируется специальный набор ферментов и транспортных белков позволяющих транспортировать ионы железа внутрь клетки против градиента концентрации. Для образования такой системы необходима экспрессия определенных генов. Из молчащих – несущественных они становятся существенными т.к. из подавление приведет к подавлению роста и размножения микроорганизма в условиях ин виво. Понятно, что при росте и размножении микроорганизмов во время инфекционного процесса экспрессируются только ivi гены большинство генов экспрессированы как в условиях ин витро, так и ин виво, их продукты необходимы клетке всегда. Такие гены получили название house keeping gens – условно гены на которых держится дом. Они экспрессированы постоянно. Гены с постоянной экспрессией называются конститутивными, гены с экспрессией только при определенных условиях индуцибельными. Соотношение между генами данных групп может варьировать у разных микроорганизмов, но в среднем более 90% генов относятся к house keeping gens. Метод IVET (выявление и выделение ivi-генов) Значительный интерес представляют пути выявления и выделения ivi генов с последующим их использованием в бесклеточных системах. В качестве примера можно привести метод IVET (In vivo expression technology). Основные этапы метода: 1. Геном патогенного микроорганизма делится на фрагменты при помощи рестриктаз. 2. Каждый фрагмент присоединяется к лишенному промотора гену хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. Такой лишенный промотора ген не может реплицироваться при попадании в клетку. Однако репликация стала бы возможной в случае если фрагмент соединенный с геном хлорамфениколацетилтрансферазы имеет свой промотор. 3. На следующем этапе к сдвоенному фрагменту х-cat, где х часть генома патогенного микроорганизма, саt – ген хлорамфеникол- 85 ацетилтрансферазы присоединяют гены лактозного оперона также лишенного промотора. 4. Далее этот фрагмент состоящий из трех разнородных частей вводят в плазмиду. 5. На следующем этапе непатогенные микроорганизмы с различными вариантами плазмид (отличия по х-фрагменту) вводят в организм лабораторных животных, животным также вводят хлорамфеникол. 6. Через сутки из ткани животного высевают бактериальную культуру на среду с лактозой. Выросшие колонии будут либо красного цвета (утилизация лактозы) и бесцветные. Анализу подлежат бесцветные колонии. Логика такова, если клетки остались жизнесопособны, следовательно в условиях макроорганизма наблюдалась экспрессия генов и был нейтрализован антибиотик. Но так могли активироваться как ivi гены, так и house keeping нас интересуют только те колонии, у которых на индикаторной среде с лактозой экспрессии генов не происходит, так как вероятно гены находятся в экспрессированном состоянии только при развитии инфекционного процесса. 86 Лекция 6. Препараты крови человека Биотехнологические аспекты получения План лекции 1.Кровь как основа для получения лекарственных препаратов. 2.Свойства и структура основных белков плазмы крови: иммуноглобулинов и альбумина. 3.Промышленная биотехнология иммуноглобулинов и альбумина. 4.Контроль качества и стандартизация готовых препаратов крови. 5.Перспективы развития новых лекарственных форм крови. Литература 1.Руководство по вакцинному и сывороточному делу. - М.: Медицина, 1978г 2.В.М. Русанов, Л.И. Скобелев. // Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. - М.: Медицина, 1983г. 3.В.М. Русанов, И. Левин // Лечебные препараты крови. - М, 2004г. Вопросы к лекции 1.Дайте характеристику типов иммуноглобулинов. 2.Охарактеризуйте требования к донорскому сырью, основные этапы технологической схемы выделения иммуноглобулинов. 3.Укажите роль альбумина в обеспечении функций организма и укажите основные этапы получения альбумина. 4. Назовите основные перспективы развития новых лекарственных форм крови 87 Кровь-источник жизненно важных лекарственных средств В арсенале лекарственных средств большое место занимают препараты, получаемые из крови человека. Кровь человека является эффективным лечебным средством при ряде заболеваний и ее трансфузии широко применяются в медицинской практике, а ее компоненты - это ценное сырье для получения кровезаменителей и других лечебно-профилактических препаратов. Следует подчеркнуть, что препараты крови занимают важное место среди средств медицинской помощи при массовых поражениях и чрезвычайных ситуациях, поэтому состояние их производства в стране имеет государственную значимость. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), потребность России составляет 1200 тыс. литров плазмы в год. Сегодня ее заготавливается около 700 тыс. литров, из которых для производства лекарств используется менее 200 тыс. литров (около 30%). При этом потребность страны в альбумине удовлетворена лишь на 15% , а в иммуноглобулине на 5% (прежде всего для внутривенного введения). Концентраты очищенных факторов свертывания VIII и IХ вообще не изготавливаются в России, и 4,5 тыс. зарегистрированных больных гемофилией не получают полноценной медицинской помощи. Кровь - жидкая ткань, непрерывно движущаяся по сосудам, проникающая во все ткани организма и связывающая их между собой. Она представляет сложную систему и состоит из форменных элементов крови и плазмы. К важнейшим функциям крови относят: 1.Перенос кислорода из легких к тканям и углекислоты из тканей в легкие. 2.Перенос питательных веществ и продуктов обмена. 3.Перенос гормонов и ферментов от места их выработки к местам их активного действия. 4.Защиту организма от проникновения в него вредных агентов с помощью фагоцитоза или антител (иммуноглобулинов). Важную роль в выполнении многих функций и процессов, протекающих в организме человека, играет плазма крови. В составе плазмы выявлено более 100 различных биологически активных соединений. Благодаря применению современных физико-химических методов, удалось выделить большую часть белковых компонентов, установить их количественное содержание в плазме, относительную молекулярную массу, электрофоретические, биологические и функциональные характеристики. 88 Биологически активные соединения плазмы: альбумин, иммуноглобулины, фибриноген, антитромбин, активированный белок С, гемоглобин, фактор VI и VIIа, фактор VIII, фактор Х, фактор ХI, фактор ХII. апотрансферрин, гаптоглобин, С-реактивный белок, гемопексин В лечебной практике используется лишь незначительная часть белков, присутствующих в плазме, поэтому мы рассмотрим лишь те основные белки находящиеся в плазме крови, которые обладают лечебными свойствами. Это иммуноглобулины и альбумин. Структура и свойства основных белков плазмы крови Иммуноглобулины (Ig) - белки гликопротеиновой природы, которые продуцируются плазматическими клетками под влиянием антигенов. Согласно определению ВОЗ, белки животного происхождения, являющиеся носителями антител (АТ), названы иммуноглобулинами. С целью унификации названий и упорядочения классификации иммуноглобулинов основные типы этих белков были отнесены к пяти группам: IgG, IgA, IgM, IgE Ig D. Таблица 3 СОДЕРЖАНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ Название иммуноглобулинов B % от общего Обозначение содержания иммуноглобулинов Иммуноглобулин G Ig G 70-75 Иммуноглобулин M Ig M 10 Иммуноглобулин A Ig A 15.-20 Иммуноглобулин E Ig E Менее 0,01 Иммуноглобулин D Ig D 0,2 Краткая характеристика иммуноглобулинов. ИММУНОГЛОБУЛИНЫ G Ig G - главный изотип Ig нормальной сыворотки человека, на его долю приходится 70-75% общего количества сывороточных Ig.. У человека АТ всех подклассов Ig проникают через плаценту в организм плода, создавая напряженный пассивный иммунитет. Важнейшей функцией Ig G является: -связывание комлемента, - проникновение через плаценту, - участие в протективном иммунитете при вирусных и бактериальных инфекциях, -участие в формировании антипаразитарного иммунитета. 89 ИММУНОГЛОБУЛИН М Ig класса М являются пентамерами и составляют 10 % пула общих Ig (0,5-1,9 мг/мл) , имеет м. массу 900 000. Ig М антитела являются наиболее ранними антителами из всех классов и участвуют в первичном иммунном ответе. АТ этого класса способны агглютинировать бактерии, вызывать нейтрализацию вирусов, активировать и связывать комплемент, играют важную роль в элиминации возбудителя из кровяного русла, участвуют в активации фагоцитарной деятельности клеток. ИММУНОГЛОБУЛИН А IgА составляют 15-20 % от общих Ig в сыворотке человека. Содержится в молоке, молозиве, слюне, слезном и носовом секретах, моче, желчи, толстом кишечнике. Ig класса А обладают: - антивирусными и антибактериальными свойствами, - нейтрализуют энтеротоксины. - обеспечивают местный иммунитет в дыхательных и пищеварительных системах, препятствуют прикреплению бактерий к слизистым оболчкам. - активируют процесс фагоцитоза. - не активируют комплемент. ИММУНОГЛОБУЛИН Е Среднее содержание IgЕ в сыворотке крови менее 0,01 %. К IgЕ классу относится основная масса аллергических АТ - реагинов(12-14 %). Уровень IgЕ повышается у аллергических больных и людей, зараженных гельминтами. ИММУНОГЛОБУЛИН D Содержание Ig D в сыворотке крови 0,2%. АТ класса IgD, обладая антивирусной активностью, принимают участие в развитии местного иммунитета, а также в аутоиммунных процессах В клетках функция Ig D полностью не изучена. Для лечебных целей используют фракцию иммуноглобулинов, содержащую, в основном, IgG и, частично, IgA и IgM . Иммуноглобулины имеют различную структуру и представляются в виде мономера, димера и пентамера. В качестве типичного примера рассмотрим строение IgG 90 Схема строения иммуноглобулина G IgG (антитела) состоят из 2-х идентичных легких и тяжелых цепей, соединенных дисульфидными связями и представляют собой подобие спирали. Легкие и тяжелые цепи отличаются различной молекулярной массой. Активный центр Ig (антитела) формируется из вариабельных доменов тяжелых и легких цепей. Специфичность АТ объясняется разнообразием вариабельных части цепей и возможными их сочетаниями. Так у одного индивидуума генетически закодировано 100 вариантов легких цепей и 100 вариантов тяжелых цепей. Исходя из этого, в клонах плазматических клеток при сборке может образоваться 10 000 сочетаний Ig. В области тяжелых цепей имеется участок, в котором сгруппированы все дисульфидные связи между тяжелыми цепями, значительное количество углеводных остатков и пролина. Последний препятствует образованию спиральной структуры полипептидными цепями. Полипептидная цепь в этом участке является как бы «голой» и доступна действию разнообразных протеолитических ферментов. Этот участок получил название шарнирной области. При использовании растительных протеаз (фермента папаина), молекула Ig распадается на 3 примерно равных фрагмента: 2 антигенсвязывающих фрагмента, обозначаемых Fab и один Fс фрагмент с м.м. 45 - 55 кДа . Такой Fab-фрагмент содержит 1 активный центр и связывает одну молекулу антигена. В Fс фрагменте содержатся домены отвечающие за эффекторные функции Ig При пепсинолизе расщепление Ig происходит в шарнирной области за дисульфидной связью с образованием 2 фрагментов: F(ab) 2 - фрагмент и Fсфрагмент. F(ab) 2 фрагмент содержит 2 активных центра, т.е. связывает 2 молекулы антигена и имеет молекулярную массу 100 кДа .В Fс фрагменте также содержатся домены, отвечающие за эффекторные функции Ig. Промышленная технология иммуноглобулинов Плазма, как и другие продукты крови, могут явиться источником заражения такими инфекциями, как малярия, токсоплазмоз, болезнь Шигаса и т.д. Серьезной медико-социальной проблемой стали туберкулез, сифилис. Уровень заболеваемости сифилисом за 10 лет возрос примерно в 67 раз, причем «современный» сифилис характеризуется преобладанием скрытых форм. Не менее острой остается проблема заболеваемости гепатитом В. По данным ВОЗ около 20-30% доноров -носителей вируса гепатита В не выявляются на ранних стадиях заболевания, и являются опасными источниками этого заболевания. Также особую опасность представляют доноры с наличием вируса иммунодефицита (СПИД). 91 Технические возможности тестирования крови не дают полной гарантии ее вирусобезопасности, особенно в серонегативном периоде («фаза окна») вирусоносительства, продолжительность которого варьирует для различных вирусов. Таким образом, для получения безопасного сырья необходимо соблюдать следующие условия: 1.Проводить тщательный отбор и обследование доноров. 2.Проверять кровь и плазму на наличие вирусов, бактерий. 3. Проводить карантинизацию плазмы . 4.Совершенствовать методы тестирования крови, используя в том числе полимеразную цепную реакцию - генотестирование - как более чувствительный и достоверный метод выявления инфекции. 5.Все операции по заготовке крови (плазмы) должны осуществляться в асептических условиях. 6.Транспортирование плазмы должно проводиться в контейнерах также при низкой температуре. Таблица 4. Продолжительность «фазы окна» некоторых вирусов «Фаза окна», дни Диапазон колебаний, Вирус дни ВИЧ 22 6-38 Гепатит С 82 54-193 Гепатит В (HbsAg) 59 37-81 Т-клеточная лимфома 51 36-72 Требования к сырью Плазма перед фракционированием или замораживанием должна быть прозрачной, слегка опалесцирующей, без видимых признаков гемолиза, цвет варьирует от светло-желтого до зеленого. Плазма, предназначенная для производства стабильных дериватов (иммуноглобулины, альбумин), должна быть выделена из цельной крови не позже 5 дней после кроводачи. Содержание общего белка должно быть не менее 50 г/л Объединенная для загрузки плазма не менее чем от 1000 доноров тестируется на поверхностный антиген гепатита В, антитела к вирусу гепатита С и ВИЧ-антитела, результаты должны быть отрицательными. Хранение плазмы должно быть при температуре -20С или ниже. Если даже одна порция плазмы от одного заболевшего донора попадает в пул 92 от 500 до 1500 доноров, то вся плазма или уже полученная из нее продукция должны быть уничтожены. Моральный ущерб и финансовые потери трудно недооценить. Ситуация еще более драматична, когда такая плазма была направлена в лечебные учреждения и перелита пациенту. Биотехнология иммуноглобулинов Первый опыт разделения крови был произведен в России А.Н. Филатовым в 1932 г. предложившим использовать в качестве трансфузионной среды - плазму крови. По мере накопления клинического опыта по применению плазмы, выяснилось, что использование ее в цельном виде нецелесообразно. Усилия исследователей были направлены на поиски способов разделения белков плазмы, выделения их фракций и индивидуальных белковых компонентов, очистки и изучения свойств. Непростой задачей было разработать лекарственные формы белковых препаратов, соответствующие фармакологическим требованиям. Готовые препараты должны быть стерильными, стабильными при хранении не менее 2-х лет, удобными для медицинского применения. Обязательным критерием качества является их стандартность, определяемая фармакопейными статьями. Изготовленная продукция проверяется на соответствие стандартам по физикохимическим, биологическим свойствам (отсутствие пирогенных и токсических реакций при введении экспериментальным животным),отсутствие бактериального и вирусного загрязнения. Требования к технологическому процессу. 1. Фракционирование, стерилизация плазмы должны осуществляться в условиях полной асептики. 2. Точное соблюдение технологических операций и режимов выделения фракций белков. 3. Использование высокоэффективных методов фракционирования. 4. Использование «замкнутых» систем производства. 5. Строгий контроль на стадиях получения препарата в соответствии с регламентом производства и требованиями ФС. Основным процессом, определяющим качество препаратов иммуноглобулинов, является фракционирование. Физико-химическую сущность процесса разделения ( фракционирования) можно представить следующим образом. В плазме или сыворотке создаются условия, при которых определенная белковая фракция в силу индивидуальных свойств переходит в нерастворимое состояние или , наоборот, сохраняется в растворенном виде. 93 Используемые методы фракционирования 1.Осаждение неорганическими солями, например, сульфатом аммония, сульфатом натрия. 2.Осаждение органическими растворителями, включая этанол, эфир, хлороформ, ацетон. 3.Разделение с помощью риванола. 4.Использование высокомолекулярных полимеров, таких как полиэтиленгликоль. 5.Различные виды ионного обмена с применением катион- и анионобменных смол, целлюлозы или ионообменников на основе сефадекса. 6.Препаративный электрофорез. 7. Гельфильтрация на различных типах сефадексов и сефарозы. 8.Ультрафильтрация на мембранах. Фракционирование осуществляют с учетом того, что белковая молекула в растворе находится в непрерывном движении, не образует агрегатов и не выпадает в осадок, так как несет на себе электрический заряд и окружена водной оболочкой. При добавлении вещества дегидратирующего и изменяющего заряд белковой молекулы, можно стабилизировать белковую систему в растворе или перевести ее в нерастворимое состояние. Прибавление кислоты к раствору белков сопровождается увеличением положительно заряженных молекул за счет снижения диссоциации групп, создающих отрицательный заряд. Щелочь , напротив, подавляет диссоциацию групп , придающих положительный заряд и молекула приобретает отрицательную зарядность .Манипулируя этими растворами, можно добиться равновесия в диссоциации этих групп, и молекула будет обладать нулевым зарядом. Такое состояние молекулы называется изоэлектрическим. В изоэлектрической точке (значение рН) белок обладает минимальной растворимостью. Однако кислоты, щелочи, соли, изменяя заряд молекулы белка не способны создать условия, необходимые для его осаждения, так как не влияют на водную оболочку белка, препятствующую агрегации. Органические растворители (спирт, ацетон, хлороформ и др) присоединяют к своим молекулам воду гидратированной глобулы белка и снижают его заряд, тем самым снижая ее стабильность. Определенное значение имеет и температура среды. Снижение температуры до минусовых значений сопровождается переходом белка в нерастворимую фазу - выпадение в осадок. Это связано с замедлением движения белковых молекул при низкой температуре и усиливающем действии преципитирующих факторов. 94 Таким образом, для направленного воздействия на агрегатное состояние белковой молекулы необходимо влиять на диэлектрическую постоянную раствора, рН среды, ионную силу и температуру. Выбор метода определяют цели фракционирования. Так, например, органические растворители (этанол) используют для осаждения белков в крупномасштабном производстве. Методы ультрацентрифугирования или электрофореза неоценимы при аналитических исследованиях в связи с высокой разрешающей способностью. Ультрафильтрацию и хроматографию применяют для препаративного выделения очищенных белковых фракций. Белковые компоненты довольно близки по своим физикохимически свойствам, в связи, с чем условия их разделения отличаются незначительно. Это необходимо отчетливо понимать и помнить при проведении технологического процесса, тщательно соблюдая все регламентированные требования и режим каждой операции и стадии. В противном случае избирательность выделения искомой фракции не достигается. Впервые получение белковых препаратов плазмы стало возможным благодаря исследованиям, проведенными группой ученых Гарвардской медицинской школы в Бостоне, возглавляемой Е . Соhn. Ими были разработан метод фракционирования белков плазмы этиловым спиртом. Основные этапы технологического процесса Сбор, доставка и хранение сырья, комплектация производственной загрузки. Фракционирование белкового раствора с получением полуфабриката (полупродукта). Очистка и концентрация полуфабриката. Удаление остатков этанола. Стерилизующая фильтрация и розлив готовой лекарственной формы. Контроль качества готовой продукции в соответствии с фармакопейными требованиями. О первом этапе мы с Вами уже вели разговор, а вот на втором этапе остановимся более подробно. II этап. Фракционирование белкового раствора с получением полуфабриката (полупродукта) Плазма крови доноров является практически стерильным исходным материалом для получения иммуноглобулина и других лекарственных препаратов крови. Для выделения иммуноглобулина в условиях производства используется одна из модификаций метода, основанного на фракционировании 95 белков с помощью этилового спирта при низких температурах. Технологический процесс выделения ИГ основан на последовательном изменении основных факторов, влияющих на растворимость белков: концентрации этилового спирта, рН, ионной силы, концентрации белка, и температуры. Стадия А8 . Стадия предварительной очистки Фракционирование осуществляется путем медленного добавления к раствору плазмы (рН 7,2) охлажденного этилового спирта до концентрации 8% при непрерывном перемешивании и постоянном снижении температуры до минус 3 о С. В этих условиях денатурирующее воздействие этанола на белки плазмы проявляется лишь в небольшой степени и выделенная фракция иммуноглобулинов сохраняет растворимость. Важными условиями получения стабильных препаратов ИГ является строгое соблюдение температурного режима и по возможности минимальное вспенивание смесей при перемешивании. При центрифугировании смеси (15000 об/мин и t о минус 3 о С) формируется осадок, содержащий денатурированный белок, слизь, нерастворимые примеси, антигемофильный фактор, фибриноген. Растворенный осадок А 8 , полученный на этой стадии, может быть использован для получения фибриногена по другой регламентированной технологии. Центрифугат используют для выделения иммуноглобулинов на следующей стадии. Стадия А. Выделение фракции иммуноглобулинов Центрифугат загружают в реактор, устанавливают рН 6,8-7,2 и о добавляют охлажденный до минус 10 С этанол до концентрации 25% при непрерывном перемешивании. При центрифугировании смеси (15000 об/мин и t о минус 10 о С ) выделяют осадок, содержащий всю фракцию иммуноглобулинов G ( IgG) со значительными примесями иммуноглобулинов А и М. В центрифугате А содержится часть имммуноглобулинов А и М и альбумин и др. Из центрифугата выделяют альбумин по определенной технологии. Стадия А. Дополнительная очистка иммуноглобулинов. Для лучшей очистки осадок А растворяют и переосаждают при тех же условиях. При центрифугировании смеси А 1 получают осадок, и который растворяют в низкоионном растворе рН 5,0-5,2. Стадия Б. Отделение иммуноглобулинов А и М 96 Растворенный осадок А1 перекачивают по трубопроводам в реактор и добавляют охлажденный до минус 5 о С этанол до концентрации 17%. При последующем центрифугировании осаждаются иммуноглобулины А и М, липопротеиды, частично иммуноглобулин G, фибринолизин, аминокровин. Осадок Б может быть использован для извлечения аминокровина и фибринолизина по новой регламентированной технологии . Центрифугат Б, представляющий собой очищенный иммуноглобулин G, подвергается дополнительной очистке на следующей стадии. Стадия Б1. Дополнительная очистка фракции иммуноглобулина Загруженный в реактор центрифугат Б (рН 5,55) выдерживают при температуре минус 4 о С в течение 12-14 часов., затем центрифугируют при 15 000 об/мин при температуре минус 4 о С. Получают центрифугат Б1 иммуноглобулин G не содержащий липопротеидов, который подвергают осветляющей фильтрации при температуре минус 4 о С. Из осветленного раствора выделяют иммуноглобулин G путем осаждения. Стадия В . Осаждение иммуноглобулина На этой стадии иммуноглобулин из раствора переводят в нерастворимую фазу при добавлении охлажденного этанола при рН 6,8-7,2 и температуре минус 10 о С с последующим отделение осадка путем о центрифугирования при 15000 об/мин и температуре минус 10 С. Полученный осадок иммуноглобулинов растворяют в 0,4-0,5% растворе хлорида натрия и лиофилизируют или подвергают ультрафильтрации с целью удаления остаточного количества этилового спирта. Стадия лиофилизации и получение готового препарата Наибольшее распространение получил метод высушивания из замороженного состояния (лиофилизация), поскольку в процессе высушивания, помимо удаления остатков этанола, происходит денатурация и утрата растворимости примесей липопротеинов, которые удаляют при последующей осветляющей фильтрации. Из высушенного иммуноглобулина готовят раствор, содержащий 10% белка и 0,85 % хлорида натрия (рН 6,6-7,4) , для стабилизации раствора используют глицин. Полученный раствор иммуноглобулина опалесцирует и может содержать частицы денатурированного белка. В связи с этим препарат предварительно осветляют путем пропускания через крупнопористые фильтрующие пластины. Осветленные растворы подвергают стерилизующей фильтрации через фильтры типа «Миллипор». Готовый раствор стерильных иммуноглобулинов выдерживают на стабильность в течение 1-2 месяце при температуре минус 4 о С. Затем вновь проводят осветляющую фильтрацию для удаления небольших количеств лабильных примесей с последующей стерилизацией. 97 Стерильный иммуноглобулин разливают в ампулы и запаивают. Выпускают в ампулах по 3,0 мл и 5,0 мл препарата. КОНТРОЛЬ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Контроль иммуноглобулинов проводят на производстве и в отделе биологического и технологического контроля . Препараты иммуноглобулинов должны соответствовать фармакопейным требованиям. Методы контроля препаратов могут быть условно разделены на общие и специальные. Общие методы контроля заключаются в следующем: Подлинность. На иммуноэлектрофореграммах должны выявляться белки, свойственные только сыворотке крови человека, и отсутствовать белки животного происхождения. Содержание белка может устанавливаться в пределах 9,5-10,5%. Прозрачность - препарат должен быть прозрачным, допускается слабая опалесценция. ОП не более 0,05.Цветность-препарат должен быть бесцветным, допускается слабая желтая окраска ОП не более 0,15 Механические включения отсутствуют. рН от 6,6 до 7,4 Электрофоретическая однородность. Фракция иммуноглобулинов должна содержать не менее 97% . Молекулярные параметры. Мономеры и димеры не менее 85%, полимеры не более 10% и фрагменты не более 5%. Фракционный состав. Иммуноэлектрофорез. Дуга преципитации IgG и не более 4 дополнительных дуг, соответствующих IgA и IgM и двум другим иммунологически неактивным фракциям. Термостабильность. Препарат должен быть жидким и не образовывать гель при прогреве при 56о С в течение 4 часов. Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Пирогенность. Препарат должен быть апирогенным. Токсичность Препарат должен быть нетоксичным. Специфическая активность. 1 мл должен содержать не менее 20 МЕ анти альфа стафилолизина. Специфическая безопасность. Не должен содержать HBsAg , антител к ВИЧ 1 и ВИЧ -2. Упаковка, транспортировка и хранение препарата проводятся в соответствии с требованиями, изложенными в НТД (регламентах производства и ФС). 98 Специальные методы контроля: 1. Определение содержания специфических антител в иммуноглобулинах направленного действия. Концентрация специфических антител должна быть не менее в 6 раз выше, чем в исходной плазме. 2.Иммуноблоттинг в случае получения положительного результата при контроле препарата на содержание антител к вирусу СПИДА. Альбумин. Название белок получил от латинского слова « albus » - белый. Первоначально термином « альбумин » обозначали все белковоподобные вещества сыворотки крови. Альбумин составляет основную (около 50%) часть плазменных белков. Приблизительно 40% суммарного альбумина тела приходится на внутрисосудистый альбумин, остальное количество находится в тканях. Относительная молекулярная масса белка - около 65000 . Структура альбумина описывается как одна длинная полипептидная цепочка, уложенная в 4 связанных глобулярных сегмента неравных размеров, конформация которых фиксирована 17 дисульфидными связями. Альбумин играет значительную роль в обеспечении важнейших функций организма: * предохраняет организм от токсического действия свободных жирных кислот, нейтрализуя последние, * участвует в жировом обмене, транспортируя жирные кислоты к месту их утилизации, * транспортирует билирубин при разрушении гемоглобина в печень, * обеспечивает транспорт ионов меди, в печень, * удаление ионов никеля, ртути, * связывает ион кальция, обеспечивая равновесие связанной и ионизированной форм кальция в крови, * является носителем стероидных гормонов (гидрокортизона, кортикостерона, дезоксикортикостерона, кортизона), * связывает триптофан, обеспечивая равновесие свободной и связанной форм этой аминокислоты, * комплексируется в различными медикаментозными средствами (пенициллином, наркотическими анальгетиками и др.), транспортируя их к органам и тканям. Применяется 5% альбумин для восстановления (увеличения)объема плазмы, 20% - поднятия онкотического давления. Форма выпуска 5 или 20% растворы альбумина во флаконах. 99 ПОЛУЧЕНИЕ АЛЬБУМИНА Оборудование и аппаратурное оформление. В производственный комплекс получения альбумина входят отделения фракционирования, лиофилизации, стерильной обработки препарата и машинный зал. Виды помещений и технологическое оборудование для изготовления альбумина аналогичны таковым при производстве иммуноглобулина. Рассмотрим технологию выделения альбумина в модификации 6-го метода Кона. Исходное сырье -центрифугат А, получаемый после выделения из сыворотки общих иммуноглобулинов, представляет собой раствор с содержанием белка 1,6-2,4, рН 4,5--4,6 Раствор содержит примесь пигментов крови, иммуноглобулинов и других белков. Метод основан на ступенчатой очистке центрифугата А с целью удаления нестабильных иммуноглобулинов классов А и М и части пигментов крови. Процесс осуществляется путем проведения ряда операций с изменением концентрации этанола, рН и температуры. При использовании плазмы донорской крови выделение альбумина из центрифугата А по регламенту производят в три последовательные стадии. 1. осаждение балластной фракции, содержащей в основном Ig А (альфа-глобулины ) путем добавления 10% раствора октаноата натрия и 0,1N раствора соляной кислоты и 0,1 М раствора едкого атрия температуре +14-18 оС. Осаждение балластной фракции Ig А и IgМ (альфа - и бета-глобулинов) проводят путем центрифугирования при 15000 об/мин. Центрифугат содержит альбумин. 2. После осветляющей фильтрации альбумин осаждают путем добавления 96оС, при рН 4,8 и температуре минус 9-10 оС. Осадок альбумина растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1:2 и осветляют путем последовательной фильтрации через фильтры фирмы Zeta plus 60 b 90 LP и капроновые фильтры с размерами пор 1,0- - 0,8- 0,65. 3). Прозрачный раствор альбумина замораживают при минус 35 оС.и лиофильно высушивают в течение 17-22 ч. Сухой порошок растворяют в 0.3% каприлата натрия. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации. Готовый препарат прогревают при 60 о С в течении 10 ч. Методы контроля. Для контроля препарата на стадиях технологического процесса и готового препарата определяют ряд показателей: рН, содержание белка, остаточную влажность, относительную вязкость электрофоретическую однородность, пигменты крови, степень полимеризации альбумина. 100 Перспективы развития новых лекарственных форм препаратов крови До появления технологии рекомбинантных ДНК многие лекарственные препараты на основе белков человека удавалось получать в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого, а механизм биологического действия порой был недостаточно изучен. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов, в частности, иммуноглобулинов и альбумина человека, в количествах, достаточных как для диагностических целей , так и для применения в клинике. Весьма привлекательной выглядит перспектива применения для лечения различных заболеваний. моноклональных антител человека, обладающих специфическими свойствами, и пониженной иммуногенностью ко многим инфекциям. Моноклональные антитела можно использовать для облегчения доставки лекарственного вещества к месту его действия, путем:  присоединения молекулы лекарственных веществ к моноклональным антителам, специфичным по отношению к белкам, находящимся на поверхности строго определенных клеток например, опухолевых;  использования лекарственных веществ в неактивной форме, переводя их в активное состояние при помощи фермента. Чтобы такое превращение происходило вблизи клеток- мишеней, фермент присоединяют к моноклональному антител, специфичному к поверхностному антигену этой клетки. В этом случае мишенями оказываются строго определенные клетки, что позволяет использовать лекарственные вещества в гораздо меньших дозах, чем при прямом введении и, следовательно, избежать побочного действия лекарств. Существует более предпочтительный способ получения антител человека и их фрагментов - своего рода «биореактор» на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических средств зачастую достаточно одной антигенсвязвающей области антитела ( Fabфрагмента), т.е. присутствие Fc -фрагмента необязательно. Показано, что с помощью кишечной палочки можно без труда получать функциональные одноцепочечные антитела. Одноцепочечные антитела могут найти широкое применение в клинике в тех случаях, когда проявление Fc-эффекторных функций не является необходимым, а малый размер молекулы дает определенные преимущества. Показано в эксперименте, что полученные 101 таким способом Fс -иммунотоксины обладали терапевтической активностью и специфичностью. В связи с полученными позитивными данными об иммунотерапии острого лейкоза, а также созданием перевиваемых линий лейкозных клеток лимфоцитов целесообразно проведение исследований по получению иммуноглобулинов к антигенным детерминантам лейкозных клеток человека. Теоретически возможно получение иммуноглобулинов, содержащих антитела против многих вирусных и бактериальных инфекций. В этом направлении во многих странах ведутся активные научные разработки. Генноинженерные методы позволяют получать уникальные лекарственные средства, которые представляют собой комплекс иммуноглобулина, связывающегося со специфическими клеткам (например, опухолевыми) и лекарственного средства, приводящего к уничтожению опухоли. Эти подходы еще только разрабатываются, но его перспективы обнадеживают. 102 Лекция 7. Интерфероны. Традиционные и генно-инженерные методы получения интерферонов. План лекции 1.Биологическая природа интерферонов (ИФН). 2.Классификация ИФН. 3.Технологическая схема получения лейкоцитарного -ИФН. 4.Генно-инженерные ИФН. 5.Сравнительная характеристика нативных и генно-инженерных ИФН. 6.Лекарственные формы интерферонов. Литература 1.Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии - М , 1996 2.Попов В.Ф. Лекарственные формы ИФН. - М, 2002. 3.Соловьев В.Д., Бектемиров Т.А. Интерфероны в теории и практике медицины.- М., Медицина,1981 Вопросы к лекции 1.Назовите основные особенности интерферонов, классификацию, клеткипродуценты, индукторы. 2.Охарактеризуйте основные стадии получения лейкоцитарного интерферона. 3.Укажите источники промышленного получения генноинженерного интерферона, основные этапы его получения. 4.Назовите современные лекарственные формы интерферонов. 103 Термин «интерферон» появился в научной литературе, посвященной вирусологии. В 1957 году английский вирусолог Айзекс и швейцарский вирусолог Дж. Линдерман, изучая явление взаимного подавления (интерференции) вирусов в развивающихся куриных эмбрионах, опровергли связь этого процесса с конкуренцией между вирусами. Оказалось, что интерференция обусловлена формированием в клетках вполне конкретного низкомолекулярного белкового вещества, которое удалось выделить в чистом виде. Ученые назвали этот белок интерфероном (ИФН), поскольку он подавлял репродукцию вируса гриппа и многих других вирусов, создавая в клетках состояние резистентности к их последующему реинфицированию. Позднее было установлено, что ИФН представляют собой гликопротеиды с молекулярной массой 20000-30000 и высокой специфической активностью, равной или превышающей 109 на 1 мг белка. Они синтезируются in vitro и in vivo в ответ на воздействие природных (вирусы, эндотоксины, внутриклеточные паразиты) и синтетических (высоко- и низкомолекулярных) индукторов; действуют на внутриклеточные этапы репродукции широкого круга РНК и ДНК-содержащих вирусов, ингибируя трансляцию иРНК и их биосинтез. Интерфероны не токсичны, не повреждают нормальных функций клеток (энергетический обмен, синтез макромолекул), но подавляют размножение быстро делящихся клеток, включая опухолевые. Наиболее детально изученным биологическим свойством интерферонов является противовирусная активность, которая имеет следующие основные черты: универсальность – интерфероны активны против широкого круга РНК- и ДНК-содержащих вирусов; тканевая специфичность – интерфероны высокоактивны в гомологичных системах и слабоактивны или неактивны в гетерологичных; эффект последствия – даже после удаления ИФН в обработанных ими клетках в течение длительного времени сохраняется способность подавлять репродукцию вирусов; каталитический принцип действия – в процессе контакта с клетками расходуются лишь малые количества ИФН; внутриклеточная точка приложения – ИФН действует на вирусы лишь в процессе их репродукции; обязательность клеточной стадии – состояние резистентности клеток развивается лишь после определенного времени контакта ИФН с клетками; 104 необходимость полноценного метаболизма клеток – эффект действия ИФН снижается ингибиторами синтеза белка и нуклеиновых кислот; эффективность действия – даже очень небольшие дозы ИФН (106 -10-7 мг/мл) обладают противовирусной активностью. Классификация интерферонов В 70-х годах ХХ века все ИФН подразделяли на 2 типа: индуцированные вирусами (лейкоцитарный и фибробластный), которые относили к первому типу, и индуцированные митогенами (иммунный) – ко второму. В 1980 г. комитетом экспертом Всемирной организации здравоохранения была принята и рекомендована к использованию классификация, согласно которой все ИФН человека подразделяют на 3 класса. Они кодируются различными генами и имеют характерную для каждого класса последовательность аминокислот, из которых построены их молекулы. При наличии рекомбинантных вариантов ИФН их обычно обозначают римскими буквами. Таблица 5. Классификация интерферонов человека Используемое Класс ИФН Тип ИФН наименование Лейкоцитарный ИФН- I Фибробластный ИФН- I Иммунный ИФН- II В настоящее время все полученные знания о ИФН обобщены в науку «интерфенология», которая включает как теоретические аспекты этой проблемы, так и практические (медицинские и фармацевтические). В последние десятилетия произошло 4 важнейших события в интерфенологии (выделены проф. Ф.И. Ершовым,1996): -сформулировано понятие «система интерферона» и выявлены ее прямые и обратные связи с системами иммунитета и нейроэндокринной системой; -открыто множественность генов ИФН- (более 20 в клетках человека); -с помощью современных технологических приемов усовершенствованы существующие и созданы препараты ИФН нового поколения, прошли апробацию оригинальные индукторы ИФН; 105 -определены показания и противопоказания для клинического использования ИФН и их индукторов при вирусных и невирусных заболеваниях. Нас, как провизоров, наиболее интересуют два последних положения, которые мы далее разберем. Таблица 6. Технологическая схема биосинтеза ИФНТехнологическая стадия Условия ТП-1. Получение чистых Отделение плазмы от лейкоэритромассы лейкоцитов центрифугированием, фракционирование лейкомассы в присутствии осадителя – метилцеллюлозы с последующим гемолизом. При этом образуется 3 слоя: раствор метилцеллюлозы с лейкоцитами (верхний слой), лейкопленка (средний слой) и осадок эритроцитов (нижний слой). 2 верхних слоя подвергают центрофугированию и ресуспендированию осадка в питательной среде. Лейкоциты 10-20 млн/мл в среде № 199 с 5% ТП 2.Прайминг(активирование плазмы донорской крови, 3 ед./мл гепарина , метаболизма лейкоцитов)- 0,0015 ед./мл инсулина, 200 МЕ/мл нативного 2-10 ч, 37,5 С ИФН. ТП-3.Получение вируса В качестве индуктора интерфероногенеза индуктора используют вакцинный штамм вируса Сендай. Предварительное культивирование вирусов проводят в развивающихся 9-11 суточных куриных эмбрионах. Основные технологические операции: овоскопия, отбраковка, инкубирование куриных эмбрионов, введение инфекционной взвеси в аллантоисную полость с последующим инкубированием в течение 48-72 часов и стягиванием инфицированной жидкости с погибших куриных эмбрионов. Вируссодержащую аллантоисную жидкость центрифугируют. 106 ТП-4. Введение вируса- Введение вируса болезни Ньюкасла (ВБН), в индуктора .Индукция 1 ч, дозе 5 РЦД50 на 1 лейкоцит в реактор с 37,50С лейкоцитами с последующим центрифугированием при 600х д - 15 мин. Сбор осадка индуцированных клеток. ТП-5.Биосинтез.18 ч, 37,5 С Суспензионная культура в взвешенном слое. Оптимальные условия для получения высоких титров ИФНсоздаются при культивировании лейкоцитов в круглодонных колбах, накрытых фольгой, заполненных клеточной взвесью наполовину, при постоянном перемешивании. Инактивацию вируса-интерфероногена осуществляют доведением рН среды до 2,22,4 и экспозицией полуфабриката не менее 7 суток. ТП-6.Очистка интерферона Поэтапно: осветляющая, ультрафильтрация, стерилизующая фильтрация ТП-7. Контроль Контроль на стерильность, противовирусную полуфабриката интерферона. активность, специфическая безвредность, анализ на специфические примеси, токсичность, отсутствие микоплазм. ТП-8. Стандартизация Разведение препарата до требуемой препарата специфической активности и доведения значения рН. ТП-9. Розлив препарата в Розлив осуществляют с помощью ампулы. полуавтоматических дозаторов в ампулы. ТП-10. Сублимационное Замораживание препарата и сублимация. высушивание. Запайка ампул с препаратом в атмосфере азота. ТП-11. Контроль готового Контроль на стерильность, противовирусную препарата. активность, токсичность, рН, растворимость, специфическую безвредность УМО-12. Упаковка, маркировка Технологическая схема получения лейкоцитарного интерферона представлена в табл. 6. Очень важной операцией, определяющей качество готового препарата, является удаление из лейкоконцентрата примесей эритроцитов, которое 107 осуществляется на стадии 1. На стадии прайминга (стадия 2) лейкоконцентрат ресуспендируют в культуральной жидкости, которая помимо основных компонентов содержит некоторые белки сыворотки крови, без которых биосинтез ИФН практически не происходит. В качестве индуктора интерфероногенеза вирус Сендай. Культивирование вирусов проводят в развивающихся 9-11 сут. куриных эмбрионах (стадия 3). После ресуспендирования лейкоциты индуцируют аллантоисными (без оболочки) вирусами болезни Сендай, добавляемыми из расчета 100-150 ГАЕ/мл (стадия 4). После инкубации при температуре 37,5 0С, во время которой преимущественное значение имеет поддержание жизнеспособности культур и высокого метаболизма клетки при постоянстве рН, клетки отделяют низкоскоростным центрифугированием (2 000 об/мин.) в течение 40 минут. Осадок лейкоцитов ресуспендируют в питательной среде и передают на стадию биосинтеза. Оптимальные условия при выработке ИФН- ( стадия 5) создаются при культивировании лейкоцитов при 37-37,50С. Снижение температуры инкубирования до 350С и ниже, или, напротив, повышение ее до 380С и выше приводило значительному ослаблению продукции ИФН- . ИФНможет продуцироваться как в стационарных условиях культивирования, так и в культурах с постоянным перемешиванием клеток. Считается, что клетки во взвешенном состоянии более интенсивно вырабатывают ИФН- . Большое значение для выживания клеток в суспензионных культурах имеет форма сосудов, высота слоя жидкости и достаточные количества кислорода в воздушной среде. Оптимальные условия для получения титров ИФН создаются при культивировании лейкоцитов в круглодонных колбах, накрытых фольгой, заполненных клеточной взвесью наполовину, при постоянном перемешивании. Предварительная обработка лейкоцитов малыми дозами ИФН- приводила к увеличению выхода ИФН- в 3-10 раз. Активность интерферона в препаратах, полученных по вышеописанной технологической схеме , составляет 30-200 000 ЕД/мл. Аналогичные биотехнологические приемы лежат в основе получения других препаратов природных ИФН, которые отличаются по природе клетокпродуцентов и индукторов: Индукторы актиномицин ИФН- — клетки-продуценты циклогексимид фибробласты Специфические антигены или митогены ИФН- — лейкоциты от стафилоккоковый энтеротоксин здоровых доноров 108 В культуральной жидкости, собранной с клеточной культурой и представляющей полуфабрикат ИФН, содержится значительное количество примесей, в том числе и гетерологичных для человека (антигены вируса – индуктора, белки алантоисной жидкости и другие компоненты клетокпродуцентов), которые способны при введении вызвать побочные реакции и осложнения (особенно при парентеральном введении). Отсюда становиться очевидной необходимость очистки ИФН. В последние годы для очистки природных ИФН, как для клинических испытаний, так и для изучения биологических свойств, широко используется высокоэффективный метод жидкостной хроматографии. При этом смесь белков адсорбируются на каком-либо твердом носителе, а затем элюируются растворителем, при этом различные компоненты смеси элюируются с разной скоростью. Все активнее для очистки ИФН внедряются методики афинной хроматографии. Как специалисты-фармацевты, анализируя схему получения природных ИФН, нам необходимо обратить внимание на следующие моменты: -донорская кровь, компоненты которой – лейкоциты, плазма, предназначена для получения природных препаратов ИФН допускается к переработке только при отрицательных результатах контроля на СПИД, гепатиты В и С , сифилис и другие инфекционные заболевания, -для повышения безопасности препаратов ИФН на базе донорской крови в процессе производства используются методы химической инактивации, причем она должна строиться на использовании не менее двух дезинфектантов с различным механизмом действия. Таблица 7. Рекомендуемые схемы инактивации человеческих вирусов в препаратах ИФН ( Ершов Ф.И.,1996 ) Препараты Интраназальные нативного типа ИФНИнъекционные нативного типа ИФНИнъекционные ИФН- Схема инактивации Перекись водорода 1% + кислотная (HCl) обработка при рН 2,2 + 0,2 Перекись водорода 1% + хлороформ (10%) Этанол (94%, рН 4,2) + хлороформ (20%) Инъекционные нативного типа ИФН- Перекись водорода 1% + этанол (50%) 109 Генно-инженерные интерфероны Опыты по переносу генов ИФН человека в бактериальные клетки были начаты в конце 70-х годов почти одновременно в 3 научно-исследовательских группах. В институте молекулярной биологии I Цюрихского университета под руководством Вейсмана, в отделе биохимии Института по исследованию рака в Токио под руководством Т.Танигучи и в США фирмой «Genentech» под руководством Дж. Геддела. Для клонирования гена -ИФН в качестве исходного материала использовали фракцию 12 S поли (А) мРНК (информационная аденилированная РНК), полученную из клеток лейкоцитов, индуцированных вирусом Сендай. На базе информационной РНК получена комплиментарная ей ДНК, состоящая из 2 цепей. Полученная двухспиральная ДНК была расцеплена с помощью рестритаз с образованием липкого конца олиго-dG. Аналогичная операция была проведена с плазмидой с образованием липкого олиго-dcконца. С помощью лигаз осуществлено встраивание комплиментарной ДНК, содержащей информацию о структуре -ИФН в плазмиду pBR322 (рис.12). Эта плазмида несет в своем составе гены, определяющие устойчивость к двум антибиотикам: тетрациклину и ампицилину. Вставка ДНК интерферона инактивирует ген, ответственный за устойчивость к ампицилину, поэтому первичный отбор клеток, получивших гибридные плазмиды, идет по устойчивости к тетрациклину. Рис. 13. Схема клонирования генов интерферона человека 110 Для отбора нужных клонов использовали следующий метод: смесь нескольких плазмид из разных клонов, одна из которых может содержать ДНК интерферона, денатурируют и связывают с твердой подложкой. С этой ДНК гибридизируют образцы РНК, полученные из продуцирующих ИФН клеток, фильтры промывают, элюируют РНК в денатурирующих условиях и элюат инъкцируют в овоциты африканской зеленой лягушки) для выявления мРНК интерферона. Среди гибридизирующихся клонов выбран один, названный Hif-2h, имеющий вставку соответствующую размеру полного гена - ИФН. Работы по клонированию генов интерферона были повторены и развиты как названными выше авторами, так и другими группами исследователей во многих странах. В СССР первое успешное клонирование гена лейкоцитарного интерферона описано в 1982году академиком Овчинниковым, фибробластные в 1983 г. – Ю.И. Козловым, иммунного – в 1985 г. Е.Д. Свердловым. В настоящее время экспрессия генов ИФН произведена не только в клетки кишечной палочки, но и в клетки грамотрицательных бактерий (Pseudomones). Эти бактерии использованы для промышленного производства интерферона в России. Считается, что наиболее эффективно использовать для этих целей дрожжей. Дрожжи рода Saccharomyces не патогенны для человека, имеют многовековой опыт их использования. Дрожжи не подвержены лизису, легко сепарируются, используют дешевые субстраты. Биомасса дрожжей не содержит токсичных и пирогенных факторов. Весьма важным обстоятельством является также сходство секреторных механизмов дрожжей и высших эукариот, это позволяет предположить, что клонированные гены смогут давать зрелый интерферон в результате правильного процессинга. Отработана технология массового культивирования клеток-продуцентов рекомбинантного ИФН. Так для отечественного препарата « Реаферона» она включает: культивирование бактериального штамма-продуцента в ферментерах объемом 100 л с выходом 5-7х103 МЕ из 1 л культуральной жидкости, разрушение биомассы методом, позволяющим увеличить процесс с 60-70 %-ным выходом целевого продукта, предварительную очистку реаферона на ионнообменнике и очистку препарата на иммуносорбенте с моноклональными антителами к лейкоцитарному ИФН- типа 5АС. Основным продуктом рекомбинантного ИФН являются бактериальные штаммы, в цитоплазме которых синтезируется ИФН и составляет лишь доли процента от общей массы бактериальных белков. После накопления в специальных ферментерах достаточно высокой концентрации клеток их удаляют из ферментера и разрушают (лизируют). В качестве основных методов 111 лизиса используют: осмотический шок, замораживание-оттаивание, гомогенизирование, обработка детергентами. Затем с помощью последовательных процедур фильтрования, центрифугирования, ионообменной хроматографии и гель-хроматографии происходит предварительная очистка ИФН, дающая в итоге прозрачный бактериальный экстракт, в котором ИФН все еще составляет не более 1-2% от общего количества белка. Окончательную очистку препарата на иммуносорбенте с моноклональными антителами к ИФН (рис. 13). Моноклональные антитела к ИФН “ пришивают“ к гранулам носителя и помещают в хроматографическую колонку (А). Затем наносят на колонку бактериальный экстракт, содержащий рекомбинантный ИФН. С антителами связывается лишь ИФН, другие же компоненты экстракта, в том числе все бактериальные токсины, свободно проходят через колонку и удаляются промывным раствором (В). Для извлечения из колонки адсорбировавшийся на антителах рекомбинантный ИФН через нее пропускают элюирующий буферный раствор, имеющий слабокислую реакцию. При этом связь между молекулами ИФН и антителами нарушается. ИФН переходит с поверхности частиц сорбента в буферный раствор и может быть собран в виде чистого вещества, не содержащего загрязняющих белков (С). 1 2 3 6 5 4 3 2 Рис.14. Схема очистки рекомбинантного интерферона с помощью моноклональных антител 112 1 – диализат с интерфероном и другими бактериальными белками 2- интерферон 3- балластные белки 4- моноклональные антитела (МкАТ) 5- интерферон, связавшийся с МкАТ 6- слабая кислота Стремительное расширение использования рекомбинантных ИФН и параллельное сокращение в последнее время применения природных препаратов связано, главным образом, с дефицитом сырья для производства последних (донорская кровь). Однако, на современном уровне рекомбинантные ИФН – это лишь воспроизведенные отдельные субтипы ИФН (продукты) одного гена, что сказывается на потенциале терапевтической активности. Идеальный препарат должен, подобно природному, иметь их физиологически сбалансированное сочетание. Установлено, что в процессе интерфероногенеза в культурах донорских лейкоцитов синтезируется ряд цитокинов: факторы, влияющие на экспрессию антигенов комплекса гистосовместимости (ГКГ) 2-го класса ИФН- белков, тормозящих миграцию макрофагов и нейтрофилов и активирующих фагоцитарную активность макрофагов и гранулоцитов, а также цитологическую функцию лимфоцитов. Сохранение цитокинов открывают новые возможности повышения терапевтической эффективности препаратов природных ИФН. Семейство ИФН- содержит около 20 подтипов, поэтому природные препараты – Человеческий лйкоцитарный интерферон, Эгиферон, Вэлферон многокомпонентны и содержат все или по крайней мере большинство из подтипов. Кроме того, природные ИФН не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длительном многократном введении. Некоторые рекомбинантные ИФН, напротив, при введении инъекционным путем могут вызвать образование нейтрализующих или связывающих антител. Наиболее часто используются рекомбинантные ИФН- 2а (Реаферон, Роферон), ИФН- 2b (Интрон А, Реальдирон) и ИФН- 2с (Берофор), являющиеся аналогами природных подтипов с точечными мутациями в белковой структуре lis-his, arg-his, arg-arg, соответственно, которые мало влияют на активность, но существенны с точки зрения сенсибилизации. Так препараты ИФН- 2а, не являющиеся характерными для человеческой популяции, имеют большой риск вызвать сенсибилизацию и образование антител, которые в высоких титрах будут снижать их терапевтический потенциал. Каждая лекарственная форма ИФН имеет свою область применения, обусловленную ее иммунобиологическими и фармакологическими свойствами. 113 Нет Нативные ЧЛИ1 для интраназа льного применен ия 5 102 В лекарстве нной форме, МЕ Удельная, МЕ на 1 мг белка Препараты ИФН не должна вызывать явлений сенсибилизации при длительном многократном применении прерывистыми курсами. Биосинтез ИФН для приготовления различных лекарственных форм может проводиться по единой технологической схеме, но способы очистки ИФН и ее критерии должны отвечать задачам терапии. В инъекционных лекарственных формах примеси, антигенные для человека, должны отсутствовать. Их уровень в препаратах для местного пользования должен быть ниже порога сенсибилизации. Лекарственные формы ИФН- , разрешенные к медицинскому применению обобщены в табл.6 . Препараты природного ИФН- в зависимости от методов очистки можно разделить на две группы – нативные и концентрированные. Препараты нативного типа по белковому составу практически не отличается от исходных полуфабрикатов, характеризуются невысокой удельной активностью – до 1 104 МЕ на 1 мг белка, но сохраняют все цитокины, продуцированные в процессе интерфероногенеза, в их естественном соотношении. Поэтому они обладают высоким потенциалом иммунобиологического действия. Биотехнология получения концентрированных препаратов включает химическую очистку, что приводит к снижению потенциала иммунобиологического действия из-за утраты цитокинов. Однако эти препараты представляют также ценность для практического здравоохранения. Например, высококонцентрированный человеческий лейкоцитарный ИФН – ЧЛИ для инъекций – пока незаменим в ситуациях, когда необходимо ввести высокие разовые дозы (лимфобластный лейкоз в стадии обострения), а также при лечении вирусных и онкологических поражений, локализованных за гематоэнцефалическим барьером. Таблица 8 Лекарственные формы ИФНПротивовирусна я эффективность Метод Препарат Тип Назначение очистки 1 103 Профилактика и лечение гриппа 114 Гелевая фильтрация 5 102 на Сефадексе Г-25 1 103 Профилактика и лечение гриппа, лечение глазных вирусных инфекций То же 5 102 1 104 Суппозит ории с ИФН Лейкинфе рон для инъекций То же 5 102 1 105 Лечение местных вирусных поражений, ран и ожоговых травм Лечение вирусного гепатита Негативная иммуноабсорбция, гелевая фильтрация 1 104 1 104 ЧЛИ для инъекций Роданид-этанольная концентрация, негативная иммуноабсорбция Высаливание, гелевая фильтрация на Акрилексе, ультрафильтрация Многоступенчатая химическая очистка, иммуноабсорбция Альбумин стабилизатор 1– 10 106 3 106 1 104 5 103 2 108 1 106 Реаферон Рекомбинантный Интерлок Концентрированные ЧЛИ концентр ированны й для интраназа льного применен ия Интерфер оновая мазь Профилактика и лечение бактуриельных и вирусных инфекций, лечение локализованных опухолей, иммунореабилетаци я после цитостатического лечения Лечение вирусных инфекций и онкологических заболеваний Лечение местных вирусных поражений Лечение волосатоклеточного лейкоза и других злокачественных образований, рассеянного склероза, вирусных 115 заболеваний глаз То же То же Реальдеро Наполнитель2 108 1 106 н полиглюкан 1 ЧЛИ – человеческий лейкоцитарный ИФН К препаратам концентрированного типа относится и интерлок, котоорый успешно применяют для местного лечения вирусных поражений глаз. Третью группу составляют рекомбинантные ИФН, представленные в табл.6 - реафероном и реальдоном. При многих формах патологии препараты для местного применения (интреназальные капли, мазь, ректальные суппозитории, глазные пленки и др.) более эффективны, чем инъекционные. Например, при активном хроническом ВГВ использование ректальных суппозиториев, содержащих всего 100 000 МЕ ИФН- , дает такие же результаты, как и внутримышечное введение высококонцентрированного препарата в дозе 3 МЕ. Расход препарата и стоимость лечения при применении ректальных суппозиториев снижается в десятки раз. Современные рекомбинантные препараты ИФН Реаферон (человеческий рекомбинантный ИФН- 2) производства НПО «Вектор» г. Новосибирск Получен при культивировании бактериального штамма Pseudomonаs sporogenosa, содержащего в своем генетическом аппарате встроенную рекомбинантную плазмиду гена ИФН- 2 человека. Предназначен для внутримышечного, субконъюнктиванного и местного применения. Выпускается в виде лиофилизированного порошка в ампулах. Интрон А (человеческий рекомбинантный ИФН- 2b) фирмы Schering Plough – США Получен по рекомбинантной ДНК-технологии с использованием бактериальных штаммов E.coli, содержащих встроенный генно-инженерным путем ген, кодирующий этот человеческий белок. Спецификация активности 2 108 МЕ/мг белка. Форма выпуска – флаконы с активностью 1 106 3 106 5 106 10 106 Интрон А рекомендуется для лечения волосатоклеточного лейкоза, множественной рецидивирующей миеломы у пациентов, нечувствительных ко 116 всем видам химиотерапии, а также саркомы Капоши, ассоциированной со СПИДом. Введение больших доз белка сопровождается повышением температуры, появлением головной боли, расстройством желудочно-кишечного тракта (тошнота, иногда обострение гепатита), возникают нарушения в работе сердечно-сосудистой системы. На основании изучения онтогенеза системы ИФН разработан новый отечественный препарат виферон-суппозитории, включающие в себя рекомбинантный ИФН- , и препараты антиоксидантного действия. Виферон положительно зарекомендовал себя при лечении вирусных и бактериальных заболеваний у новорожденных детей: внутриутробный герпес, хламидиоз, ОРВИ, кандидоз. Определение активности ИФН Титрование ИФН в 96луночных плоскодонных планшетах с диплоидной культурой фибропластов человека М 19 в среде Игла с 10% бычьей сыворотки (105 кл/мл). Культуру в объеме 200 мкл на 1 лунку выращивают 2448 часов (до образования сплошного монослоя) при 370С в атмосфере 3% СО2. В качестве тест-вируса используют ВВС (вирус везикулярного стоматита) или ВЭМК (вирус энцефаломиокардита). За единицу активности ИФН принимают величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя на 50 % (МЕ/мл). Для каждого титрования берут пробу референсИФН с известной активностью, выраженной в международных единицах на миллилитр. Пересчет ед/мл в МЕ/мл проводится по формуле: Ар * То Ао = Тр где А0 – активность исследуемого образца ИФН, МЕ Ар – активность референс-ИФН, МЕ Т0 – титр исследуемого образца ИФН в опыте, Ед/мл Тр – титр референс-ИФН в опыте , Ед/мл. Новой и весьма перспективной группой противовирусных препаратов являются индукторы ИФН, представляющие разнородную группу высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, объединенных способностью вызывать образование ИФН. Индукторы ИФН обладают противовирусными и иммуномодулирующими и другими характерными ИФН эффектами. 117 Таблица 9. Индукторы ИФН, пригодные для клинического использования Химическая природа Препарат А. Синтетические соединения 1.Низкомолекулярные флуорены Амиксин Азотные основания Камедон 2.Полимеры поли (А) поли (У) поли (Г) поли (Ц) В. Природные соединения 1.Низкомолекулярные полифенолы (производные госсипола) 2.Полимеры двухспиральная РНК С. Официальные препараты 1.Метилксантины 2.Производные изохинолина Полудан Полигуацин Мегасин, кагоцел, рагосин, газалидон, соврац Ларифан, Ридостин Теофиллин, теобромин, эуфиллин, кофеин Папаверин, но-шпа 3.Производные имидазола Дибазол 4.Производные бензофурана Кордарон 5.Производные хромена Интенкордин 118 Лекция 8. Биотехнология растений в производстве фитопрепаратов. План лекции 1.Актуальность темы. 2.История метода. 3.Общая схема получения культуры ткани. 4.Факторы, влияющие на продуктивность культур тканей. 5.Основные условия выращивания ткани растения. 6.Достижения в области культивирования лекарственных растений. Литература 1. Бутенко Р.Г. Клеточная инженерия. – М. 1987, т. 3 2. Метаболизм вторичных, азотистых соединений в изолированной культуре ткани растений. Л.И. Березнеговская, Н.А. Бенсон, С.Е. Дмитрук и др., Томск, изд. ТГУ, 1978, с. 205 3. Журнал Phаrmazie последних лет, работы Ценка и Стокайта Вопросы к лекции 1.Что такое каллусная ткань? 2.Назовите способы культивирования каллусных тканей. Перечислите фазы роста в цикле «накопительного» периодического режима культивирования тканей. 3.Перечислите параметры культивирования тканей растений. 3.Какие существуют методы получения культур штаммов-суперпродуцентов биологически активных веществ (БАВ)? Какие БАВ синтезируют культуры раувольфии змеиной, жень-шеня, воробейника краснокорневищного, катарантуса розового 4. Назовите группы биологически активных веществ, выделенных из культуры тканей растений. 119 Введение в теорию культуры клеток тканей растений. Как известно, в настоящее время в мире отмечается повышение интереса к применению фитопрепаратов. В странах Востока на долю фитопрепаратов приходится 60-70% от общего количества лекарственных средств, в США – приблизительно 30%, а в России – 40% от общего числа выпускаемых препаратов. Вся мировая флора насчитывает 300 тысяч видов высших растений. В качестве лекарственного сырья в научной и народной медицине используется 10 тысяч. В России произрастает приблизительно 21 тысяча видов растений, из них около 230 видов лекарственных растений (около 100 видов из них после первичной обработки поступает в аптечную сеть). Производство лекарственных фитопрепаратов в значительной степени сдерживается ограниченными растительными ресурсами: -сокращение природных запасов; -сложность расширения культивирования лекарственных растений; -сокращение зарубежных поставок лекарственного сырья. Новый подход для массового получения нового вида лекарственного сырья – культура клеток изолированных тканей. Культура тканей – метод сохранения жизнеспособности органов или их частей участков тканей и отдельных клеток вне организма. Преимущество метода заключается в том что: – нет зависимости от географических метеорологических и климатических условий произрастания; -имеет место резкое сокращение времени роста и снятия «урожая»; – существует возможность стандартизации и оптимизации условий выращивания, автоматизации процесса для направленного управления биосинтезом. История метода. История развития метода культуры ткани начинается с опытов австрийского ученого Габерландта, впервые высказавшего идею о возможности выращивания из целого организма изолированных клеток. Опыты Габерландта не были успешными, но его заслуга заключается в предвидении значимости метода культуры тканей для исследователей в будущем. Первые успехи в этой области относятся к 20-м годам. В 1922 году Роббингс (Англия) и независимо от него Котте (Франция) показали 120 возможность культивирования на синтетической, питательной среде меристемы кончика корня томатов и кукурузы. В 1932-1939 годах идет совершенствование метода культуры тканей и клеток высших растений начавшиеся с работ американского исследователя Ф. Уайта, французского – Р. Готре. Оба они повторили опыты Роббингса и Котте, показав, что изолированные корни могут расти в культуре неограниченно долго, если их кончики периодически пересаживать на свежую питательную среду. Бурное развитие работ с клетками растений происходит в 70-ые годы. Значительное увеличение видов используемых растений, ткани которых выращивали in vitro. Были сделаны успехи в разработке способа получения изолированных протопластов растений, а также открытие гибридизации соматических клеток. Предпосылки. Ткани растений сохраняют способность к биосинтезу биологически активных веществ характерных для интактного растения. Это свойство определяет возможность промышленного получения ряда важных продуктов растительного происхождения. Свойство тотипотентности – способность соматических клеток растений полностью реализовывать свой потенциал развития, т. е. возможность получения целевого растения от индивидуально культивируемой клетки. Общая схема получения культуры ткани. Основным типом культивируемых растительных клеток является каллусная ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений. Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) в асептических условиях помещают на искусственную питательную среду in vitro в пробирки, колбы или чашки Петри. Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4-6 недель (в зависимости от темпов роста), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). (рис 15). Клетки различно дифференцированные переходят in vitro к сложному процессу дедифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус. В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими свойствами. Таким образом, культура ткани представляет собой периодически пересаживаемую бесформенную массу клеток, способную к неограниченному росту и синтезу специфических продуктов. Формирование каллуса длится обычно 1-2 месяца. Периодичность дальнейшего культивирования тканей 121 зависит от скорости роста биомассы. Внешне такая ткань совершенно не похожа на растение, от которого она была получена, но ее клетки несут генетическую информацию, свойственную данному виду. Процессы, происходящие в культивируемых тканях, в принципе не отличаются от процессов, идущих в тканях целого растения, в том числе сохранение способности к синтезу специфических вторичных веществ – алкалоидов, карденолидов, стероидов и др. Инкубация 25-28 ºС Каллус на агаризованной питательной среде Клетки культуры ткани в жидкой питательной среде Рис.15 Общая схема получения культуры ткани лекарственных растений (Л.А. Николаева, 1992г.) 122 Факторы, влияющие на продуктивность культур тканей. Способность культур тканей к накоплению вторичных продуктов является установленным фактом. Однако, как правило, клеточные культуры характеризуются низким содержанием искомых веществ. Только благодаря правильно разработанной стратегии получения высокопродуктивных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить лекарственным сырьем. На выход вторичных продуктов в культуре ткани влияют следующие факторы: Происхождение ткани. Обычно для введения в культуру ткани проводят поиск наиболее продуктивных растений в надежде, что эта способность будет перенесена и в культуру. Этот вопрос обсуждается до сих пор, так как экспериментальные данные довольно противоречивы. Например, культуры ткани Catharanthus roseus полученные из высокоалкалоидных растений проявляли тенденцию к синтезу большего количества алкалоидов, чем культуры, полученные от малопродуктивных растений. В то же время коробочки Papaver somniferum не являются источником сырья для получения алкалоида сангвинарина. Но в культуре ткани этого растения под влиянием элиситоров накапливается 2,9% сангвинарина и совсем не образуются изохинолиновые алкалоиды. Стрессовые факторы. Образование вторичных продуктов в культуре ткани может резко возрастать под влиянием некоторых стрессовых факторов (веществ-продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, осмотического шока, токсических ионов тяжелых Ме). Вторичные продукты некоторых растений являются фитоалексинами, т.е. их синтез в растительной жизни происходит в ответ на воздействие препаратов жизнедеятельности микроорганизмов для защиты от фитопатогенов. При обавлении к культуре ткани элиситоров (гомогената из грибного мицелия или какие либо другие продукты жизнедеятельности микроорганизмов) возрастает интенсивность синтеза некоторых ценных веществ. 123 Культура ткани Cephalotaxus harringtonia, продуцирующая в небольших количествах цефалотоксин и противоопухолевый препарат гомохаррингтонин, при добавлении к ней автоклавированных колоний гриба Verticillium dabliaе в течение 6-8 дней значительно увеличивала содержание таких алкалоидов. Клетки Catharanthus roseus после обработки в течение 18 часов гомогенатом гриба Pythium aphanidermatum (5%) увеличили биосинтез катарантина (до 0,01% от массы сухой ткани) в ферментере вместимостью 7,5 л. Усиление образования катарантина происходило в течение 1-2 дней после обработки элиситором и,главным образом, в клетках, закончивших рост. Кроме элиситоров грибного и микробного происхождения биосинтез вторичных продуктов могут стимулировать и химические вещества. Так, клетки Lithospermum erythrorhizon (воробейника краснокорневищного) после пересадки в питальную среду, содержащую в 30 раз больше меди сульфата, чем ростовая среда, резко усилили синтез шиконина. Основные технологические стадии. 1.Приготовление питательной среды. 2.Разлив питательной среды. 3.Укупорка сосудов. 4.Стерилизация среды. 5.Охлаждение. 6.Пересадка культуры ткани (в боксе для ведения стерильного процесса). 7.Выращивание биомассы в термостатированном помещении (40-80 дней). 8.Снятие биомассы. 9.Сушка биомассы. 10.Выделение из биомассы биологически активных веществ, (обычно экстракционными методами). Основные условия выращивания ткани растения. Состав питательных сред. Основными компонентами любой питательной среды для культуры тканей и клеток являются минеральные соли (макро и микроэлементы), источники углеродного питания (обычно сахароза 0,5-10-15%), витамины (тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота) и регуляторы роста (ауксин, цитокинин), которые применяются на первых этапах образования первичной каллусной ткани. В качестве питательной среды для выращивания культуры тканей растения наиболее часто используется среда Мурасиге-Скуга, состав которой представлен на табл. 10. 124 Компонент Количество, мг/л Назначение NH4NO3 1650,000 Макроэлементы KNO3 1900,000 CaCl2*2H2O 440,000 MgSO4*7H2O 370,000 KH2PO4 170,000 H3BO3 6,200 Микроэлементы MnSO4*4H2O 22,300 CuSO4*5H2O 0,025 CoCl2*6H2O 0,025 ZnSO4*7H2O 8,600 NaMoO4*2H2O 0,250 KI 0,830 Na2 ЭДТА *2H2O 37,300 Тиамин*HCL 0,300 Витамины Пиридоксин*HCL 0,500 Никотиновая кислота 0,500 Мезоинозит 100,000 Β-индолилуксусная 2,000 Фитогормоны кислота Кинетин 0,200 Глицин 2,000 Аминокислота Сахароза 30000,000 Углевод FeSO4*7H2O 27,800 Хелат железа Как правило, начиная работать с новым объектом, авторы модифицируют состав стандартных сред, особенно часто варьируя концентрацией и набором органических компонентов, учитывая биохимические пути синтеза продуктов вторичного метаболизма в растительной клетке. Физические условия выращивания. температура 25-30 С (24-27 С); темнота (вторичный синтез) обычно тканевая культура выращивается в темноте; аэрация; условия стерильности (асептические). Критерием роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы, при этом модельная кривая клеточных культур имеет S-образную форму (рис.16). 125 На ней различают латентную (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулюма (трансплантанта – часть суспензионной, каллусной, культуры, используемая для пересадки в свежую среду) не наблюдается ни по одному из параметров (1). Далее следует экспотенциальная фаза, характеризующаяся ростом с ускорением (2), линейная, в которой скорость роста постоянная (3), фаза замедленного роста (4), стационарная фаза (5) и фаза деградации клетки (6). При этом синтез вторичных продуктов, которые, как правило, и являются лекарственными веществами (алакалоиды, гликозиды, полифенолы,терпеноиды, эфирные масла, полисахариды, витамины и т.д.) возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной фазе. Методы выращивания. Культуры растительных тканей могут выращиваться: -поверхностным методом. При этом способе культура каллусных тканей культивируется на поверхности полутвердой агаризованной среды (агар-агар в концентрации 0,6-1,0%), или с применением других желирующих полимеров. (используется для введения растения в культуру). Число клеток (сухая или сырая масса) t, сут. Рис.16. Модельная кривая роста в цикле периодического выращивания -суспензионным методом. При нем отдельные клетки, небольшие группы или достаточно крупные агрегаты (50 клеток) выращивают во взвешенном состоянии в жидкой среде. (это более удачная модель для исследования и промышленного внедрения). 126 Способы выращивания. В большинстве микробных систем продукты, синтезируемые микроорганизмами, продуцируются из клетки непосредственно в среду, в связи с чем эффект обратного ингибирования продуктов реакции очень мал. В культуре ткани, как правило, при увеличении концентрации продуктов в клетке выше пороговой, срабатывает эффект обратного ингибирования, вследствие чего дальнейшее накопление веществ прекращается. Данное явление часто обуславливает низкое содержание искомых веществ в клетках культуры. Чтобы избежать этого эффекта, рядом исследователей неоднократно предпринимались попытки удалять продукт реакции по мере его синтеза из клетки. Так, для увеличения проницаемости клеток Cinchona lengeriana в культуре и ускорения выхода внутриклеточных алкалоидов пытались применить диметилсульфоксид (ДМСО). Однако ДМСО оказался непригодным для индукции выделения алкалоидов при биотехнологической эксплуатации C. ledrgeriana. Даже при высокой концентрации ДМСО выращивание алкалоидов протекало медленно и большинство обработанных мембран не восстанавливалось. Для некоторых суспензионных культур вполне экономичным оказался способ выращивания в виде двухфазной системы. Такая культура состоит из водной среды (питательная среда с растущими клетками) и нетоксичной липофильной фазы (триглицериды или парафины). В результате липофильные вещества, синтезируемые клетками в процессе их роста, переходят в липофильную фазу. Например, корончатогалловая опухолевая суспензионная культура Matricaria chamomilla росла в двухфазной системе, состоящей из водного раствора питательной среды и источника липофильной фазы (триглицерид - миглиол) в течение 22 дней. В результате нерастворимые продукты, синтезируемые культурой ткани ромашки, накапливались в среде миглиола в концентрации, в 60 раз выше, чем в однофазной системе. Аналогичные результаты получены по шиконину - веществу, выделяемого методом биотехнологии из культуры клеток воробейника краснокорневищного. Шиконин является прекрасным антисептиком и красителем и широко используется в текстильной, пищевой промышленности, в парфюмерии и медицине. Красящий продукт нафтохинон шиконин , продуцируемый суспензионной культурой Lithospermum erythrorhizon , не растворяется в воде , но растворяется в некоторых органических растворителях. Это свойство шиконина использовано при выращивании ткани в двухслойной культуре. В качестве органического растворителя был взят гексадекан, который 127 растворяет 81 % синтезируемого клетками шиконина. Причем культура прекращала синтез шиконина, если он из клеток не переходил в органический слой. Селекция. Промышленное применение культур тканей в качестве лекарственного сырья предполагает исследования высокопродуктивных и стабильных клонов. Известно, что культивирование клеток in vitro может сопровождаться значительным генетическим разнообразием. Речь идет о так называемой самостоятельной изменчивости, которая возникает при длительном культивировании каллуса. На применимости клеток в культуре in vitro основана селекция штаммов, обеспечивающая большой выход ценных продуктов метаболизма растительной клетки. Так, при клонировании суспензионной культуры клеток паслена Ценк выделил линии, накапливающие больше 3% соламидина. Кузовкина с сотрудниками получила штамм клеток руты душистой, содержащей в 20 раз больше алкалоида рутокридона по сравнению с растением. Успех в селекции в значительной мере зависит от используемого метода количественной оценки селекционного материала. Для количественной оценки содержание аймалина культуры ткани Rauwolfiа serpentinа разработан быстрый и несложный экспресс-метод, основанный на сравнении интенсивности окраски пятен сока каллусных культур, нанесенных на фильтрованную бумагу и обработанных цветным реактивом, со шкалой стандартов. Метод позволяет исключить заведомо неперспективные варианты и сократить количество культур, подлежащих окончательной проверке. В 70-х годах для анализа алкалоидов катарантуса и раувольфии были применены радиоиммунохимический (RIA), а позднее иммуноферментный метод диагностики, что позволило значительно повысить эффективность отбора. Селекция в культуре ткани проводится различными методами, но по своим признакам все методы можно разделить на следующие группы: непосредственный отбор форм оказавшихся практически ценными (по результатам анализов или тестов); селекция колоний определенного морфологического типа; селекция мутантов, устойчивых к токсичным предшественникам или конечным продуктам; выделение ауксотрофных мутантов; получение мутантов, устойчивых к аналогам аминокислот или изотопных оснований; 128 получение штаммов путем обработки клеток химическими веществами, инфузирующими высокую плотность; селекция устойчивых рекомбинантных штаммов и др. Опыт селекционной работы с культурами тканей продуцентов свидетельствует о том, что при использовании мутантов, селективных сред и высокоэффективных способов отбора возможен успех в селекции штаммов. Так, путем обработки суспензии клеток Diosoria deltoidea мутагеном Nнитрозометилмочевиной была получена серия мутантов, различающихся по спектру стероидных соединений и количеству диосгенина. После воздействия мутагена этиленимина на клетки Rauwolfia serpentinа была выделена клеточная линия, отличающаяся повышенным содержанием алкалоида. Сообщалось о выделении клеточных линий у Cathаranthus roseus, устойчивых к 5-метилтриптофану и обладающих способностью накапливать в 40-50 раз больше триптофана, чем в исходной культуре. Однако стимуляции синтеза индольных алкалоидов при этом не происходило, что, по-видимому, связано с низкой активностью ферментно-триптофандекарбоксилазы. Перенос клеток в среду с 8% сахаром приводил к увеличению активности (более чем в 12 раз) триптофандекарбоксилазы и свободного триптамина и одновременно к продуцированию больших количеств аймалицина. Успешной оказалась селекция, основанная на отборе окрашенных участков культуры ткани. Известно, что окраска ткани растений является наследственным признаком, связанным с их химическим составом. Связь между окраской тканей и их химическим составом была использована в селекции высокопродуктивных штаммов, содержащих антоцианидины. В результате чего их количество увеличилось в три раза. В результате клонирования и отбора желтых участков каллуса были получены высокоалкалоидные культуры ткани – продуценты берберина. Важным условием биотехнологического использования культур тканей является их стабильность, гарантирующая стандартность лекарственного сырья. Такие культуры ткани – суперпродукты, как Morinda citrofolia, Animi visnago, Coleus blumei, Rauwolfia serpentina на протяжении многих лет зарекомендовали себя как устойчивые. Но для многих культур тканей, например Catharanthus roseus, единственным путем сохранения высокой продуктивности является регулярный поддерживающий отбор, их нестабильность – серьезное препятствие к промышленному исследованию. Научные достижения в области культивирования лекарственных растений. В настоящее время в культуру ткани введено около 50 растений, при этом в ряде случаев содержание соединений в тканях, выращенных in vitro, равно или выше, чем их содержание в тканях исходных растений (см. табл.11). 129 В России работы были начаты в 1957 году Р.Г. Бутенко в Институте физиологии растений АН СССР. В настоящее время данный институт является координатором работ по культуре тканей растительных клеток в России. На базе института создается банк растений (криобанк). Наиболее углубленные работы с культурой тканей растений ведутся в СанктПетербургском химико-фармацевтическом институте, Томском медицинском институте, Всесоюзном институте лекарственных растений, ВНИИ биомаш, НПО «Биотехника». Таблица 11 Перечень некоторых растений – сверхпродуцентов биологически активных веществ (БАВ), Zenk X. 1978 г. Наименование БАВ Панаксозиды Вид растения Содержание в интактном растении, % от массы сухого вещества Panax ginseng 0,5 БАВ в культуре ткани вещества в % от сухой массы 22 Увеличение выхода по сравнению с растением (кол-во раз) 4 Розмариновая кислота Шиконин Coleus blumеi 3,0 15 5 Lithospermum erythroronizon 1,5 12 8 Антрахиноны Cassia tora 0,6 6 10 Аймалицин Catharantus roseus Nicotiana tabakum 0,3 1,8 0,003 0,036 12 Убихинон-10 3 Аймалин Rauwolfia serpenina 0,3 1,5 5 Берберин Thalictrum minus Coffea arabica 1.0 14,0 14 1,6 1,6 1 Кофеин 130 В качестве примера рассмотрим результаты научных разработок сотрудников СпбХФА по созданию противоаритмического препарата аймалина, выделяемого из корней раувольфии. До настоящего времени поставки импортного сырья были ограничены. Была поставлена задача получить культуру ткани раувольфии , пригодную для промышленного выделения противоаритмического препарата – аймалина. С этой целью в институте физиологии растений под руководством Р.Г. Бутенко в 1964 году были получены культуры ткани от нескольких видов раувольфии – R. Verticillata, R. Coffa, R. Canescens, R.serpenina, среди которых наиболее богатой азотистыми основаниями и наиболее быстро растущей оказалась культура ткани раувольфии змеиной стеблевого происхождения (штамм Рс). При выращивании in vitro в клетках раувольфии отмечено резкое снижение способности к синтезу вторичных метаболитов (в частности, алкалоида аймалина). Для полной реализации генетической информации, относящейся к вторичному обмену, потребовалось использование биохимических мутантов, а также специфических условий культивирования. Исследования по обработке стеблевой ткани раувольфии змеиной различными дозами мутагена – азотистого иприта, позволили выделить клеточную линию А, содержащую 1,2% суммы алкалоидов и 0,48% алкалоидов группы индолина, основным из которых был аймалин. Дальнейшие исследования по обработке клеточной ткани различными мутагенами и отбору клеток, адаптированных к росту на определенных питательных средах, позволили получить штаммы, содержащие до 0,901,20% аймалина в абсолютно сухом сырье. Высушенная ткань представляет собой пористые сравнительно мягкие кусочки неопределенной формы с неравномерно бугристой поверхностью. Размеры кусочков до 15 мм в диаметре, цвет от светло-желтого до темно-коричневого, т.е. по структуре существенно отличается от природного материала. Сравнительными химическими, спектральными и фармакологическими исследованиями доказано, что аймалин из культуры ткани раувольфии змеиной идентичен аймалину, выделяемому из природного сырья. Однако известный способ выделения аймалина из корней и корневищ раувольфии змеиной оказался неприемлем для выделения алкалоида из культуры ткани раувольфии змеиной. 131 Для получения аймалина из культуры ткани раувольфии змеиной сотрудниками института разработан новый способ, защищенный авторским свидетельством. В основе выделения аймалина лежит вторая модификация экстракционного метода, включающая перколирование биомассы культуры ткани, предварительно увлажненной концентрированным раствором аммиака, органическим раствирителем дихлорэтаном с последующей экстракционной очисткой 5% раствором орто-фосфорной кислоты и бензолом. Стадия опытно-промышленного внедрения осуществлена на Харьковском фармацевтическом заводе «Здоровье трудящихся» (ХХФЗ) (ХНПО «Здоровье») в 1990 году. Корень женьшеня культивируется 4-5 лет. Культура ткани вырастает за 40-50 дней. В культуре ткани женьшеня обнаружены все 14 панаксозидов корня женьшеня, установлена биологическая активность препаратов из природного сырья и из биомассы. Сравнительная характеристика химического состава биомассы культуры ткани и корней жень-шеня представлена в табл. 12. Таблица 12 Сравнительная характеристика химического состава биомассы культуры ткани и корня жень-шеня,%. Состав Биомасса культуры Корень ткани Азот общий 4,82 2.73 Белковый 1.18 1,68 Липиды 1,61 2,34 Редуцирующие вещества 2,38 - Сахароза 1,08 - Крахмал 5,40 3,07 Гемицеллюлоза 4,46 6,03 Пектиновые вещества 9.84 10,27 Панаксозиды (А-G) 3,31 3,12 132 В настоящее время на объединении «Санитас» налажен выпуск настойки из культуры ткани женьшеня, стоимость которой 2 раза ниже выпускаемой до настоящего времени. На «Санитасе» проводится также работа по внедрению препаратов адаптогенного действия из культуры ткани панакса пятилопастного (произрастающего только в Канаде и США) и тропического растения полиоциасса. В качестве перспективных растений для внедрения в промышленное производство методом культуры ткани можно рассматривать женьшень, стефанию гладкую, катарантус розовый, диоскорею кавказскую и дельтовидную (перспективный вид сырья для синтеза гормональных препаратов). Также можно рассмотреть для внедрения раувольфию змеиную и рвотную, строфант, пилокарпус, ипекакуану, чилибуху, физостигму, мак снотворный как источник изохинолиновых алкалоидов. 133 Лекция 9. Биотехнология бактериофагов План лекции. 1. Бактериофаги – как иммунобиологическое лекарственное средство: историческая справка, природа, классификация, механизм действия, оценка активности, фармакокинетика, достоинства, недостатки. 2. Особенности производства бактериофагов (БФ) и их лекарственных форм. Показатели стандартизации ГЛС бактериофагов. 3. Ассортимент лечебно-профилактических БФ и их лекарственных препаратов. Перспективы развития препаратов БФ. Литература. 1. Д`Эрелль. Бактериофаг. Гос.изд., 1925. 2. Адамс М. Бактериофаги. М., ИЛ, 1961. 3. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М., Наука, 1968. 4. Красильников А.П. Справочник по антисептике. Минск, 1995. Вопросы к лекции 1. К какой группе биообъектов относятся бактериофаги? Приведите классификации бактериофагов и укажите их достоинства и недостатки. 2. Разъясните технологическую схему производства бактериофагов. 3. Дайте характеристику методу определения специфической активности бактериофагов. 4. Выделите технологические особенности получения лекарственных форм бактериофагов. 134 Появление патогенных бактерий, устойчивых к большинству антимикробных препаратов, является в настоящее время большой проблемой, связанной еще и с вызываемой этими препаратами иммуносупрессией пациентов. Человечество возвращается в доантибиотическое время для поиска альтернативной антиинфекционной терапии с привлечением современных методов биотехнологии. Задолго до открытия и использования антибиотиков, было предложено использовать против бактериальных инфекционных болезней специфическую группу вирусов – бактериофаги (БФ). Именно с ними связаны перспективы рациональной антибактериальной профилактики и терапии. БФ–вирусы, способные проникать в бактериальную клетку, размножаться в ней, вызывать её лизис или переход в состояние лизогении (фагоносительства). История открытия. Согласно современным представлениям, бактериофаги (или бактериальные вирусы), вторгаются в бактериальные клетки и в результате литического действия прерывают бактериальный метаболизм, а сами бактерии подвергают лизису. Подобное положение было не всегда бесспорным. Эрнест Ханкин (британский бактериолог) сообщил в 1896г. об антибактериальном воздействия против V. cholerae стерильного фильтрата из воды рек Ганг и Джумна в Индии. Он предположил, что неопознанная сущность, проходящая через стерилизующий фарфоровый фильтр и лабильная к высокой температуре, была ответственна за ограничение распространения эпидемий холеры. Двумя годами позже (в 1898 г.), русский бактериолог Н.Ф. Гамалея наблюдал подобное явление при работе с бациллой сибирской язвы, назвав причиной лизиса бактериальных культур действием особых веществ бактериолизинов. Однако ни один из этих ученых далее не углубил свои исследования и не докопался до сути явления бактериолизиса. Эдвард Творт (Twort), бактериолог из Англии, в 1915 г. сообщая о подобном явлении, выдвинул гипотезу, что, может быть, благодаря воздействию фермента образуются «негативные» колонии в бактериальных культурах. Однако по различным причинам, включая финансовые трудности, и он не утвердил свое открытие. Официально бактериофаги обнаружены Феликсом Д, Эреллем (d'Herelle), французско-канадским микробиологом (Ин-т Пастера в Париже.) Открытие или переоткрытие бактериофагов Д, Эреллем часто связывают с исследованием эпидемической вспышки дизентерии среди французских солдат в предместьях Парижа в июле - августе 1915 г.( Д, Эрелль доложил о полученных результатах в сентябре 1917 г.). В отличие от Hankin и Twort, d'Herelle предположил, что 135 явление лизиса бактериальных культур было вызвано вирусом, способным к паразитированию в бактериях. Название «бактериофаг» было также , предложено Д Эреллем (от слова «фаго – пожирать» с греческого). Он полагал, что бактериофаги – действующие вирусы, а не «ферменты», как считали многие из его современников. Многие ученые называли открытие бактериофагов « Twort-d'Herelle явление », а позднее – «явление бактериофага». Немного позже открытия, в Париже в 1919 г Д, Эрелль стал использовать бактериофаги, чтобы ликвидировать дизентерию. Это была первая попытка использовать бактериофаги в терапевтических целях. Эффективность применения бактериофага была подтверждена впоследствии, когда три пациента, имеющие бактериальную дизентерию, были также вылечены с применением одной дозы фага. Позднее в 1926-27 г.г. Д, Эрелль использовал другие бактериофаги для лечения тысячи людей, болеющих холерой в Индии. Кроме того, отдельные компании начали активное коммерческое производство бактериофагов против различных бактериальных патогенов, а врачи - лечить ими больных (стафило- и стрептофаги, 1921 г., Брийонг и Майсин). Промышленное производство бактериофагов. Коммерческая лаборатория Д'Эрелля в Париже выпускала по крайней мере пять бактериофагов против различных бактериальных агентов. Эти фаги были названы Bacteґ -coli-phage, Bacteґ -rhinophage, Bacteґ -intesti-phage, Bacteґ -pyophage, и Bacteґ -staphy- phage. Терапевтические бактериофаги также производились в то время в США. До 1940 года, компания Eli Lilly (США) производила семь различных бактериофагов для использования на людях, включая фаги против Staphylococci, Streptococci, Escherichia coli, и других бактериальных патогенов. Эти препараты представляли собой фаголизаты бактерий, были стерильны и специфически целенаправленно лизировали определенные бактерии (например, Coli-лизат, Ento-лизат, Neiso-лизат, и Staphylo-лизат) или те же самые препараты в желеобразной форме (например, Ento-гель, и Staphylo-гель). Они использовались для лечения абсцессов, гноящихся ран, вагинитов, острых и хронических заболеваний дыхательных путей, ЛОР-органов. С появлением антибиотиков, промышленное производство терапевтических бактериофагов было окончательно прекращено на Западе. По заданию Американской медицинской ассоциации Monroe Eaton и Stanhope Bayne-Jones (США) прорецензировали 150 документов по терапии бактериофагами и в 1931-34г. г. издали детальную рецензию по фаготерапии. Авторы заявляли: основной постулат «теории Д, Эрелля, что бактериофаги – это живущий вирусный паразит бактерий, не был доказан. Напротив, факты указывают, что этот материал - неодушевленный, возможно фермент». Авторы 136 далее заявляли, что окончательно не доказано, что бактериофаг проникает внутрь живой бактерии и уничтожает её в результате литического воздействия. В настоящее время ясно, что вышеупомянутое заключение доклада было неправильное. Однако в те годы этот доклад нанес серьезный удар по интересу западных ученых в оценке полезности бактериофагов для терапевтических целей и это имело сильное отрицательное воздействие на финансовую поддержку терапевтических исследований бактериофагов. Кроме того, 7 годами позже, второй неблагоприятный доклад был издан Альбертом Круегером и Джейн Скрибнер как продолжение к докладу Eaton–Bayne-Jones. Авторы оправдали потребность писать вторую рецензию тем, что «накопилось много подробной информации относительно бактериофага непосредственно и клинической его эффективности». Однако заключения авторов относительно природы бактериофагов также был неправильны, так как они заявляли, что «это является белком высокого молекулярного веса и, кажется, сформировано из предшественника внутри бактерии». Кроме того, вскоре антибиотики стали широко доступными, что тоже способствовало снижению интереса к фагам на Западе Но по-прежнему продолжались исследования в Советском Союзе. Бактериофаги использовали в терапевтических целях — вместе с или вместо антибиотиков — (брюшнотифозный фаг с 1929 г., дизентерийный – с 1930 г.). Активно изучали терапевтический эффект бактериофагов и создали производство этих препаратов в Институте бактериофагов, микробиологии и вирусологии Грузинской АН. (Институт Eliava был заложен в 1923 г.Giorgi Eliava - видным грузинским бактериологом). Институт Eliava был одним из самых больших в мире, занятом производством и изучением бактериофагов. В институте работало приблизительно 1200 исследователей и персонала. Производились бактериофаги против дюжины бактериальнах агентов, включая Staphylococci, Pseudomonas, Proteus, и многих других патогенов. Польский Институт Hirszfeld был заложен в 1952 году и активно изучал терапию бактериофагами, начиная с 1957, когда бактериофаги использовались для борьбы с болезнями, вызванными Shigella. Бактериофаговая лаборатория института занималась созданием бактериофагов для лечения сепсиса, фурункулеза, легочных, урологических болезней и для профилактики послеоперационных и посттравматических осложнений. Во многих случаях, бактериофаги использовались против полирезистентных бактерий, которые были устойчивы к антибиотикам. В настоящее время Производство бактериофагов в России сосредоточено в Москве (НИИВС им. И.М. Мечникова; ГНИИСК МБП им. Л.А. Тарасевича), 137 в Уфе (в составе НПО «Иммунопрепарат» дочерняя компания «Биофаг»), в Нижнем Новгороде (на базе ГНИИЭМ частная компания «Имбио») и Перми (НПО «Биомед»). Отдельные фаги выпускают на предприятиях Хабаровска и Саратова. Интенсивные фундаментальные исследования по расширению выпуска новых штаммов бактериофагов проводят в Государственном научном центре прикладной микробиологии. Из стран СНГ научная и производственная база сохранена в Грузии (Институт Элиава) [Чанишвили Т.Г.,1983], а также и в других странах –– в Польше, Швейцарии, Франции и Канаде [Иванов А.В., 2000]. ПРИРОДА ФАГА. Как фармакологическое средство бактериофаги представляют собой большую и разнородную группу фильтрующихся вирусов размером 40 – 90 нм, паразитирующих на практически всех известных бактериях. В профилактических и терапевтических целях используют только ЛИТИЧЕСКИЕ («вирулентные») штаммы фагов, вызывающие у соответствующих бактерий продуктивную литическую инфекцию, которая приводит к гибели бактериальной клетки и появлению многочисленной новой генерации. В структурном отношении фаги представляют собой комплекс из головки в белковой оболочке с ДНК и отростка, состоящего из стержня с чехлом и базальной пластинки с нитями [Тихоненко А.С.,1968]. Классификации фагов. Имеется несколько классификаций: по видам паразитирования на микроорганизмах–субстратах: на бактериях, грибах, водорослях и простейших (наиболее изучены БФ и актинофаги - вирусы актиномицетов); по природе и завершенности процесса – литические (вирулентные) и лизогенные; по сферам применения – терапевтические, профилактические, диагностические и биотехнологические (генно-инженерные); по видам бактерий – стафилококковый, стрептококковый, дизентерийный и т.д. Механизм действия: Литическое действие терапевтических бактериофагов связано с уничтожением специфических бактерий, при этом фаги проникают внутрь клетки, размножаются и вызывают лизис бактериихозяина (то есть, через литический цикл). По механизму противомикробного действия фаги относят к биологическим антисептикам прямого повреждающего действия на бактерии [Красильников А.П., 1995]. 138 Специфическая активность. Количественно оценивают число фаговых частиц в единице объема (по Д, Эреллю) и по степени разведения исходного препарата (по Аппельману – отрицательная степень десятичного разведения от 10–2 до 10-9 или в долях единицы последнего десятичного разведения – двухслойный метод подсчета «негативных» колоний по Грациа). Активность современных препаратов БФ в НД оценивают по Аппельману: в зависимости от вида ЛФ и способа применения интервалы составляют от 10–3 до 10-5. Основными положительными свойствами БФ являются их высокая противомикробная активность, свойство самокопирования (способность к накоплению в организме), узкий спектр противомикробного действия, относительно длительное время действия одной дозы, полная безвредность для пациента, самоограничение (естественное удаление из организма после исчезновения чувствительных бактерий) и экономичность производства. Дополнительные достоинства: Фаготерапия без ограничений может сочетаться с назначением других бактериофагов, антисептиков, антибиотиков, иммунопрепаратов и других фармакологических средств. Фаговые частицы и продукты фаголизиса бактерий даже при длительном применении не оказывают повреждающего действия на макроорганизм и не вызывают аллергии. Более того, продукты фаголизиса оказывают специфическое и неспецифическое действие на иммунную систему пациента, усиливая противоинфекционный иммунитет. В отличие от других препаратов, снижающих во времени концентрацию внесенной дозы, количество фаговых частиц после внесения в биотоп (штамм чувствительных бактерий) резко увеличивается. Многие фаги сохраняют активность в организме несколько дней, в связи с чем в большинстве случаев отпадает сложнейшая для химиотерапевтических средств проблема длительного поддержания терапевтической концентрации препарата. Специально адаптированные БФ можно применять для профилактики эпидемий, санитарной обработки больниц и индивидуального лечения заболеваний, вызванных полирезистентными возбудителями. Главный относительный недостаток фагов заключается в их высокой специфичности. Чувствительность популяций бактерий одного и того же вида, обитающих у микросообществ людей, проживающих на разных территориях, к производственным фагам колеблется от очень высокой восприимчивости до полной устойчивости. Этот недостаток частично преодолевается или выращиванием фагов на смеси бактериальных популяций из разных биотопов, или производством фагов, адаптированных к региональным расам бактерий [Ефимова Н.П., 2001]. Предварительная 139 проверка возбудителей на чувствительность к производственному фагу может существенно повысить их эффективность [Захарова Ю.А., 2003]. К относительным недостаткам фагов относят также резкое снижение высеваемости возбудителя при бактериологической диагностике заболевания и высокий риск контаминации препаратов заносными микробами, несмотря на присутствие в готовой форме консерванта (обычно хинозола), что мало приемлемо, например, для детской практики. Кроме того, широкое применение фагов ограничено малым числом коммерческих препаратов и их лекарственных форм [Красильников А.П., 1995]. Фармакокинетика. В течение длительной истории использования бактериофагов как терапевтических агентов они применялись в дозе от 10-5 до 10-11 перорально, ректально, парентерально и местно (кожные покровы, глаза, ушная, носовая слизистая оболочка, и т.д.) в тампонах, как аэрозоли или внутриплевральные впрыскивания. Фармакокинетика бактериофагов при различных способах введения изучена достаточно полно [Азлецкая А.Е.,1950]. При подкожном введении морским свинкам фаг быстро появлялся в крови, селезенке, моче и кишечнике, но через 8 – 24 часа не определялся в почках, легких, мозгу и в кишках. В селезенке же и лимфатических железах фаг мог быть обнаружен даже через 10 – 17 дней. Плацента сильно задерживает фаг, только после внутрисердечного введения высокоактивного фага беременным самкам он проникает в небольших количествах в кровь плода, но уже через 3 часа полностью исчезает. После скармливания фага самкам он вообще не определяется у плода, хотя в испражнениях животного фаг можно еще обнаружить через сутки. Бактериофаг хотя и проникает через гематоэнцефалический барьер, но в чрезвычайно небольших количествах. Парентеральное введение фагов сопровождается специфическим иммунным ответом вследствие антигенных свойств самих фагов и продуктов фаголизиса (Раутенштейн Я.И., 1955). Причем антитела против фагов (антифагины) появляются в крови лишь после 10-го дня ежедневных инъекций и не приводят к разрушению фаговых частиц, а лишь задерживают адсорбцию последних на чувствительных клетках [Ермольева, 1964]. При парентеральном введении (в вену и в ткани) больным людям продолжительность пребывания фагов в крови была 5 часов, в ране до 12 часов [Ермольева, 1964]. У здоровых лиц после однократного перорального приема (30 мл) уже через 1 час в крови обнаруживаются фаги, а через 2 часа фаги массированно 140 выделяются с мочой. Без наличия соответствующих чувствительных бактерий (при профилактике заболеваний) длительность пребывания фагов в организме составляет 1 – 3 дня [Иванов А.В., 2000]. При наличии тропных (т. е. чувствительных) к фагу бактерий наблюдается нарастание количества фаговых частиц до максимума через 8-10 часов даже после однократного приема с длительностью выявления в течение 6-7 суток [Парфенюк Р.Л. и соавт., 1998]. Ректальное введение фагов в сравнении с пероральным сопровождается более длительным сохранением повышенных концентраций (до двух раз) при введении меньших доз. По мнению авторов, это связано с отсутствием инактивирующего действия желудочного сока [Функнер Е.В. и др., 2000]. Местное применение фагов также известно со времени их открытия. Особенно эффективно использование поливалентного комбинированного фага при лечении ожогов и ран или острой гнойной инфекции. Особенности производства БФ и их ЛФ. Стандартизация ГЛС БФ. Технологическая схема получения БФ в целом совпадает с таковой для большинства МИБП. ВР-1, -2, -3. Подготовка помещений, воздуха, оборудования и персонала обычные по GMP. Причем все сотрудники проходят специфическую вакцинацию заблаговременно и подвергаются периодическим медосмотрам. При подготовке сырья (ВР-4) готовят питательные среды (обычно мясные МПА, МПБ, бульоны из отходов крови, казеиново-кислотные или полусинтетические) и посевной материал (производственные штаммы бактерий, ежегодно обновляемые за счет свежевыделенных, «маточные» культуры БФ, постоянно адаптируемые к устойчивым штаммам бактерий). Промышленное культивирование биомассы проводят реакторным глубиннодинамическим способом, при освоении новой продукции используют твердые среды в плоских бутылях («матрацах»). Отделение целевого продукта от биомассы проводят центрифугированием, многократным фильтрованием (фильтрат фаголизата культур), в т.ч. баромембранным методом. Очищают и концентрируют фаголизаты высаливанием (сульфатом аммония или натрия), колоночной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или ультрафильтрацией на полых волокнах (типа ВПУ-15 с размером пор 15 КДа) в разделительных аппаратах 141 АР-1, -2. Стерилизуют фильтраты фаголизатов на микропористых мембранах с размером пор 0,22 мкм. Приготовление ЛФ БФ ведут с учетом стабильности конкретных фагов. При этом лимитирующими факторами выступают параметры процессов формообразования или стуктурирования ГЛФ: температура (50±5 оС), реакция среды (рН 7,1÷7,5), глубина вакуума или остаточная влажность при сушке. рН сахаров-стабилизаторов при лиофилизированной сушке БФ: глюкоза и сахароза из-за сдвига рН среды в кислую сторону (рН 5-6) дестабилизируют фаги при сублимационной и вакуумной сушке, а лактоза и маннит – сохраняют активность. При сушке в вакууме (ниже «– 0,9 атм.») стрептофаг полностью сохранял активность, а в присутствии воздуха при разгерметизации влажной массы – инактивировался. Стафилофаг при остаточной влажности менее 1 % всегда инактивировался. Другая группа факторов: Вспомогательные Вещества при производстве ЛФ. В группе наполнителей предпочтительны соли кальция или магния (глюконат, карбонат, фосфат кальция), поскольку они способствуют адгезии фагов к стенке чувствительных бактерий в культуре. Почти все ПАВ, антисептики и консерванты инактивируют БФ. И только в группе производных 8-оксихинолина обнаружен инертный к фагам хинозол, входящий в состав большинства жидких БФ. Важная группа ВВ: органические растворители. Их влияние зависит от индивидуальной стабильности отдельных БФ. Наиболее лабильны – коли-, стафило- и стрептофаг, наиболее устойчив – клебсифаг (даже в кислой среде желудка он минимально снижает активность). Схема производства бактериофагов представлена на табл. 13 142 Схема получения бактериофагов Гидролизат казеина Обработка гидролизата Приготовление питательной среды Приготовление казеиновокислотной среды Подготовка производственных штаммов Приготовление маточных бактериофогов Получение бактериофага Приготовление посевных культур Производственный засев Инкубация посевов Предварительная фильтрация бактериофага Очистка бактериофага Стерилизующая фильтрация бактериофага Контроль препарата на производстве Розлив бактериофага Маркировка, упаковка, отгрузка на карантинный склад 143 Показатели стандартизации ГЛС БФ: 1-2. Вводная часть, описание Подлинность по специфическому лизису соответствующих видов бактерий одновременно с определением специфической активности Средняя масса (для таблеток и суппозиториев) по общим статьям ГФ Распадаемость (для таблеток – чаще кишечнорастворимых). Растворимость или время полной деформации (для свечей и всех суппозиториев) в приборах и по требованиям ГФ Стерильность (жидких) или микробиологическая чистота (для таблеток, свечей, мазей) методом посева, нормы по категориям (3Б) из доп. к общ. ст. ГФ Токсичность (на мышах после п/к инъекций: 3 суток без признаков заболевания) по ГФ Специфическая (литическая) активность (лизис контрольных штаммов бактерий не менее 75 % от свежевыделенных в лимитированном титре 10 –3 ÷10 –7 по Аппельману) Производственные штаммы (до 30 для каждой культуры для поливалентных или комбинированных БФ) Упаковка, маркировка, транспортирование, хранение (тара герметичная, температура перевозки и хранения обычно 6±4 оС) Срок годности (от 6 до 18 месяцев с возможным переконтролем) Назначение (лечение и / или профилактика заболеваний, вызванных соответствующими бактериями; способ применения) Ассортимент терапевтических БФ, их ГЛС. Перспективы развития препаратов БФ. Наименования выпускаемых БФ относятся к классификационной группе литических терапевтических (лечебных) препаратов: дизентерийный, брюшнотифозный, сальмонеллезный, коли, протейный, стафилококковый, стрептококковый, энтерококковый, синегнойный, клебсиеллезный. Большинство бактериофагов («раневых», и «кишечных», всего более 15 наименований) производят в жидком виде во флаконах или ампулах для перорального примененеия. Специальный внутривенный препарат известен только для стафилококкового БФ (апирогенный). ЛФ БФ для перорального и местного применения недостаточно используются из-за малой стабильности при изготовлении и хранении. Таблетки представлены только кишечнорастворимым типом с кислотоустойчивой оболочкой из АФЦ или с пектиновой защитой в массе (дизентерийный, брюшнотифозный, сальмонеллезный, колипротейный, стафилококковый, интести- и пиобактериофаг). 144 Кроме того, разработаны технологии и осуществлен серийный выпуск суппозиториев и линиментов стафилофага и пиобактериофага комбинированного, а также аэрозоля стафилофага и аэрозоля пиобактериофага комбинированного (Грузия). Имеется опыт экспериментального клинического применения некоторых бактериофагов (комбинированный, стрептококковый, стафилококковый и «интести») в виде желатиновых лекарственных пленок [Ананьев В.Н. и др.,1999]. Запатентованы глазная мазь с пиобактериофагом поливалентным совместно со смесью гликозаминогликанов на глицерогеле метилцеллюлозы [Пат.2168963] и гелевая форма с фагом к актиномицетам и со стафилострептофагом (пат. 2156133). В Грузии и США усиленно рекламируют биодеградируемую дерматологическую терапевтическую систему для лечения ран и ожогов «Фагобиодерм» и ее стоматологический вариант «Фагодент». В целом, разработка рациональных ЛФ бактериофагов целесообразна и актуальна, поскольку расширяется перечень заболеваний, при лечении которых бактериофагия эффективна и патогенетически обоснована, а выпускаемые отечественной промышленностью препараты бактериофагов имеют высокую активность против основных представителей гнойно-септических инфекций и не уступают по своему действию современным антибиотикам [Захарова Ю.А., 2003]. Перспективы развития препаратов БФ Повышение чувствительности (адаптация) фагов к множественнорезистентным стафилококкам и ванкомицино-устойчивым энтерококкам. Расширение видов терапевтических БФ, тропных к бактериям: Campylobacter, Listeria (США-Грузия), Helicobacter pylori (генно-инженерно перекомбинированный в гибридоме фаг, Швеция), Yersinia enterolytica (вирусная адаптация из клебсифага, Биомед-Пермь) и др. Совершенствование ЛФ БФ: суппозиториев (на современных липофильных основах); аэрозолей (на азоте и на механических распылителях); лекарственных пленок (глазных, стоматологических, ринологических, дерматологических, в т.ч. на биодеградируемых полимерах типа полиаминокислот); препаратов, иммобилизованных на сорбентах и полимерах. Создание комплексных препаратов БФ с бифидумбактерином, с композиционными энтерособентами, с антителами к кишечным инфекциям («таблетки путешественников»). Выпуск «диагностических дисков» (аналогичных антибиотиковым) для контроля фагочувствительности микробных культур конкретных пациентов перед фаготерапией. 145 Лекция 10. Производство фармацевтических препаратов на основе микробиологического синтеза План лекции 1. Требования, предъявляемые к микроорганизмам, используемым для производства 2. Сырье для микробиологического производства. 3. Приготовление сред. 4. Оборудование микробиологических производств. 5. Основы роста и культивирования микроорганизмов 6. Основные этапы микробиологического производства Литература 1. Безбородов А.М. Основы биотехнологии микробных синтезов.- М, 1989 г. 2. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. «Наука» - Санкт-Петербург, 1995 г. 3. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии.- М,2004 4. Фармацевтическая микробиология Словарь терминов/ В.И.Кочеровец, В.А. Галынкин, Н.А.Заякина.- М.,2004 Вопросы к лекции 1. Укажите основные требования к микроорганизмам, используемым в биотехнологии. 2. Охарактеризуйте основные типы ферментаторов, используемых в биотехнологии. 3. Сравните периодический и непрерывный методы выращивания микроорганизмов. 4. Дайте разъяснение термину «антиконтаминационная защита» применительно к биотехнологии. 146 Основное направление микробиологического синтеза – использование клеток микроорганизмов. Микробиологическое производство должно располагать штаммом продуцента, сырьем для приготовления питательных сред, оборудованием для культивирования микроорганизмов, методами выделения и очистки целевого продукта, сушки, обеспечения асептики. На практике применяют в основном штаммы четырех видов микроорганизмов: дрожжей, грибов, собственно бактерий, актиномицетов. Известно более 100 тысяч видов микроорганизмов, в промышленности используют тысячи штаммов относительно небольшого числа видов. К промышленным штаммам микроорганизмов предъявляются следующие требования: -они должны расти на дешевых субстратах, -обладать высокой скоростью роста, давать высокий выход продукта за короткое время, -иметь сверхсинтетическую способность желаемого продукта и низкую побочного продукта, -быть стабильными в продуктивности и к требованиям условий культивирования, -обладать устойчивостью к фаговой и другим инфекциям, -быть безвредными для человека и окружающей среды, -желательны штаммы термофиллов, ацидофиллов, так как с ними легче поддерживать стерильность производства -представляют интерес анаэробные штаммы, так как аэробы создают трудности инженерного плана при культивировании (требуют аэрирования), -образуемый продукт должен иметь экономическую ценность и легко выделяться. В производстве применяют природные штаммы и измененные в результаты разных способов усовершенствования (селекции, мутации, методы генетической инженерии). Сырье. Для приготовления питательных сред в микробиологической промышленности используют сырье минерального, животного и растительного происхождения, а также синтезированное химическим путем. Вещества, входящие в состав питательной среды, обеспечивающие развитие культуры и биосинтез определенных продуктов, не должно содержать вредных примесей. При выборе сырья необходимо учитывать его себестоимость, так как в микробиологическом синтезе важное значение имеет стоимость исходных веществ и материалов. В качестве источников углерода чаще всего используют углеводы (глюкозу, сахарозу, крахмал, лактозу) или богатые углеводами натуральные продукты (мелассу, кукурузную муку, гидроль и т.п.), а также жиры и 147 вещества, содержащие углеводороды (нефть, парафин, керосин, природный газ, метан и т.д.). Источником азота обычно бывают неорганические соли (сульфат аммония, двухзамещенный фосфат аммония, аммиак, нитраты, а также мочевина) или натуральные продукты (кукурузный экстракт, соевая мука, дрожжевой автолизат). При использовании сложных природных веществ или промышленных побочных продуктов необходимо тщательно проверить их биохимическую пригодность в качестве исходных веществ на лабораторных ферментационных стендах. Жидкие виды сырья хранят в больших цистернах. Практика показала, что технологические свойства мелассы и кукурузного экстракта при хранении могут улучшаться в результате протекающих в них биохимических и микробиологических процессов. Помимо основных компонентов питательных сред, в процессе ферментации нередко используют дополнительные виды сырья – предшественники, ПАВ, антибактериальные препараты и др. Предшественники – синтетические продукты, входящие в состав молекулы целевого продукта и добавляемые в ферментационную среду для интенсификации процесса биосинтеза. Например, при биосинтезе пенициллина в культуральную жидкость добавляют в качестве предшественника фенилуксусную кислоту, при биосинтезе эритромицина – пропиловый спирт, витамина В 12 – диметилимидазол. ПАВ в биологических производствах используют главным образом для пеногашения. Антибактериальные препараты (фурадонин и фурациллин) – для поддержки асептических условий. Одним из важных компонентов сырья для микробиологического производства является вода. В микробиологическом производстве воду используют не только для приготовления сред, но и для мытья аппаратуры, систем охлаждения и т.д. В производстве хлебопекарных дрожжей на получение каждой тонны используют 150-180 куб.м. воды, на каждую тонну глутамата натрия – 900-1000 куб м. Эти примеры свидетельствуют о том, что в микробиологическом производстве необходима чистая вода в большом количестве. Для приготовления сред воду берут из водопровода, артезианских скважин или открытых водоемов после соответствующей обработки. Она должна быть микробиологически чистой, бесцветной, без запаха и вкуса. Нежелательно содержание в воде гипса более 5 г/л и присутствие солей аммония, свидетельствующих о том, что имеют место процессы гниения. Сухой остаток не должен превышать 1000 мг/л, общая жесткость – не больше 7 мл-экв/л (слишком жесткая вода замедляет рост микроорганизмов). 148 Воздействие воды повышенной жесткости может быть и другим. Так, в дрожжевой промышленности при использовании воды из артезианской скважин получают хлебопекарные дрожжи более высокого качества , чем при использовании водопроводной. Повышенное осмотическое давление среды также благоприятно для развития дрожжей. Содержание вредных веществ в воде не должно превышать следующих концентраций, мг/л: Свинец –0,1 Мышьяк –0,05 Фтор –1,5 Цинк – 5,0 Медь-3,0 Общее число микроорганизмов в 1 мл воды не более 100. Приготовление сред. Питательные среды готовят в специальных реакторах с мешалками. Реакторы, ферментаторы, трубопроводы, арматуру чаще всего изготавливают из нержавеющей стали и особое внимание обращают на реакторы, которые используют для приготовления чистой культуры и в цехе основной ферментации. Среду готовят в сырьевом или рецептурном цехе периодическим или непрерывным методом, в отдельных случаях приготовление и стерилизацию осуществляют в ферментаторе. На современных заводах чаще применяют непрерывный метод приготовления: для этого используют два резервуара: в один вводят исходные вещества, а из другого жидкость идет в смеситель непрерывного действия. Далее среды с помощью насоса подаются в колонну для стерилизации. К вертикальной установленной колонне для стерилизации в верхнюю часть колонны подают пар под давлением.0,3-0,4 Мпа, а питательную среду подводят снизу в пространство между труб. Скорость потока выбирают такую, чтоб каждая частица питательной среды находилась в зоне прогрева заданное время. Если для стерилизации применяют относительно высокую температуру (135 С и выше) и объем выдерживания не превышает несколько десятков литров, вместо резервуаров используют систему изогнутых, вертикально закрепленных труб. Выбор аппаратуры, методики приготовления и стерилизации питательной среды зависит от количества и вида компонентов, которые растворяют в подогретой или горячей воде. Если по растворимости и устойчивости к стерилизации это возможно, все они растворяются в одном растворе. В противном случае компоненты растворяют по группам, стерилизуют и соединяют в в смесителе. Если среду стерилизуют периодическим паром под давлением или при помощи теплообменника, то весь объем питательной среды 149 доводят до 120 С, выдерживают при 120-124 С, а затем охлаждают до 29-30 С. В процессе стерилизации нужно следить, чтобы не происходили нежелательные явления (карамелизация). Если в цехе чистых культур и основной ферментации работают с разными средами, то необходимо иметь две или более линии для приготовления питательных сред. Ферментаторы. Самый ответственный процесс в микробиологическом синтезе – ферментация, потому ферментаторы, в которых проходит этот процесс, являются главным технологическим оборудованием любого микробиологического производства. Они представляют собой герметические цилиндры, объем которых колеблется от 20 л до 500 м3 , а высота в 3 раза превышает диаметр. В ферментаторах установлены мешалки турбинного, пропеллерного или другого типа. Диаметр турбины составляет 1/3 диаметра аппарата. В производстве антибиотиков широко распространены ферментаторы с мешалками, под которыми находится кольцевидный или радиальный воздушный барботер. Для поддержания температуры имеется двойной кожух и теплообменник типа змеевика. Аппарат оборудован арматурой и трубопроводами для подачи питательной среды, воды, раствора, регулирующего рН, пеногасителей, воздуха и других материалов, укоплектован измерительными приборами и измерительными устройствами, а также устройствами для пеногашения и смотровыми люками. Главное требование к ферментаторам – сохранение стерильности. К ферментаторам предъявляются самые высокие требования (важно иметь полную информацию о ходе процесса), поэтому в аппараты вмонтированы приборы- измерители и регуляторы рН давления кислорода, углекислого газа, датчики по содержанию глюкозы и других параметров. Современный процесс ферментации управляется автоматически по заданной программе с центрального пульта ЭВМ. Тип ферментатора для каждого биотехнологического процесса выбирают с учетом специфики продуцента, свойств среды и экономических соображений. Для обеспечения культур микроорганизмов кислородом в условиях аэробной ферментации через единицу объема питательной среды в минуту подают 0,2-2 единицы объема воздуха, который очищают от механических частиц, микроорганизмов и химических веществ перед введением в ферментатор. Для этого в микробиологическом производстве используют фильтрацию. Воздух подают под давлением 0,2 МПа в компрессор, предварительно очистив его от грубых частиц на масляных фильтрах. В ферментатор воздух проходит 150 сначала через общий, а затем через индивидуальный фильтр Петрянова. В последнее время широко применяют бактерицидные фильтры. Фильтрующий материал в индивидуальных фильтрах меняют один раз в 2 месяца, а в общих – через 6-8 месяцев. В связи с интенсивной аэрацией и перемешиванием во время ферментации образуется пена. Это может нарушить стерильность процесса и вызвать потери культуральной жидкости. Для ограничения пенообразования используют химические средства (масло, олеиновую кислоту, силиконы и другие пеногасители) и механические (вращающиеся лопасти в верхней части аппарата, циклоны, струи жидкости и т.п.). Конструкции ферментаторов различны. Рабочий объем аппарата не превышает 7/10 общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена и, таким образом. предотвращается потеря культуральной жидкости. В пенящейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах ( при условии непрерывного перемешивания и циркуляции слоя пены). Основы роста и культивирования микроорганизмов Рост – координированная репликация клеточных структур и биогенез органелл, необходимых организму для выживания. Развитие – качественное изменение компонентов организма. Процесс развития связан с ростом. Основой микробиологического производства является культивирование, предусматривающее получение максимального количества продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, а также микробной биомассы. При производстве микробной биомассы основным показателем культивирования является интенсивность роста и размножения микроорганизмов. Технология микробиологических производств строится на свойствах микроорганизмов, используемых в качестве продуцента. В зависимости от задач и возможностей производства продуценты культивируют двумя способами – поверхностным и глубинным. Метод выращивания поверхностным способом довольно прост и заключается в том, что микроорганизмы культивируют на поверхности твердых или жидких питательных сред. После засева питательной среды культурой продуцента выращивание ведут при оптимальных условиях в течение определенного промежутка времени, поэтому этот способ является периодическим. Способ периодической культуры чаще всего используют при получении посевного материала. Суть его в том, что за время культивирования не поступают компоненты питательной среды и не удаляются метаболические продукты. Такая система считается закрытой. В этих условиях микроорганизмы растут и размножаются, проходя через определенный цикл развития, который 151 выражается в смене фаз : лаг-фазы, экспоненциальной ( логарифмической), стационарной и фазы отмирания. ( см. рис.15 в лекции 7) 1-я фаза начинается с момента внесения инокулята в питательную среду и длится до начала размножения микроорганизмов. Суть фазы – в адаптации к новой среде обитания. Продолжительность лаг-фазы определяется физиологическими особенностями микроорганизмов, составами посевной и производственных сред, условиями культивирования, возрастом культуры и посевной дозой. Чем моложе микроорганизм, тем короче лаг-фаза. 2- фаза называется экспоненциальной или логарифмической и характеризуется сбалансированным ростом, который не ограничивается ни недостатком питательных веществ, ни избытком продуктов обмена. Устанавливается максимальная скорость роста. В результате интенсивного роста и размножения микроорганизмов в среде с той же интенсивностью расходуются питательные вещества и накапливаются продукты жизнедеятельности. Возникает пространственная ограниченность, ухудшается поступление питательных веществ в клетку и выделение метаболитов. Скорость роста снижается, число клеток сокращается и наступает следующая фаза. 3-я фаза стационарная – следствие равновесия между числом жизнеспособных и мертвых клеток, прирост биомассы культуры по существу прекращается. В культурах, достигших стационарной фазы, накапливается максимальное количество биомассы или максимальное количество клеток. Эти максимальные величины принято называть урожаем или выходом. Для стационарной фазы характерна все более нарастающая гетерогенность клеточной популяции, которая состоит из отдельно размножающихся клеток, из живых , но уже потерявших способность к росту, и мертвых , лизирующих клеток. 4-я фаза – фаза отмирания или гибели. Она начинается с момента, когда число отмерших клеток становится больше числа вновь образовавшихся. Условия для клеток микроорганизмов в этой фазе неблагоприятны. Биологически ценные продукты синтезируются как в экспотенциальной фазе (нуклеотиды, многие ферменты, витамины – первичные метаболиты), так и в стационарной фазе роста (антибиотики, витамины и т.п. – вторичные метаболиты) Основные стадии технологического процесса. Хотя для получения продуктов микробиологического синтеза применяют различные культуры микроорганизмов и используют различные питательные среды и режимы культивирования, тем не менее процессы биосинтеза имеют единую биотехнологическую схему. Эта схема включает следующие 152 технологические стадии: 1.Хранение культуры и размножение в лаборатории, 2. Получение посевного материала в цехе чистой культуры, 3. Ферментация, 4. Выделение продукта из культуральной жидкости. Все выпускаемые в настоящее время биопрепараты микробиологического синтеза можно разделить на три основные группы: Первая группа объединяет биопрепараты, которые содержат в качестве основного компонента жизнеспособные микроорганизмы. Это средства защиты растений, бактериальные удобрения, закваски для силосования кормов, препараты нормофлоры организма. В состав второй группы входят инактивированная биомасса клеток и продукты ее переработки: дрожжи кормовые, грибной мицелий. Третья группа включает биопрепараты, которые представляют собой очищенные продукты метаболизма микроорганизмов: витамины, антибиотики, аминокислоты, ферменты, стероидные препараты, полисахариды, биолипиды, продукты комплексной переработки микробных биомасс и метаболитов. Это наиболее обширная и разнообразная группа препаратов. Хранение культуры и размножение посевного материала в лаборатории. Культуры микроорганизмов - продуцентов веществ – получают из академий, университетов и институтов (коллекции культур) в пробирках на косом агаре или в ампулах. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, физиологии штамма, характеристики среды для культивирования и хранения. Чтобы сохранить свойства культуры без изменений, ее надо хранить в соответствующих условиях: основными из них являются охлаждение, замораживание или обезвоживание. Во всех этих случаях ограничивается или даже прекращается клеточный обмен веществ. Иногда (при замораживании или обезвоживании) клетки переходят в состояние анабиоза. На практике культуры хранят разными способами: на косом агаре при низкой температуре (1-5 С) можно хранить культуру 1-2 месяца, а иногда и дольше путем замораживания и хранения при температуре ниже – 20 С позволяет сохранить ее в течение нескольких месяцев (нежелательно многократное оттаивание и замораживание). на твердых средах под слоем стерильного парафина или минерального масла можно хранить дрожжи, плесневые грибы. Менее пригоден этот метод для хранения актиномицетов. Слой масла над поверхностью косого агара должен быть не менее 1 см, он предохраняет культуру от высыхания на агаре без добавления питательных веществ (допускаются лишь незначительные добавки) хранят актиномицеты 153 при лиофилизации культуру замораживают при температуре до – 30 –40 С и подвергают сублимации (обезвоживаниию) в вакууме (остаточное давление 6-130 кПа). Для предохранения клеток от инактивации используют защитные среды (сыворотка крови, бульоны, сахароза, смесь песка и глин). Лиофилизированную чистую культуру в ампулах хранят нескольких лет. Перед началом технологического процесса культуру размножают в лаборатории в асептических условиях при оптимальном составе среды в режиме выращивания (рН, температура, длительность). С поверхности косого агара ее стерильно переносят в колбе объемом 100-200 мл и инкубируют в термостате или в качалке в зависимости от потребности культуры в кислороде. Длительность этой стадии выращивания – 24 ч. Получение посевного материала в цехе чистой культуры. Дальнейшее размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции. Аппараты первой стадии называют инокуляторами, второй – посевными ферментаторами. Для приготовления посевного материала используют полноценную питательную среду, тщательно проверенную различными химическими и микробиологическими методами. Ее в аппарате не должно превышать 60% от общего объема. Если культуру в инокулятор переносят из колб, то количество посевного материала должно составлять примерно около 0,1% объема среды. Небольшое количество посевного материала требует дополнительного периода инокуляции (2-4 суток). Для посевных ферментаторов используют 10-12% инокулята, поэтому продолжительность приготовления посевного материала на этой стадии уменьшается и обычно не превышает 1 сутки. В это время надо следить, чтобы в аппаратах был оптимальный режим культивирования. Для этого три раза в сутки отбирают образцы для микробиологических и биохимических анализов. Основная ферментация. Для стерильной ферментации широко используют аппараты объемом до 100 куб.м. Перед заполнением аппарата средой его моют, проверяют герметичность, стерилизуют горячим паром под давлением как ферментатор, так и систему трубопроводов. Для обеспечения стерильности часто применяют предварительную его обработку химическими дезинфицирующими веществами (этот процесс проводят непосредственно перед обработкой горячим паром под давлением), после чего заполняют стерильной охлажденной питательной средой. Затем в ферментатор вводят посевной материал. Перед его подачей температура и рН питательной среды должны быть доведены до оптимальных данных значений для данной культуры. Соответственно регулируют и интенсивность аэрации с перемешиванием среды. В пространстве над 154 жидкостью скапливается пена. Если ее слой сильно увеличивается, то в аппарат вводятся химические пеногасители. Во время ферментации автоматически регулируются температура и рН среды, в случае необходимости добавляются растворы кислоты или щелочи. Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается максимальное количество полезного продукта. По окончании процесса культуральную жидкость охлаждают до 10-15 С и перекачивают в резервуары, из которых она подается на дальнейшую переработку. Биотехнологические процессы могут быть 2 типов: периодические и непрерывные Периодический способ выращивания микрорганизмов используется на стадии получения посевного материала для многих производств, непрерывных и периодических. Несмотря на преимущества непрерывного культивирования, многие промышленные процессы продолжают носит периодический характер, так как такие системы отличаются гибкостью и позволяют получать разнообразные вещества от пива до антибиотиков. Однако этот способ культивирования не позволяет в полной мере реализовать способности микроорганизмов к безграничному размножению. Период самой активной жизнедеятельности- логарифмическая фаза занимает лишь небольшую часть производственного цикла, а значительная часть уходит на лаг-фазу и период замедленного роста. Периодическое культивирование предполагает существование клеток микроорганизмов в постоянно меняющихся условиях. Концентрация источников питания и продуктов жизнедеятельности – регуляторы скорости роста микроорганизмов. Постепенным введением питательных веществ в течение всего процесса можно избежать ингибирования роста микроорганизмов. Такой метод получил название культивирования микроорганизмов с дробным дозированием субстрата. При добавлении питательной среды в процессе культивирования происходит изменение ее объема. С целью сохранения его постоянства и снижения концентрации микробных метаболитов часть культуральной жидкости можно через определенные промежутки времени удалять из аппарата и добавлять равное количество питательной среды. Такой периодический метод получил название объемно-доливного. При этом основные параметры процесса – объем, скорость разбавления, удельная скорость роста – не являются постоянными. Модификацией периодического культивирования явялется культивирование с диализом, при котором питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению 155 концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнедеятельность. Помимо этого, диализ удаляет из культуры часть жидкости, что позволяет получать в конце процесса концентрированную биомассу. Все варианты периодического культивирования с дробным дозированием субстрата дают возможность несколько увеличить время пребывания на одной из фаз развития. Однако добиться стабильности физиологического состояния клеток в периодических процессах невозможно. Непрерывный метод культивирования. Этот способ выращивания заключается в непрерывной подаче питательных веществ в ферментатор в таком количественном и качественном соотношении, которое необходимо для поддержания микроорганизмов в экспотенциальной фазе. При этом клетки непрерывно и однородно размножаются со скоростью, соответствующей притоку питательных веществ. Основным принципом непрерывных процессов является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей средой. В настоящее время метод непрерывного культивирования микроорганизмов получил глубокое теоретическое обоснование и широкое практическое применение можно классифицировать по принципам действия системы непрерывного культивирования. Классифицируются на открытые и закрытые. Главное различие между ними в том, что в открытых - клетки постоянно вымываются вытекающей средой со скоростью образования в системе новых клеток. А в замкнутой системе - клетки в какой-то мере задерживаются в системе, их количество возрастает. Открытой одноступенчатой гомогенно-непрерывной системой называется система, состоящая из одного биореактора с постоянной подачей питательной среды и отводом культуральной жидкости. За счет интенсивного перемешивания состав среды во всех точках аппарата поддерживается гомогенным, благодаря чему микробные клетки пребывают в одинаковом физиологическом состоянии. При гомогенно-непрерывном культивировании рост культуры можно ограничить одним элементом питания при нелимитируемых количествах остальных. Эта система известна как хемостат, так как рост микроорганизмов регулируют химические факторы среды. Максимальная скорость роста может быть достигнута турбидостатным культивированием (турбидостат), при котором контроль процесса осуществляется по концентрации клеток микроорганизмов. Контроль осуществляется с использованием системы фотоэлементов, скорость потока 156 свежей питательной среды также регулируется специальным устройством. При превышении заданной концентрации клетоксрабатывает фотоэлемент и включается поток свежей питательной среды, благодаря чему концентрация клеток снижается. Некоторые микроорганизмы хорошо развиваются на границе жидкой и газовой фаз или жидкой и твердых фаз. При этом они образуют плотные пленки, а свежая питательная среда протекает вдоль слоя культуры. Такие замкнутые системы с выращиванием клеток в промежуточной фазе применяют для культур, чувствительных к перемешиванию, а также для культивирования плесневых культур, продуцирующих пенициллин, лимонную кислоту, ферменты. Сравнительная оценка поверхностного и глубинного методов выращивания микроорганизмов позволяет отметить преимущества и недостатки каждого из них. При поверхностном культивировании основным сырьем являются отруби, лузга, пивная дробина, свекловичный жом, картофельная мезга и кукурузная кочерыжка. Высота слоя среды - 2-5 см. В цехе, где получают 1 т поверхностной культуры в сутки, на двое суток нужно более 1000 кювет. Мойка, стерилизация и перемещение их – основная трудность этого метода. Почти все технологические этапы при этом осуществляются вручную. Однако этот метод сохраняет свое значение при производстве некоторых биотехнологических продуктов, например, технических ферментов. Это определяется следующим: -Концентрация образующихся ферментов при поверхностном культивировании во много раз выше, чем в фильтрате глубинных культур. Для осахаривания 100 кг крахмала требуется 5 кг поверхностной культуры плесневых грибов или 10 л глубинной культуры при одинаковой биохимической характеристике штамма. - Возможность быстрого и относительно легкого высушивания поверхностной культуры без заметной потери активности ферментов. Сухие культуры легко транспортируются и широко применяются в спиртовой промышленности и при силосовании - Меньшие затраты на электроэнергию по сравнению с глубинным методом. Среди особенностей глубинного способа культивирования необходимо выделить: - возможность использования одной и той же питательной среды для посевной и производственной культуры (сокращение лаг-фазы) - инокуляция 2-5% посевной культуры от объема производственной среды 157 биосинтез ферментов у грибов при непрерывной подаче воздуха и перемешивании в течение 2-4 сут. Выделение продукта из культуральной жидкости Для выделения целевого продукта из культуральной жидкости путем осаждения используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр-прессы, вакуум-барабанные фильтры или отстойники. Иногда биомассу осаждают добавлением электролитов, надосадочную жидкость декантируют. После центрифугирования биомассу получают в виде густой жидкости или пасты 7590% - ной влажности. Клеточную массу промывают, фильтруют, сушат, гидролизуют, экстрагируют из нее нужный продукт. Если метаболит находится в растворе, биомассу используют после отделения как побочный продукт, а нужное вещество, на пример фермент, выделяют из раствора различными методами: экстракцией, хроматографией фильтрацией, кристаллизацией, осаждением,. Антибиотики выделяют, осаждая в виде малорастворимых солей из водного раствора, где они предварительно максимально концентрируются путем экстракции или ионообменным путем, а также высушивая водные растворы лиофилизацией или в сушилках распылительного типа. Асептика, антиконтаминационная защита в биотехнологии. Микробиологическое производство принципиально отличается от производств химической технологии, что в технических системах присутствуют живые организмы, предъявляющие особые требования к этим системам. Это прежде всего комплекс параметров жизнеобеспечения и создание оптимальных условий для развития популяции продуцента, сохранение ее стабильности и продукта, который она синтезирует. Герметизация оборудования, стерильность обеспечивает стандартность и качество микробиологических препаратов. Контаминанты нарушают нормальный рост и развитие микроорганизмов – непроизводительно расходуется питательная среда, снижается качество целевого продукта. Контроль качества сред необходимо проводить до и после стерилизации. Для успешного функционирования микробиологического производства необходимо решение двух взаимосвязанных задач: защита технологического процесса от загрязнения контаминантами – посторонней микрофлорой и защита окружающей среды от микроорганизмов, используемых в данном производстве или продуктов их жизнедеятельности. 158 Лекция 11. Антибиотики. Условия и пути их биосинтеза, основные этапы промышленного получения. План лекции 1. Антибиотики как биотехнологические продукты. 2. Основные этапы промышленного получения антибиотиков. 3. Бактериофагия и ее значение в производстве антибиотиков. 4. Перспективы создания новых антибиотических веществ. Литература: 1. Н.С. Егоров. Основы учения об антибиотиках, М, 2004. 2. Основы биотехнологии: Учеб. Пособие для высш. пед. учеб. заведений / Т.А. Егорова, С.М. Клунова, Е.А. Живухина. – 2-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 208 с. 3. Биотехнология: учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / Ю.О. Сазыкин, С.Н.Орехов, И.И. Чакалева; под ред. А.В. Катлинского. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 256 с. Вопросы 1. Охарактеризуйте основные методы выделения продуцентов антибиотиков из природных условий. 2. Охарактеризуйте основные пути повышения способности микроорганизмов к образованию антибиотиков. 3. Основные стадии промышленного получения антибиотиков. 4. Каковы основные методы выделения и очистки антибиотиков? 5. Значение бактериофагии при промышленном производстве антибиотиков. 159 Антибиотики как биотехнологические продукты Антибиотики образуются различными группами организмов (бактериями, грибами, высшими растениями, животными). История открытия первого антибиотика (пенициллина), нашедшего широкое применение в медицинской практике, связано с именем шотландского микробиолога Флеминга. В научную литературу термин «антибиотик» был введен Ваксманом в 1942 году. Антибиотики – специфические продукты жизнедеятельности организмов или их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (бактериям, грибам, водорослям), вирусам или к злокачественным опухолям, задерживая их рост или полностью подавляя развитие. Сложилось несколько подходов к классификации антибиотиков: - по химическому строению (удобна для химиков, занимающихся изучением строения молекул антибиотиков и путей их синтеза); - по принципу биологического происхождения (предпочтительна для биотехнологов, изучающих организмы-продуценты антибиотиков); - по типу и механизму биологического действия (применяется в медицинской практике). Таблица 14 Классификация антибиотиков по химическому строению и по биологическому происхождению Класс Типичные Промышленные На кого действует антибиотики продуценты β-Лактамные Пенициллины, Грибы родов Грамположительные цефалоспорины Penicillium, и Cephalosporum грамотрицательные бактерии Аминогликозид Стрептомицин, Актиномицеты В основном ные гентамицин, рода грамотрицательные канамицин, Streptomyces, бактерии тобрамицин, бактерии родов амикацин Micromonospora, Bacillus Тетрациклины Одноименные Актиномицеты Грамположительные антибиотики рода Streptomyces и грамотрицательные бактерии, риккетсии, 160 Макролиды хламидии, простейшие Актиномицеты Грамположительные рода Streptomyces бактерии То же Грибы, некоторые простейшие Антибактериаль ные: эритромицин Противогрибков ые и антипротозойны е: полиены Полипептидные Полимиксины, Антибиотики и грамицидины, продуцируемые депсипептидные бацитрацины бактериями В основном грамотрицательные бактерии В зависимости от точки приложения и механизма биологического действия антибиотики делят на: 1. Специфические ингибиторы биосинтеза клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины и цефамицины, ванкомицин, ристомицин, циклосерин, бацитрацин, тиенамицины и др.); 2. Препараты, нарушающие молекулярную организацию и функции клеточных мембран (полимиксины, полиены); 3. Препараты, подавляющие синтез белка на уровне рибосом (макролиды, линкомицины, аминогликозиды, тетрациклины, левомицетин, фузидин); 4. Ингибиторы синтеза РНК на уровне РНК-полимеразы и ингибиторы, действующие на метаболизм фолиевой кислоты (рифампицины); 5. Ингибиторы синтеза РНК на уровне ДНК-матрицы (актиномицины, антибиотики группы ауреоловой кислоты); 6. Ингибиторы синтеза ДНК на уровне ДНК-матрицы (митомицин С, антрациклины, нитрофураны, налидиксовая кислота). 161 Рис. 17.Схема мишений действия антибиотиков В лабораториях разных стран мира выделены и охарактеризованы десятки тысяч продуцентов антибиотиков. Как правило, продуцентами антибиотиков являются такие почвенные микроорганизмы, как плесневые грибы, актиномицеты, и спорообразующие бактерии. Плесневые грибы широко распространены в почве, относятся к микроорганизмам эукариотам, имеющим оформленное, окруженное мембраной, ядро. Плесневые грибы образуют сотни разных антибиотиков, однако в медицинской практике применяются лишь отдельные из них. Важнейшие из них – пенициллины и цефалоспорины (беталактамные антибиотики), так как часть молекулы, от которой зависит антимикробная активность – реакционно-способное четырехчленное беталактамное кольцо. Название актиномицеты отражает ранее распространенное неправильное представление об этих микроорганизмах как о лучистых грибах. Установлено, что они стоят гораздо ближе к бактериям, чем к грибам. Они являются прокариотами. Их геном не заключен в ядро, а представляет кольцевую хромосому, не отделенную от цитоплазмы ядерной мембраной. Актиномицеты являются продуцентами огромного количества (около 4000) разнообразных антибиотиков. Актиномицетами образуются большинство антибиотиков, 162 применяемых в медицинской практике, к которым принадлежат: стрептомицин, гентамицин, неомицин, канамицин и ряд других антибиотиков с широким спектром действия. Анаэробные спорообразующие грамположительные бактерии относятся к собственно бактериям. Открыто более тысячи антибиотиков бактериального происхождения. Большинство из них представлено пептидами и циклопептидами. К антибиотикам бактериального происхождения относятся: грамицидин, полимиксин и ряд других. В целом, антибиотики, образуемые почвенными споровыми бактериями не столь разнообразны, как антибиотики актиномицетов, и в медицинской практике они играют меньшую роль. В настоящее время известно более 16 тысяч соединений, обладающих антибиотической активностью. Однако далеко не все из них допущены для применения в медицине. Неустанно ведутся исследования по поиску новых антибиотиков. Причина неослабевающего внимания к поиску новых антибиотиков связана с токсичностью существующих антибиотиков, аллергическими реакциями, вызываемыми ими, нарастанием устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым препаратам и, помимо этого, с необходимостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против которых недостаточно эффективны известные ныне антибиотики. С этой целью интенсивно ведут поиск новых продуцентов антибиотических веществ. Главное при поиске продуцентов антибиотиков – выделение их из природных источников. Продуценты антибиотиков могут выделяться из самых разнообразных субстратов: почвы, гниющих растительных и животных остатков, илов, воды озер и рек, воздуха и других источников. Наиболее богата микроорганизмами, продуцирующими антибиотики, почва. Из нее большей частью и выделяют организмы – продуценты антибиотических веществ. Для выделения микроорганизмов – продуцентов антибиотиков из естественных мест их обитания применяют разнообразные методы. В основу большинства приемов положен принцип выделения чистой культуры микроба и непосредственного испытания его по отношению к используемым тесторганизмам. Однако существенное значение при образовании антибиотических веществ имеют и смешанные культуры. Основные методы выделения микробов – продуцентов антибиотиков: 1. Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки. 2. Высев почвы на питательный агар, предварительно засеянный тесторганизмом. 3. Метод обогащения почвы. 4. Метод центрифугирования почвенной суспензии. 163 5. Метод замораживания-оттаивания почвы. 6. Обработка почвенного образца карбонатом кальция. 7. Применение питательных сред, содержащих антибиотики. 8. Обработка почвенной суспензии УФ-светом. 9. Использование СВЧ (волн сверхвысокой частоты). После того как микроорганизм, обладающий ценными антибиотическими свойствами, тем или иным способом выделен из субстрата, необходимо определить его принадлежность к определенному виду, установить таксономическое положение его штамма. Для указанных целей используют большой спектр признаков: культуральные свойства, морфологию и организацию клеток, физиологические и биохимические особенности организма, химический состав клеток и т.д. Для выделенных штаммов должны быть изучены условия культивирования полученных вариантов в целях определения наиболее оптимальной биосинтетической активности. При изучении вновь выделенных продуцентов антибиотиков стремятся отобрать наиболее активные варианты, имеющиеся в культуре. Микроорганизмы – продуценты антибиотиков, выделенные из природных субстратов, обычно имеют низкую антибиотическую активность. Понятно, что потребности медицины, сельского хозяйства и некоторых отраслей промышленности не могут быть удовлетворены без получения наиболее продуктивных штаммов организмов, образующих антибиотические вещества. Поэтому перед наукой была поставлена задача разработать пути повышения биосинтеза практически ценных антибиотических веществ. При решении этой задачи используют следующие методы: 1) индуцированного мутагенеза и ступенчатого отбора наиболее активных форм продуцентов антибиотиков; 2) генно-инженерных манипуляций; 3) слияния протопластов. 1) Индуцированный мутагенез и ступенчатый отбор наиболее активных форм продуцентов антибиотиков Решающий прием, обеспечивающий успех селекции многих продуцентов антибиотиков, - метод получения мутаций под влиянием сильнодействующих факторов, в том числе физических (рентгеновское излучение, ультрафиолетовое облучение, быстрые нейтроны), химических (азотистая форма иприта, этиленимин, аминопурин, гидроксиламин и др.), биологических (генымутаторы, транспозоны и др.). При действии физических и химических факторов в течение определенного периода времени происходит полная гибель микроорганизмов. Однако можно подобрать экспозицию (концентрацию) и силу воздействия, при которых часть клеток или спор изучаемой популяции выживет. Среди таких выживших особей могут появляться формы с измененным характером 164 отдельных звеньев обмена веществ, с другими свойствами, иными словами, мутанты с измененной генетической программой. Наряду с формами, потерявшими способность образовывать антибиотик (а их обычно большинство), возникают такие, у которых обнаруживается значительное повышение продукции антибиотика. Такой индуцированный мутагенез с последующим отбором нужных мутантов до настоящего времени остается одним их наиболее распространенных методов. Довольно часто в селекционной работе применяют последовательное воздействие на организм различных факторов. В результате применения различных методов селекции удалось значительно (в 50-100 раз и более) увеличить образование таких важных антибиотиков как пенициллин, стрептомицин, антибиотиков тетрациклиновой группы и др. 2) Генно-инженерные манипуляции Широко распространенное клонирование регуляторных и структурных генов, контролирующих биосинтез различных антибиотиков, дало возможность использования их в целях повышения их на один-два порядка антибиотической продуктивности многих штаммов стрептомицетов. Иногда при использовании указанного метода может происходить выработка реципиентом новых антибиотиков, не свойственных данному штамму. Основной проблемой, связанной с использованием названного метода, является разработка приемов сохранения стабильности полученных штаммов. 3) Протопластирование Основные принципы протопластирования стрептомицетов были разработаны М. Оканиши и др. (1984). Методы протопластирования применяются для многих микроорганизмов, в том числе и для продуцентов антибиотических веществ. При слиянии протопластов микроорганизмов осуществляются четыре основные стадии: 1) образование протопластов в результате лизиса клеточной стенки (для этих целей чаще используют лизоцим); 2) непосредственное слияние полученных протопластов; 3) культивирование образовавшихся в результате слияния структур в селективных условиях; 4) процесс регенерации. В результате протопластирования клеток и последующей регенерации протопластов удается повысить антибиотическую активность продуцентов антибиотиков, их фагоустойчивость и другие ценные свойства. При этом иногда наблюдаются морфологические изменения образовавшегося организма, элиминация плазмидных ДНК, биосинтез новых антибиотиков, а иногда и потеря антибиотической активности. 165 Метод слияния протопластов позволяет получать гибриды промышленных штаммов стрептомицетов. Методом регенерации протопластов удалось выделить и более активные продуценты макролидных антибиотиков (спирамицина, тилозина, цикламицина). Недостаток метода состоит в том, что не всегда удается воспроизвести результаты в генерациях продуцента. Таким образом, при использовании различных методов воздействия на микроорганизмы имеется возможность получить штаммы с высоким уровнем биосинтеза антибиотических веществ, пригодные для использования при промышленном получении антибиотика. Например, у продуцента пенициллина в результате десятков лет селекционной работы во многих лабораториях разных стран мира активность повысилась от десятков микрограммов до десятых долей грамма антибиотика в миллилитре среды. У промышленных мутантных штаммов (рабочий термин суперпродуценты) антибиотик, образуемый в огромном количестве, не должен влиять - на собственный биосинтез; - на жизнедеятельность своего продуцента. Как известно, избыточное образование метаболита ведет к прекращению его биосинтеза. В случае суперпродуцентов механизм обратной связи исключен. Итак, рассмотрим основные этапы промышленного получения антибиотиков. Основные этапы промышленного получения антибиотиков Широкое применение антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве и других отраслях народного хозяйства поставило задачу получения этих биологически активных веществ в массовых масштабах. Решение этой задачи стало возможным благодаря созданию мощной антибиотической промышленности. Получение антибиотиков в промышленных условиях осуществляется в основном в результате биосинтеза или путем химической модификации полученных в процессе биосинтеза молекул этих физиологически активных соединений. Современное промышленное получение антибиотиков — это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий - получение высокопродуктивных штаммовпродуцентов, разработка наиболее благоприятных условий культивирования продуцента антибиотика с максимальным биосинтезом этого вещества, подбор и внедрение в практику выделения и очистки антибиотика, создание готовых препаратов и контроль их качества. 166 Рис.18.Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза 167 Далее рассмотрим основные стадии промышленного производства антибиотиков. Подготовка среды для культивирования продуцента антибиотика Стерилизация питательных сред Для каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная питательная среда. Среда должна соответствовать определенным требованиям: а) обеспечивать максимальный выход антибиотика, б) состоять из относительно дешевых компонентов, в) иметь хорошую фильтрующую способность и г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения и очистки антибиотиков. При проведении первой стадии технологического процесса применяют натуральные среды неопределенного состава, к числу которых относят продукты крахмалопаточного производства, агар, желатин, отруби, зерно. Биосинтетической деятельностью микроорганизмов можно управлять, изменяя состав питательной среды: 1. Введение в среду веществ, которые, включаясь в молекулу антибиотика, обеспечивают получение препарата с новыми свойствами, широко применяется при биосинтезе различных форм пенициллинов. Так, если в среду добавлять фенилуксусную кислоту, то Peniccilium chrysogenum образует преимущественно бензилпенициллин, содержащий в качестве радикала молекулы антибиотика фенилуксусную кислоту. Если же в качестве предшественника ввести в среду феноксиуксусную кислоту, то гриб начинает синтезировать новый тип пенициллина – феноксиметилпенициллин. 2. Добавление в среду отдельных аминокислот, органических кислот (в виде солей) или иных компонентов, принимающих участие в обмене веществ организма, позволяет получать препараты с новыми свойствами. Например, если в среде присутствует треонин, то Streptomyces antibioticus вырабатывает только В-комплекс актиномицина, а при наличии в субстрате глутаминовой кислоты - А-тип актиномицинов. Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным. Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до температуры 120-130 °С непосредственно в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30-60 мин (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27-30 °С. 168 Эффект стерилизации и сохранение термолабильных веществ среды достигаются в том случае, если стерилизацию проводят при более высокой температуре и за более короткое время. Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса направляется в стерилизационную колонку, через которую пропускают острый пар (давление пара около 505 Па). Пар подают сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему он поступает в среду, быстро ее нагревая. Среда в колонку поступает снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы. Среда, нагретая в колонке до необходимой для стерилизации температуры (около 130 °С), поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125-130 °С. Время выдержки зависит от состава среды и длится 5-10 мин. Отсюда стерильная среда подается в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30-35 °С (на выходе) и поступает в ферментер. Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды и др. При применении в качестве отдельных компонентов субстрата термолабильных веществ их, как правило, следует стерилизовать отдельно в условиях более мягкого режима. Подготовка посевного материала. Подготовка посевного материала — одна из ответственейших операций в биотехнологическом цикле получения антибиотиков. От количества и качества посевного материала зависит как развитие микроорганизма в ферментере, так и биосинтез антибиотика. Продуцент антибиотика обычно выращивают на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала — процесс многоступенчатый. 169 Рис.19 Схема многоступенчатого приготовления посевного материала А – выращивание во флаконах, Б - в колбах на качалках: 1 - исходный материал, 2 - споровая генерация на косом агаре в пробирке, 3 - II споровая генерация на твердой среде в сосуде Ру, 3а, 3б – I и III генерации на жидкой среде в колбе, 4 – ферментер предварительного инокулирования, 5 – ферментер инокулирования, 6-основной ферментер Микроорганизм предварительно выращивают на агаризованной среде в пробирке, затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение 2-3 суток для каждой генерации. Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой инокулятор, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор (100-500 л), откуда и делают посев в основной ферментер. Для посева в основной ферментер используют от 5 до 10 об. % посевного материала (инокулята). Однако при получении пенициллина споровый материал гриба, приготовленный на отрубях, рисовых зернах или пшене, засевают в инокулятор сразу. Биосинтез антибиотиков. Стадия биосинтеза (образования) антибиотика. Это основная биотехнологическая стадия сложного процесса получения антибиотического вещества. Главная задача на этой стадии — создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика. Методы культивирования продуцентов антибиотиков В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов — продуцентов антибиотиков или других биологически активных соединений признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух и среда перемешивается. 170 Существует четыре основные модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов. 1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется 2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). При этом объем культуральной жидкости в ферментере доводится свежей питательной средой до исходного уровня. 3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго — в третий и т.д. Освобожденный ферментер немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально. 4. Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков. В основе метода лежит принцип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически активного соединения. При обычном процессе непрерывного культивирования продуцентов антибиотиков интенсивность биосинтеза антибиотического вещества, как правило, снижается по сравнению с периодическим культивированием. Несмотря на это, исследования по применению непрерывного культивирования для производства антибиотиков продолжаются. Развитие продуцента антибиотика в ферментерах Процесс развития микроорганизмов - продуцентов антибиотика имеет, как правило, двухфазный характер. Первая фаза – тропофаза или фаза сбалансированного роста – характеризуется тем, что в культуре продуцента-антибиотика происходит быстрое накопление биомассы, сопровождаемое быстрым потреблением основных компонентов субстрата (источников углерода, азота, фосфора и др.). 171 Биосинтез антибиотика в этот период не происходит или осуществляется в незначительном количестве. Вторая фаза – идиофаза или фаза несбалансированного роста – характеризуется снижением общего количества биомассы, среда обогащается продуктами обмена и продуктами автолиза клеток. Происходит бурный процесс биосинтеза антибиотика. Развитие микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех его стадий и очень точном выполнении условий развития. Большое внимание уделяют поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды (рН), степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляют биологический контроль, учитывают потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источника углерода, азота, фосфора), внимательно следят за образованием антибиотика. Практика промышленной микробиологии показывает, что процесс получения того или иного продукта жизнедеятельности активнее идет в смешанных культурах, при совместном развитии нескольких видов, чаще двух видов микроорганизмов. Совместным культивированием специально подобранных микроорганизмов создают условия, при которых значительно увеличивается образование антибиотиков, как результат активации ряда биохимических процессов. Большое внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма образуется обильная пена, которая существенно нарушает процесс развития продуцента антибиотика в ферментере. Появление большого количества пены обусловлено белковыми веществами, находящимися в среде, и ее высокой вязкостью, что связано с обильным накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментерах используют поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобутанкарбамил и другие соединения). Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. 172 Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены сильными струями жидкости, пара или газа). Разделение жидкости и биомассы В процессе развития микроорганизмов образуемые ими антибиотики в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость попадает лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток. У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма. Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. Для фильтрации применяют фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр, центрифуги, сепараторы. Фильтр-прессы употребляют для обработки больших объемов культуральной жидкости. Аппараты состоят из ряда чередующихся плит и рам и фильтрующих перегородок между ними. Процесс фильтрации осуществляется под давлением. Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутч-фильтры или друк-фильтры. Первый аппарат работает под вакуумом, а во втором процесс фильтрации осуществляется благодаря поддержанию давления над фильтрующейся жидкостью. Широко распространен и способ центрифугирования. Хорошие результаты получают в том случае, если при правильном выборе скорости подачи жидкости скорость вращения центрифуги достигает 15 000 об/мин. Отделять мицелий или другие взвешенные частицы можно также в сепараторах. При скорости вращения барабана сепаратора 7000-7500 об/мин благодаря центробежной силе твердые частицы устремляются к стенкам барабана и осаждаются там, а отсепарированная жидкость стремится к центру барабана и поднимается вверх в специальную камеру. Выделение антибиотика В зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции, используя для этого растворители, не смешивающиеся с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Из клеток микроорганизмов антибиотик выделяют с помощью экстракции органическими растворителями. Если антибиотик содержится и в культуральной жидкости, и в клетках продуцента, то сначала антибиотик переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с 173 антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют. Химическая очистка антибиотиков Цель химической очистки — извлечение антибиотика из нативной жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение (собственно очистка) от сопутствующих примесей и, в конечном счете, получение высокоочищенного препарата, пригодного для соответствующего применения. В ряде случаев антибиотические вещества под влиянием жестких внешних факторов (повышенная температура, высокая кислотность или щелочность и др.) теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать максимум осторожности. Например, полиеновые макролидные антибиотики содержат ряд чувствительных к внешним воздействиям группировок: сопряженные двойные связи, аминосахара, макролактонное кольцо. Все это делает их нестабильными при выделении и очистке. Нестабильность названных групп антибиотиков обусловлена, как правило, их термоокислительной инактивацией. Причем начальная стадия инактивации связана с образованием свободных радикалов, пероксидов и некоторых других соединений на стадии выделения и очистки. Применение антиоксидантов способствует стабилизированию полиенов при экстракции их из мицелия. Основные методы очистки антибиотиков следующие. Метод экстракции. Нередко для очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией). Такой прием носит название перекристаллизации. Ионообменная сорбция. Водные растворы антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, пропускают через колонки с соответствующими ионообменными смолами, на которых антибиотики сорбируются, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда их ионов называют катионитами или анионитами. Антибиотик (как отрицательно заряженный ион) будет сорбироваться на катионитной смоле, и наоборот. Адсорбированный на смоле антибиотик элюируют (десорбируют), в результате чего получают значительно очищенный и концентрированный препарат. Затем раствор этого препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд. При этом на 174 смоле осядут примеси, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку Метод осаждения. Антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами для получения соединения, выпадающего в осадок, последний с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают. Образовавшееся соединение растворяют, и антибиотик экстрагируют или вновь осаждают (кристаллизуют). Одна из стадий химической очистки антибиотиков — концентрированно полученных растворов; достигается это отгонкой большей части растворителя, как правило, в высоком вакууме. Применяемые методы выделения и химической очистки, а также качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение, прежде всего, для улучшения качества получаемого антибиотика и увеличения выхода препарата. Получение готовой продукции Сушка, контроль и расфасовка препарата После выделения и химической очистки антибиотика его необходимо высушить, т.е. удалить из препарата свободную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильны, для их высушивания применяют методы, не приводящие к потере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На этапе промышленного получения антибиотиков используют следующие методы обезвоживания. Лиофильная сушка антибиотиков — широко распространенный прием; проводится при сравнительно низких температурах (от -8 до -12 оС). Высушивание с применением распылительной сушилки — прогрессивный метод при работе с большими количествами антибиотика; раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков занимает несколько секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют свойств. Метод взвешенного слоя или сушка в вакуум-сушильных шкафах применяется для высушивания зернистых и пастообразных антибиотических препаратов. Контроль препарата. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому. При биологическом контроле ставится задача выяснения стерильности готового препарата. Для этого обычно используют два метода. 175 Первый связан с инактивацией антибиотика и высевом его в соответствующую питательную среду. Например, биологический контроль бензилпенициллина и полусинтетических препаратов, полученных на его основе, проводится следующим образом. В пробирки, содержащие тиогликолевую среду, вносят фермент В-лактамазу в количестве, способном полностью инактивировать пенициллин. Пробирки с ферментом выдерживают 2-3 суток при температуре 37 °С для контроля его стерильности, затем в них вносят раствор пенициллина. Пробирки разделяют на две группы: одну выдерживают при 37, а другую — при 24 °С в течение 5 сут. Ведут ежедневное наблюдение за возможным развитием микроорганизмов. Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяется тем, что для большинства этих соединений не имеется инактиваторов их биологической активности. Поэтому выявляют устойчивые к изучаемым препаратам формы микроорганизмов и определяют возможное присутствие в таких препаратах чувствительной к ним микрофлоры, для чего раствор антибиотиков пропускают через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,75 мкм. Необходимо подчеркнуть, что стерильность готового антибиотика обеспечивается соблюдением стерильных условий работы на всех стадиях процесса развития продуцента, выделения и очистки препарата. Фармакологический контроль. К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, в соответствии с Государственной фармакопеей, предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность и другие свойства, жизненно важные для организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности (влияние на кровь, центральную нервную систему, дыхание и т.д.). Показатели острой токсичности — один из критериев качества антибиотического вещества. Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД) антибиотика, дозу, вызывающую гибель 50% подопытных животных (LD50), и смертельную дозу (LD100). Только после всестороннего и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению. Расфасовка и упаковка антибиотика — завершающий этап работы. Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу. 176 Бактериофагия и ее значение в производстве антибиотиков Микроорганизмы – продуценты антибиотиков в процессе развития в промышленных условиях нередко теряют способность к антибиотикообразованию или резко снижают ее. Это нежелательное явления связано с фаголизисом. Бактериофаги способны лизировать только молодую, активно развивающуюся культуру микроорганизма. Технологический процесс получения антибиотиков весьма благоприятен для развития фагов в случае попадания их в ферментеры. При заражении культуры фагом происходит почти полный лизис мицелия стрептомицета и резкое снижение биосинтеза антибиотика. Лизис стрептомицетов под действием фагов в заводских условиях причиняет значительный материальный ущерб. Фаголизис стрептомицетов — продуцентов антибиотиков наблюдается при промышленном получении стрептомицина, тетрациклинов, эритромицина, новобиоцина. Он может иметь место и при производстве других антибиотических веществ. Исходя из изложенного для борьбы с фаговой инфекцией должны применяться следующие меры. 1. Выведение высокоактивных фагоустойчивых штаммов — продуцентов антибиотиков. 2. Борьба с распространением фага в производственных цехах и лабораториях. 3. Защита производственной культуры от фаговой инфекции. Защита производственной культуры от фаговой инфекции осуществляется путем тщательной стерилизации сред, аппаратуры, оборудования и коммуникаций, строгого соблюдения стерильности на всех производственных этапах. Соблюдение указанных мер позволяет осуществлять промышленный процесс получения антибиотических веществ на должном уровне, без опасения лизиса культуры продуцента. 177 Лекция 12. Биотехнология современных вакцин. План лекции: 1. 2. 3. 4. 5. Введение. Теоретические основы вакцинопрофилактики. Требования к производству вакцин. Виды современных вакцин. Ограничения производства современных вакцин. Литература 6. Б. Глик, Дж. Пастернак //Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: Мир, 2002. 7. Краснопольский Ю.М., Борщевская М.И. Биотехнология иммунобиологических препаратов. - Харьков: «Фармитэк», 2008. – 312 с. 8. Н.В. Медуницын. Вакцинология –М.: Триада-Х, 2004.-272 с. 9. В.Ф. Учайкин, О.В. Шамшева. Вакцинопрофилактика. Настоящее и будущее. Геотармед.- М., 2001. – 400 с. Вопросы к лекции 1.Разъясните основные принципы вакцинопрофилактики. 2.Дайте определение «вакцины». Классификация и состав вакцин . 3.Назовите основные технологические стадии производства живых, инактивированных, химических, комбинированных, рекомбинантных вакцин и вакцин с искусственными адъювантами вакцин. 4. Сформулируйте требования, предъявляемые к «идеальной» вакцине. 178 Инфекционные болезни являются наиболее распространенными на земном шаре. Эпидемии оспы, холеры, чумы, дифтерии, кори, коклюша, полиомиелита еще до недавнего времени уносили многочисленные человеческие жизни и в настоящее время наносят непоправимый урон не только здоровью, но и экономическому состоянию общества. Не менее опасны эпидемии гриппа, менингококковой инфекции, ВИЧ-инфекции, гепатита В и других, которые угрожают здоровью и жизни многих людей. Ежегодно на земном шаре рождаются 130 млн. детей и примерно 12 млн. детей умирают в возрасте от 1 недели до 14 лет. Около 9 млн. детей умирают от инфекционных заболеваний, причем 3 млн. – от инфекций, против которых имеются вакцины (вакцины пробив дифтерита, скарлатины и коклюша). По данным ВОЗ, за последние 20 лет выявлено более 30 новых болезнетворных микроорганизмов, начиная от исключительно опасного вируса геморрагической лихорадки Эбола до ротавируса – наиболее распространенного возбудителя диареи у детей во всем мире. Малярия, туберкулез, дифтерия, холера, чума вновь заявляют о себе во многих странах. Миру угрожает рост заболеваемости инфекционными болезнями, усугубляющийся резистентностью возбудителей к антибактериальным препаратам. «Все на борьбу с глобальной опасностью распространения инфекционных заболеваний!» - таков лозунг ВОЗ на современном этапе. Началом успешной борьбы с инфекционными болезнями считается 1798 г., когда английский врач Э. Дженнер с помощью прививки человеку коровьей оспы предупредил заражение натуральной оспой. Метод прививки он назвал вакцинацией, а материал, взятый из коровьей оспины, – вакциной (от лат. vacca - корова). Следующим этапом стало открытие Л. Пастера, который в 1885 г. показал, что «если понизить ядовитость микроба, то он превращается в средство защиты от болезни, им вызванной». Таким образом, Л. Пастер наряду с Э. Дженнером является основателем вакцинологии. Вакцинопрофилактика – это искусственное воспроизводство иммунного ответа путем введения вакцины с целью создания невосприимчивости к инфекции. В ответ на введение вакцины в организме закономерно происходит активация иммунной системы. Защитные механизмы, действующие при той или иной инфекции, соответствуют структуре возбудителя и направлены на его уязвимые участки. Так, при бактериальных инфекциях возможны два механизма патогенности – токсигенный и инвазивный. При токсигенном механизме патогенность возбудителей почти полностью обусловлена образованием ими 179 токсина, оказывающего отравляющее действие на организм человека. В этом случае иммунный ответ направлен на нейтрализацию токсина антителами. При инвазивном механизме заболевание вызывается проникновением бактерий в ткани организма, поэтому иммунный ответ направлен на экранирование поверхностных структур бактерий, позволяющих им фиксироваться на поверхности клеток организма-хозяина. В ответ на введение вакцины в организм происходит активация иммунной системы в виде ряда последовательных этапов. При этом, в процессе антителообразования условно можно выделить три фазы. Первая фаза охватывает время от момента введения вакцины до формирования антителопродуцирующих клеток. Ее можно разделить на ряд последовательных этапов: - захват антигена антигенпрезентирующими клетками (АПК); - презентация информации об антигене АПК Т-лимфоцитам; - пролиферация и дифференцировка Т-клеток с появлением регуляторных хелперов и супрессоров, цитотоксических Т-клеток; - активация В-клеток с превращением их в плазматические антителпродуцирующие клетки. Вторая фаза – это собственно продукция антител, вплоть до их максимального уровня. Она состоит из двух этапов: - продукции специфических антител; - формирование клеток памяти. Третья фаза наступает после достижения наивысшего уровня иммунного ответа, когда концентрация антител медленно снижается в течение месяца, а иногда и многих лет. К вакцинам относятся лекарственные препараты, получаемые из бактерий, вирусов, грибов, простейших, а также из продуктов их жизнедеятельности, предназначенные для активной иммунизации с целью профилактики и терапии инфекционных, грибковых и паразитарных болезней. Производство вакцин требует специальных условий, связанных прежде всего с необходимостью обеспечения безопасности работы с возбудителями инфекционных заболеваний. Современное производство медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) должно быть основано на соблюдении правил GMP (практика качественного производства) и четкой системе государственного контроля производства препаратов. В России правила по производству биологических препаратов утверждены в 1994 году и называются «Производство и контроль иммунобиологических препаратов для обеспечения их качества». В 180 документе четко прописаны требования к персоналу производства вакцин, к производственным и складским помещениям, оборудованию, документации, сырью, материалам, реактивам, процессу производства, контролю качества продукции на разных этапах производства, к упаковке и маркировке продукции, к отделу биологического и технологического контроля, правила отбора образцов продукции на контроль, условия транспортирования и хранения препаратов. Современное производство вакцин во многом зависит от уровня используемой технологии. Среди научных задач, влияющих на уровень технологии, наиболее важными являются: изучение антигенной структуры возбудителя, разработка новых способов выделения и очистки антигенов, поиски путей повышения иммуногенности вакцин (использование адьювантов), конструирование новых вакцинных препаратов. Основными этапами в разработке технологии получения вакцин являются: - Получение и характеристика исходного штамма. - Получение биомассы (стадия культивирования) - Получение антигена. - Инактивация, очистка, стерилизация антигена. - Разлив. - Упаковка. Контроль качества вакцин проводится по показателям безвредности и иммуногенности с использованием разнообразных лабораторных животных. Для получения антигена используют биосинтез или химический синтез. При получении биомассы особое значение имеет способ культивирования возбудителя, способный обеспечить высокий выход антигена. Для выделения антигена применяют различные физико-химические методы: изоэлектрическое осаждение кислотами и щелочами, высаливание нейтральными солями, осаждение спиртом, сорбцию и элюцию, ультрафильтрацию, колоночную хроматографию, методы афинной хроматографии. Технология должна предусматривать наиболее щадящие способы инактивации выделенных антигенов. Для инактивации применяют формалин, фенол, перекись водорода, ацетон, нагревание и другие способы. Для стерилизации растворов, содержащих антиген, применяют термическую обработку, облучение и микрофильтрацию. Лекарственная форма вакцин зависит от способа их применения. Например, энтеральные вакцины должны иметь кислотоустойчивое покрытие, аэрозольные вакцины, как правило, не содержат адъюванты и 181 консерванты, могут не содержать наполнитель. Некоторые вакцины выпускаются непосредственно в шприцах (вакцина «Ваксигрипп»). Итак, в состав вакцин входят три группы компонентов: 1. Антигены, обеспечивающие специфическую невосприимчивость организма к данному заболеванию. 2. Вещества, вносимые в вакцины с целью обеспечения стабильности их антигенных свойств (стабилизаторы – альбумин человека, сахароза и др.), поддержания стерильности (консерванты – натрия мертиолят и др.), повышения иммуногенности (адъюванты – алюминия гидроксид, алюминия фосфат и др.). 3. Примеси – вещества, присутствие которых в вакцинах обусловлено технологией производства и очистки препарата (компоненты субстрата культивирования). Все вакцины по входящему в их состав антигену можно разделить на следующие группы: 1. Живые вакцины. 2. Инактивированные корпускулярные (цельновирионные) вакцины. 3. Химические вакцины. 4. Анатоксины. 5. Конъюгированные вакцины. 6. Вакцины с искусственными адъювантами. 7. Комбинированные вакцины. 8. Рекомбинантные вакцины. 1. Живые вакцины. Живые вакцины получают, используя аттенуированные (ослабленные) штаммы бактерий и вирусов. Основным свойством вакцинных штаммов, принципиально отличающих их от патогенных, является стойкая утрата ими способности вызывать в организме человека типичное инфекционное заболевание. Вакцинные штаммы, применяемые в производстве живых вакцин, получают разными путями: 1. Путем выделения аттенуированных мутантов от больных (вакцинный штамм вируса паротита Geryl Lynn). 2. Из внешней среды путем селекции вакцинных штаммов (штамм СТИ сибирской язвы). 3. Путем длительного пассирования в организме экспериментальных животных и куриных эмбрионов (штамм 17 D вируса желтой лихорадки). 4. Методом гибридизации «актуальных» эпидемических штаммов 182 вируса с холодоадаптированными штаммами, безвредными для человека (гриппозные вакцины). 5. Воздействием на патогенные культуры различными химическими, физическими и биологическими мутагенами с последующим отбором непатогенных вариантов, сохранивших иммунные свойства (метод ступенчатой селекции). Наряду с генетически закрепленной утратой патогенных свойств и потерей способности вызывать у человека инфекционное заболевание вакцинные штаммы сохраняют способность размножаться в месте введения и далее в регионарных лимфатических узлах и внутренних органах. В этом случае возникает вакцинная инфекция, которая продолжается несколько недель. Однако эта инфекция не сопровождается клинической картиной заболевания и приводит к формированию иммунитета к патогенным штаммам микроорганизмов. Лишь в единичных случаях могут возникать вакцинноассоциированные заболевания, связанные с остаточной вирулентностью вакцинного штамма, реверсией его вирулентных свойств, наличием у привитых иммунодефицитных состояний или нарушением перечня возможных противопоказаний к вакцинации. В этом случае появляются клинические признаки инфекционного заболевания, против которого проведена прививка. Живые вакцины создают прочный и длительный иммунитет, по напряженности приближающийся к постинфекционному иммунитету. Для создания прочного иммунитета во многих случаях достаточно одной инъекции вакцины. Такие вакцины могут вводиться в организм достаточно простым методом, например, скарификационным или пероральным методом. Для обеспечения безопасности живых вакцин необходимо иметь генетически стабильный гомогенный аттенуированный штамм и проводить постоянный контроль реверсии вирулентности возбудителя. В связи с тем, что основу этих вакцин составляют живые микроорганизмы, следует строго соблюдать требования, обеспечивающие сохранение жизнеспособности микроорганизмов и специфической активности препарата. Большинство живых вакцин выпускается в сухом лиофилизированном виде. Такие вакцины имеют достаточно длительный (до года и более) срок годности. Живые вакцины следует хранить и транспортировать при 4—8 °С. Замораживание таких вакцин не оказывает существенного влияния на их активность (характерно только для живых вакцин). В живых вакцинах нет консервантов. 183 Инфекции, для профилактики которых применяются живые вакцины грипп, корь, полиомиелит, сибирская язва, туберкулез, сыпной тиф, туляремия, чума, бруцеллез, желтая лихорадка, эпидемический паротит. 2. Инактивированные корпускулярные (цельновирионные) вакцины Получают путем инактивации бактерий или вирусов физическими или химическими мутагенами: прогревание при температуре 50-60 оС, воздействие ультрафиолетовыми лучами, обработка формалином, спиртом, фенолом и другими веществами. Используемые для инактивации вещества должны обеспечивать минимальное повреждение структуры антигена. Храниться вакцины должны при температуре 4—8 °С, замораживание жидких инактивированных вакцин ведет к уменьшению активности препаратов и повышению их реактогенности за счет выхода отдельных компонентов в жидкую фазу, конформационных изменений белков и других причин. Инактивированные вакцины обладают в целом более низкой иммуногенностью по сравнению с живыми вакцинами, но при повторном введении создают достаточно стойкий иммунитет. Наиболее частый способ применения — парентеральный. Одна из особенностей производства инактивированных вакцин заключается в необходимости строгого контроля за полнотой инактивации вакцин. Инфекции, для профилактики которых используются инактивированные вакцины: бешенство, грипп, клещевой энцефалит, коклюш, холера, гепатит А, герпес, брюшной тиф, лептоспироз, сыпной тиф. Хотя эффективность инактивированных бактериальных и вирусных вакцин в целом ниже, чем живых, однако, они менее реактогенны. 3. Химические вакцины представляют собой наиболее активные антигены, извлекаемые из микробных клеток с помощью кислот, спиртов, ферментов или разрушением вирионов с помощью физических или химических методов. Для очистки выделенных антигенов используют: ультрафильтрацию, центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы, гель-фильтрацию, хроматографию на ионообменниках, аффинную хроматографию. Достигается высокая (до 95 % и выше) степень очистки вакцины. Основной принцип получения химических вакцин заключается в выделении протективных антигенов, обеспечивающих развитие надежного иммунитета, и очистки этих антигенов от балластных веществ. Химические вакцины обладают слабой реактогенностью, могут вводиться в больших дозах и многократно. Для усиления эффективности химических вакцин применяются адъюванты. Химические вакцины, особенно сухие, устойчивые к влиянию внешней среды, 184 хорошо стандартизуются и могут применяться в различных ассоциациях, направленных одновременно против ряда инфекций. Инфекции, для профилактики которых используют химические вакцины: грипп, менингококковая инфекция, брюшной тиф, холера. 4. Анатоксины. Анатоксины представляют собой бактериальные экзотоксины, обезвреженные длительным воздействием формалина при повышенной температуре. Подобная технология получения анатоксинов позволяет сохранять антигенные и иммуногенные свойства токсинов, делает невозможной реверсию их токсичности. При этом необходимо периодически проверять возможную реверсию их токсичности. В процессе производства анатоксины подвергают очистке от балластных веществ (питательной среды, других продуктов метаболизма и распада микробной клетки) и концентрации. Эти процедуры снижают их реактогенность и позволяют использовать для иммунизации небольшие объемы препарата. Впервые анатоксины (дифтерийный и столбнячный) были получены французским ученым Рамоном в 1916 году. Очищенный от балластных веществ и концентрированный анатоксин сорбируют на гидроксиде алюминия. Анатоксины обеспечивают формирование антитоксического иммунитета, который, естественно, уступает иммунитету, образующемуся после перенесенного заболевания, и не предотвращают появление бактерионосительства. В связи с этим не прекращаются попытки создания комбинированных вакцин, содержащих, кроме анатоксина другие фрагменты антигенов бактерий. Инфекции, для профилактики которых применяют анатоксины: дифтерия, столбняк, газовая гангрена, холера, ботулизм, стафилококковые и синегнойные инфекции. 5. Конъюгированные вакцины. Конъюгированные вакцины представляют собой конъюгаты полисахарида, полученного из возбудителей инфекций, и белкового носителя (дифтерийного или столбнячного анатоксина). Полисахариды относятся к Т-независимым антигенам. Они обладают слабой иммуногенностью и слабой способностью к формированию иммунологической памяти. Иммуногенные свойства полисахаридов резко усиливаются, если их конъюгировать с белковым носителем. В практике вакцинопрофилактики существует две конъюгированные вакцины вакцина против гемофильной типа Б инфекции и менингококковая вакцина группы С. Разрабатываются также брюшнотифозная конъюгированная вакцина. 185 6. Вакцины с искусственными адъювантами. Принцип создания вакцин с искусственными адъювантами заключается в использовании естественных антигенов и синтетических носителей. Одним из вариантов таких вакцин является гриппозная вакцина, состоящая из белков вируса гриппа (гемагглютинина и нейраминидазы) и искусственного иммуномодулятора—полиоксидония, обладающего выраженными адъювантными свойствами. Перспективы разработки новых вакцин. Говоря о перспективах разработки вакцинных препаратов, следует подчеркнуть, что идеальной вакциной может считаться та, которая при однократном введении непарентеральным методом формировала бы пожизненный протективный иммунитет к большинству актуальных инфекционных болезней, не давая при этом никаких побочных эффектов. В настоящее время не существует препарата, который полностью соответствовал бы указанным выше требованиям, однако к решению такой задачи стремятся все создатели вакцин. С момента гениального опыта Э. Дженнера (1796 г) прошло более 200 лет, за которые разработаны вакцины против очень многих инфекционных заболеваний, часть из которых используется для активной иммунизации в большинстве стран мира. В 1974 году ВОЗ была принята Расширенная программа иммунизации (РПИ), основными задачами которой являются уменьшение заболеваемости и детской смертности, увеличение длительности жизни людей, обеспечение активного долголетия и ликвидация некоторых инфекций. В реализации этой программы участвуют практически все страны – члены ВОЗ. Разработка новых вакцин ведется по следующим основным направлениям: 1. создание комбинированных вакцин на основе существующих монопрепаратов; 2. расширение номенклатуры вакцин; 3. использование новых технологий. Наиболее реальной перспективой должно стать создание двух базовых многокомпонентных вакцин на основе существующих монопрепаратов. Одна из них должна основываться на базе АКДС + трехвалентная полиовакцина + вакцина против гепатита В + герпетическая вакцина + конъюгированная вакцина против гемофильной инфенкции типа В. Вторая базовая вакцина направлена против кори, паротита, краснухи и полиемиелита. Бурное развитие вакцинологии привело к существенному возрастанию количества прививок, получаемым каждым индивидуумом. Число инъекций, получаемых детьми первых двух лет жизни в развитых странах мира, составляет 16 инъекций. Предполагается, что календарь прививок к 2025 году будет включать вакцинацию против 35-40 инфекций. 186 Изменения в календаре прививок не могли не привести к появлению целого комплекса проблем: - увеличивается риск инфицирования детей, в том числе и такими опасными возбудителями, как вирус гепатита В; - кумулятивный эффект консерывантов и вспомогательных веществ, входящих в состав вакцин. - вследствие необходимости контроля за большим количеством вакцин, возрастает возможность введения некачественного препарата; - выполнение множества в той или иной степени болезненных процедур порождает проблемы морально-этического плана, в частности, во взаимоотношениях с родителями; - возрастает нагрузка на медицинский персонал; - увеличивается стоимость программ иммунизации и, соответственно, снижается их экономическая эффективность. Наиболее реальным выходом из сложившейся ситуации является разработка комбинированных вакцин. 7. Комбинированные вакцины Разработка комбинированных вакцин обычно проводится на основе существующих монопрепаратов. К комбинированным вакцинам, выпускаемым в России, относятся вакцины АКДС, менингококковая А+С, а также АДСанатоксины. Пермское НПО «Биомед» совместно с НПК «Комбиотех» (г. Москва) разработали комбинированные вакцины Бубо-М и Бубо-Кок для профилактики дифтерии, столбняка, коклюша и гепатита В. Значительно большее количество комбинированных вакцин выпускается за рубежом. К ним можно отнести: вакцину против коклюша, дифтерии, столбняка и полиомиелита (инактивированную) — Тетракок 05; вакцину против коклюша, дифтерии, столбняка, полиомиелита (инактивированную) и гемофильной инфекции типа b — ПЕНТАктХИБ; вакцину против кори, краснухи, эпидемического паротита — MMR, Приорикс. Необходимо подчеркнуть, что комбированные препараты внедряются в медицинскую практику только в том случае, если результаты, полученные при их клиническом испытании, свидетельствуют, что их антигенная активность не отличается от антигенной активности монопрепаратов, а чаще всего превышает, и при этом не происходит потенцирования реактогенности. Несмотря на значительные успехи в создании вакцин против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш, столбняк, оспа и полиомиелит, производство современных вакцин сталкивается с целым рядом ограничений: • Не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для многих заболеваний вакцины не созданы. 187 • Для получения вирусов животных и человека необходима дорогостоящая культура животных клеток. • Титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размножения часто бывают очень низкими, что удорожает производство вакцин. • Необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы не допустить инфицирования персонала. • При нарушении производственного процесса в некоторые партии вакцины могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, что может привести к неумышленному распространению инфекции. • Аттенуированные штаммы могут ревертировать к исходному штамму, поэтому необходимо постоянно контролировать вирулентность. • Некоторые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с помощью традиционных вакцин. • Большинство современных вакцин имеют ограниченный срок годности и сохраняют активность только при пониженной температуре, что затрудняет их использование в развивающихся странах. В последнее десятилетие, с развитием технологии рекомбинантных ДНК, появилась возможность создать новое поколение вакцин, не обладающих недостатками традиционных вакцин. Разработка новых технологий Имеется необходимость в разработке хламидийной вакцины и вакцины против Не1iоbасtег ру1оri, в создании эффективных вакцин для профилактики грибковых и паразитарных болезней, диарейных заболеваний, вызванных ротавирусами, шигеллами, энтеротоксигенными Е. соli, вакцин против респираторного синцитиального вируса и вируса парагриппа. В мире нет вакцин против онкологических болезней. В основе противоопухолевого иммунитета лежат клеточные реакции, поэтому попытки лечения онкологических больных только с помощью специфических для опухоли антител, как правило, не приносят успеха. В экспериментальных условиях постоянно испытываются различные варианты вакцин. Наиболее перспективными считаются молекулярно-генетические вакцины, содержащие гены, контролирующие синтез ассоциированных с опухолью антигенов. Такие вакцины проходят испытания в клинике, предварительные данные свидетельствуют о возможности индукции гуморального и клеточного иммунитета. Следует подчеркнуть тесную связь между инфекционными, прежде всего вирусными, заболеваниями и онкологическими болезнями, так установлена роль вирусов гепатита В и С в развитии первичного рака печени, вируса 188 герпеса и рака шейки матки. Иммунизация против инфекций, вызванных этими вирусами, является одновременно профилактикой онкологических заболеваний. Актуальны разработки вакцин для профилактики грибковых и диарейных заболеваний. Генноинженерные вакцины. Принцип создания генноинженерных вакцин заключается в том, что в геном живых аттенуированных вирусов, бактерий, дрожжей или клеток эукариотов встраивается ген, кодирующий образование протективного антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина. Получаемые подобным образом клетки могут быть или разрушены с целью выделения и последующей очистки соответствующего антигена – рекомбинантные вакцины, или вводятся в организм – векторные вакцины. Пример успешной реализации первого подхода — получение HBsантигена, клонированного в клетках дрожжей. Изготовленная таким способом вакцина вытеснила теперь HBs-вакцину первого поколения, которую приходилось готовить трудоемким методом выделения HBs-антигена из крови носителей вируса и последующей очистки. Новый способ получения позволил снизить и стоимость вакцины. В процессе создания рекомбинантных вакцин можно выделить несколько стадий: 1.Выделение гена, кодирующего протективный антиген из организма возбудителя заболевания. 2.Внедрение гена в геном организма, продуцента белкового антигена. 3.Культивирование модифицированного микроорганизма in vitro. 4.Выделение и очистка требуемого антигенного продукта, используемого затем, как вакцинный препарат. Для создания векторных живых вирусных вакцин используют аттенуированный ДНК-содержащий вирус, в геном которого встраивается необходимый предварительно клонированный ген. Вирусный вектор создает иммунитет против заболеваний: 1 – заболевания, вызываемого данным вирусом; 2 - заболевания, вызываемого инфекционным агентом – хозяином встраиваемой в вирусный геном ДНК. Экспериментальные векторные вакцины на основе вируса осповакцины получены к ветряной оспе, гриппу А, гепатиту А и В, малярии, простому герпесу. Другой подход к созданию вакцины заключается в использовании в роли векторов аттенуированных бактерий. Естественным кандидатом такого вектора представляется вакцина БЦЖ (от франц. BCG — bacille Calmette—Guerin), 189 поскольку геном этих бактерий по расчетам достаточно велик для включения генов любых других микробов. В качестве вектора можно также использовать также ряд мутантных штаммов сальмонелл, способных при пероральном введении проиммунизиро-вать лимфоидную ткань кишечника. Эти бактерии идеально подходят как векторная вакцина для индукции местного иммунитета в кишечнике — очень важная задача, если учесть, что диарейные заболевания составляют главную причину детской смертности на земном шаре. Еще одно преимущество аттенуированных микроорганизмов как векторов заключается в том, что их могут поглощать макрофаги, вызывая в результате системный иммунный ответ вследствие миграции в другие части тела. Наибольшее количество векторных вакцин разработано на основе вируса оспы и аттенуированных мутантных штаммов сальмонелл. За рубежом получены рекомбинантные вирусы оспы, способные к экспрессии антигенов вирусов кори, гепатита А и В, японского энцефалита, герпеса простого, бешенства, Эпштейна—Барр, ротавирусов, лепры, туберкулеза. При этом разработанные в США вакцины, предназначенные для профилактики кори, японского энцефалита, папилломатоза человека, геморрагической лихорадки с почечным синдромом (восточный серотип), уже проходят клинические испытания. Для создания этих вакцин в качестве вектора используют штаммы вируса оспы с относительно низкой вирулентностью (NYCBOH, WR). На основе сальмонеллезного вектора созданы и изучаются препараты столбнячного и дифтерийного анатоксинов, вакцины для профилактики гепатита А, инфекций, вызванных ротавирусами и энтеротоксигенной кишечной палочкой. Последние два рекомбинантных препарата в связи с энтеральным введением сальмонелл представляются весьма перспективными. ДНК-вакцины. Относительно недавно было обнаружено, что для иммунизации можно использовать ДНК как таковую при условии ее внутримышечного введения вместе с подходящим промотором. Такие ДНКвакцины представляются весьма перспективными, поскольку они обеспечивают развитие напряженного как гуморального, так и клеточного иммунитета. В настоящее время интенсивно разрабатываются вакцины из плазмидных ДНК, кодирующих протективные антигены возбудителей инфекционных болезней. Такая ДНК, введенная животному, проникает в ядро клетки, длительное время существует вне хромосом без репликации, транскрибируется и экспрессирует соответствующие антигены, вызывающие в организме привитого формирование иммунитета. ДНК-вакцины сохраняются в организме 3-4 недели. За это время ДНК-вакцина индуцирует Т- и В-клеточный иммунитет. 190 Для приготовления ДНК-вакцины можно использовать смесь ДНК, которая обеспечивает образование разных антигенов против одной или (теоретически) против нескольких инфекций. Проблемы безопасности при разработке вакцин из плазмидной ДНК являются наиболее важными. 1. Прежде всего, следует исключить онкогенную опасность. Еще недостаточно изучено, может ли вводимая ДНК встраиваться в геном клетки человека и вызывать мутагенный эффект. 2. Длительная экспрессия антигена может вызывать иммунопатологические реакции. Образование антигена в организме может продолжаться более месяца. Это может привести к развитию различных форм иммуносупрессии и других патологических явлений. 3. Чужеродная ДНК может вызывать образование анти-ДНК-антител, которые в силу перекрестных свойств способны индуцировать различные формы аутоагрессии и иммунопатологии. 4. Сам экспрессированный антиген может обладать побочным биологическим действием. На животных изучены вакцины из ДНК вирусов приобретенного иммунодефицита человека, гриппа, бешенства, гепатитов В и С, простого герпеса, папилломатоза, а также возбудителей малярии, лейшманиоза, туберкулеза. На стадии клинических испытаний находится ДНК-вакцина против малярии, ВИЧ-инфекции, гриппа, гепатита В. Способы введения вакцин. Вакцины на основе трансгенных растений. С помощью методов генной инженерии представляется возможным “внедрить” чужеродные гены почти во все технические сельскохозяйственные культуры, получив при этом стабильные генетические трансформации. С начала 90-х годов проводятся исследования по изучению возможности использования трансгенных растений для получения рекомбинантных антигенов. Данная технология особенно перспективна для создания оральных вакцин, поскольку в этом случае рекомбинантные белки, образуемые трансгенными растениями, могут действовать непосредственно, вызывая оральную иммунизацию. Естественно, что это происходит в тех случаях, когда растительный продукт используется как пища, не подвергаясь при этом термической обработке. Помимо использования растений как таковых, образуемый ими антиген может извлекаться из растительного сырья. В первоначальных исследованиях была использована модель: табак HBsAg. Из листьев трансгенных растений выделен вирусный антиген, по своим иммуногенным свойствам почти не отличающийся от рекомбинантного HBsAg, продуцируемого клетками дрожжей. В дальнейшем получен трансгенный 191 картофель, продуцирующий антиген энтеротоксигенной кишечной палочки и антиген вируса Norwalk. В настоящее время начаты исследования по генетической трансформации бананов и сои. Подобного рода “растительные вакцины” весьма перспективны: - во-первых, в ДНК растений может быть встроено до 150 чужеродных генов; - во-вторых, они, будучи пищевыми продуктами, применяются орально; - в-третьих, их использование приводит не только к образованию системного гуморального и клеточного иммунитета, но и к развитию местного иммунитета кишечника, так называемого иммунитета слизистых (mucosal immunity). Последний особенно важен при формировании специфической невосприимчивости к кишечным инфекциям. Микрокапсулированные вакцины. Для получения таких вакцин используются биодеградирующие микросферы, которые с одной стороны предохраняют антиген от вредного влияния окружающей среды, а с другой стороны распадаются и освобождают антиген в заданное время. Микрокапсулы состоят из нетоксичных неантигенных полимеров лактида или гликолида, или их сополимеров. Микросферы могут быть разной величины, максимальный диаметр обычно не превышает 10 микрон. Вакцины можно вводить любым способом (парентерально, орально, интраназально и пр.). В экспериментальных условиях испытано несколько десятков таких вакцин. С помощью микросфер можно проводить комплексную вакцинацию против нескольких инфекций одновременно: каждая капсула может содержать несколько антигенов, а для иммунизации можно брать смесь различных микрокапсул. Таким образом, микрокапсулирование позволяет значительно сократить количество инъекций при вакцинации. Кроме того, сами микрокапсулы обладают выраженным адъювантным действием. Это позволяет уменьшить дозы вводимых антигенов. Требуют дальнейшего исследования вопросы стабилизации микрокапсулированных вакцин и утилизации деградирующих полимеров и возможности использования непарентеральных способов иммунизации. Синтетические пептидные вакцины. Альтернативой иммунизации живыми и инактивированными вакцинами являются идентификация пептидных эпитопов антигена, которые определяют необходимый иммунный ответ, и использование синтетических аналогов этих пептидов для производства вакцин. В отличие от традиционных вакцинных препаратов данные вакцины, будучи целиком синтетическими, не несут в себе риска реверсии или неполной инактивации, помимо этого, эпитопы могут быть селекционированы и освобождены от компонентов, которые определяют развитие побочного действия. Использование пептидов создает возможность изготовления антигенов, 192 которые трудно воспроизвести в достаточном количестве, применяя природные источники сырья, например паразитарные антигены, а также открывает перспективу создания иммунитета к антигенам, которые в обычных условиях не распознаются. К последним относятся “собственные” антигены, такие как опухолевоспецифические антигены при различных формах рака. Пептиды могут быть конъюгированы с носителем или инкорпорированы в него. В качестве носителя возможно использование белков, полисахаридов, полимеров, липосом. При доклинических испытаниях подобного рода препаратов приобретает особое значение изучение возможных перекрестных реакций образуемых антител с тканями человека, поскольку образовавшиеся аутоантитела могут стать причиной развития аутоиммунных патологических состояний. Пептидные вакцины могут быть присоединены к макромолекулярным носителям (например, к столбнячному анатоксину) или использоваться в комбинации с бактериальным липидным мицелием. Таким образом, человечество вступает в XXI век, имея за плечами солидный багаж по разработке как новых вакцин, так и новых технологий их получения и способов применения. Это дает основание надеяться на то, что начало нового века ознаменуется дальнейшими успехами в ликвидации одних и резком уменьшении других инфекционных и паразитарных болезней, которые в конце нынешнего столетия ежегодно являются причиной смерти более 15 млн. человек. Липосомальные вакцины. Липосомы представляют собой пузырьки с двухслойной мембраной, состоящей из фосфолипидов, их используют для транспортирования антигенов к антигенпрезентирующим клеткам. Размеры липосом варьируют от 0,01 до 150 мкм. Антигены могут включаться в липосомы в растворимой водной фазе или прикрепляться к мембране. При этом происходит как снижение их токсичности, так и более продолжительная циркуляция. Установлено также, что липосомы потенцируют иммунный ответ на включенный в них бактериальный, вирусный или паразитарный антиген, являясь, таким образом, иммунными адъювантами. Наиболее распространенный метод изготовления липосом — механическая дисперсия. При этой процедуре липиды (например, холестерин) растворяют в органическом растворителе (обычно в смеси хлороформа и метанола) и затем высушивают. К образующейся при этом липидной пленке добавляют водный раствор, в результате чего образуются многослойные пузырьки. Липосомы оказались весьма перспективной формой при использовании в качестве антигенов пептидов, поскольку они стимулировали при этом образование как гуморального, так и клеточного иммунитета. 193 В настоящее время в ветеринарной практике используются липосомальные вакцины против болезни Ньюкастла и реовирусной инфекции птиц. В Швейцарии впервые разработана лицензированная липосомальная вакцина против гепатита А и проходят испытание липосомальные вакцины для парентеральной иммунизации против гриппа; гепатита А и В; дифтерии, столбняка и гепатита А; дифтерии, столбняка, гриппа, гепатита А и В. В США осуществляется клиническое испытание липосомальной гриппозной вакцины из гемагглютинина и проходит доклиническое изучение вакцина липосомальная менингококковая В. Хотя в большинстве исследований липосомы использовались для системной иммунизации, имеются работы, свидетельствующие об их успешном применении для иммунизации через слизистые желудочно-кишечного тракта (вакцина эшерихиозная, шигеллезная Флекснера) и верхних дыхательных путей, при этом развивается как общий, так и местный секреторный иммунитет. Антиидиотипические вакцины. Их создание коренным образом отличается от ранее описанных методик получения вакцин и заключается в изготовлении ряда моноклональных антител к идиотипам молекул иммуноглобулина, обладающего протективной активностью. Препараты таких антиидиотипических антител по своей пространственной конфигурации подобны эпитопам исходного антигена, что позволяет использовать эти антитела взамен антигена для иммунизации. Подобно всем белкам, они способствуют развитию иммунной памяти, что весьма важно в тех случаях, когда введение соответствующих антигенов не сопровождается ее развитием. Требования к идеальной вакцине: 1. Химический состав и структура компонентов вакцин (антигенов, адъювантов, носителей и прочее) должны быть точно установлены. 2. Вакцина должна вводиться один раз. 3. Вакцина должна быть комплексной и создавать иммунитет ко многим инфекциям. 4. Вакцина должна обеспечивать пожизненный иммунитет у 100 % привитых. 5. Вакцина должна быть безопасной и не оказывать побочного действия. 6. Вакцина должна вводиться удобным для медицинского персонала и пациентов методом. 7. Вакцина должна быть стабильной, иметь длительный срок хранения. 8. Вакцина не должна нуждаться в соблюдении «холодовой цепи». 9. Технология изготовления вакцин должна отвечать современным требованиям. 10.Стоимость вакцин не должна быть высокой. 194 Лекция 13.Биотехнология витаминов План лекции 1.Роль витаминов в медицине, промышленности, сельском хозяйстве. 2.Микробиологический синтез витаминов В2, В12 и Д3, ß-каротина (провитамин жирорастворимого витамина А) 3.Перспективы развития микробиологического способа получения витаминов. Литература 1.Егорова Т.А., Клунова М.С., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. М., 2003. 2.Егоров Е.А. Промышленная микробиология. М., 1993. 3.Перумов Д.А. Генетика. М., 1986, Т.22.- №5. 4.Чуешов В.И., Зайцев А.И., Шебанова С.Т., Чернов Н.Е. Промышленная технология лекарств. Харьков, 2002.- С.276-300. Вопросы к лекции 1.Сформулируйте особенности биотехнологических производств витаминов. 2. Расскажите о технологии витаминов В2, В12, D2, β-каротина по следующей схеме: штамм-продуцент, особенности биосинтеза, очистка готового продукта. 195 Витамины представляют собой группу незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний. Необходимость в крупномасштабном производстве веществ с витаминной активностью определяется широкой областью их применения. Витамины применяют в следующих областях: 1. Сельское хозяйство – витаминные концентраты для повышения продуктивности животноводства. 2. Пищевая промышленность – добавки для повышения полноценности продуктов питания. 3. Здравоохранение и медицина – витамины применяют здесь как лечебно-профилактические средства в индивидуальном виде и в виде комбинированных препаратов. Производство витаминов осуществляется следующими основными путями: Экстракция витаминных препаратов из растительного или животного сырья. С этого направления начиналась витаминная промышленность, т.к. первые витаминные препараты были получены именно таким путем. Но в настоящее время доля витаминов, получаемая этим путем незначительна, ввиду очень низкого содержания их в природном сырье. Химический синтез занимает ведущее место в современной витаминной промышленности, т.к. основная номенклатура витаминных препаратов представлена веществами, полученными химическим синтезом из химических видов сырья или сочетанием химического синтеза с биосинтезом. Биосинтез витаминов. Витамины, химический синтез которых невозможен в крупномасштабном производстве или нецелесообразен, получают с применением микроорганизмов, способных к сверхсинтезу и накоплению определенных витаминов. Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов – продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них, создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Наиболее целесообразно таким путем производить особо сложные по строению 196 витамины: В2, В12 , ß- каротин (провитамин А) и предшественники витамина Д. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Получение микробиологическим способом витамина В2 (рибофлавин) До 30-годов прошлого столетия В2 выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен суперпродуцент рибофлавина – биообъект из группы актиномицетов - гриб Eremоthecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 3-7 кг витамина В2. Технологический процесс производства кормового концентрата витамина В2 Состоит из трех основных стадий: 1.Аэробная ферментация. 2. Термолиз и концентрирование. 3. Сушка, размол, гранулирование и упаковка. 1. Посевной материал и стерильный воздух получают по типовой для многих микробиологических производств схеме. Основными ингредиентами питательной среды является соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, хлорид натрия, технический жир, витамины, карбонат кальция. Процесс ферментации осуществляется в типовых ферментаторах объемом 63-100 м3 в стерильных условиях при температуре 28-30 0С. Время культивирования 60-80 ч. до начала лизиса клеток и образования спор. При этом содержание рибофлавина в культуральной жидкости достигает 1200 мг/л. 2. По окончании процесса ферментации культуральную жидкость вместе с мицелием передают в вакуум-выпарные аппараты, где ее нагревают до 80 0 с целью разрушения (термолиза) клеточных структур и одновременно ведут процесс концентрирования (упаривания) до содержания сухих веществ 30-40%. 3. Полученный после упаривания концентрат в виде сиропообразной биомассы высушивают в распылительной сушилке типа «Ангидро» до содержания влаги не более 8%. В результате получают смесь биомассы мицелия Е.Ashbyii и сухих остатков питательной среды. Для получения однородного витаминного концентрата смесь размалывают и просеивают. На современных предприятиях концентрат далее гранулируют и упаковывают. В 1983 г. во ВНИИ генетики микроорганизмов сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, содержащий ген рибофлавинового оперона. Полученный штамм продуцент витамина В2 способен синтезировать 4 г/л В2 всего за 35-40 ч. ферментации. 197 Получение микробиологического ß-каротина ß-каротин является провитамином жирорастворимого витамина А (ретинола). Помимо своего провитаминного действия каротин нашел применение для профилактики и лечения многих заболеваний: он обладает радиопротекторными свойствами, усиливает лечебное действие некоторых противоопухолевых препаратов. Во многих странах, включая Россию, каротин используется в качестве пищевой добавки к хлебу, маслам, маргарину. Его применяют и для изготовления косметических средств. Широкая область применения ß-каротина предопределяет необходимость его производства в достаточно большом объеме. До начала 60-х годов ХХ в. производство каротина осуществлялось исключительно путем экстракции из растительного сырья (морковь и тыква). Но относительно невысокое содержание каротиноидов в растительном сырье и значительные потери в процессе экстракции целевых продуктов обуславливали очень высокую стоимость этих препаратов и большой расход сырья. Так из 1 т моркови получали лишь 72 г каротина. Разработаны методы химического синтеза как самого витамина А, так и ß-каротина. Синтез ß-каротина включает 12-15 химических стадий с общим выходом 25%. В начале 60-х годов ХХ в. разработана схема микробиологического синтеза ß-каротина, которая и стала основой промышленного способа его получения. Установлено, что ß-каротин и каротиноиды образуют фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи . В отечественном производстве, в основном, используются культуры гриба Blakeslea trispora (плесневые грибы). Эти штаммы способны синтезировать от 2000 до 3200 мг каротина в 1 л культуральной жидкости. Установлено, что интенсивный биосинтез и накопление ß-каротина происходит в основном во второй фазе развития, которая характеризуется прекращением роста мицелия, снижением РН-среды и снижением содержания липидов в культуральной жидкости вследствии активной их переработки в ß-каротин. Основные стадии производства микробиологического ß-каротина: 1. Подготовительная стадия: а) подготовка посевного материала, б) подготовка питательной среды, в) стерилизация воздуха. 2. Стадия ферментации 3. Термолиз и фильтрование мицелия 4. Сушка и размол биомассы. 198 Подготовительная стадия производства  Подготовка посевного материала Главная особенность подготовки посевного материала в производстве ßкаротина – раздельное выращивание положительных и отрицательных форм мицелия. Их слияние происходит лишь в ферментаторах. Режим выращивания обеих форм мицелия в посевных аппаратах одинаковый, также как и состав среды. Однако соотношение + и – форм мицелия экспериментально подбирается в микробиологической лаборатории и составляет 1 : 15, т.е. мужской формы (отрицательной) берется с пятнадцатикратным избытком.  Подготовка питательной среды Основу питательной среды составляют пшеничная или рисовая мука и растительные масла (хлопковое, кукурузное или подсолнечное). Кроме того, в питательную среду добавляют пеногасители (ПАВы), антиокислители (лимонная, аскорбиновая кислоты), витамины и стимуляторы синтеза ßкаротина (изониазид, β-ионол). Питательную среду стерилизуют в установках непрерывной стерилизации. Иногда после стерилизации в питательную среду добавляют антибиотики для создания гарантированных стерильных условий в процессе ферментации.  Cтерилизация воздуха Стерильный воздух получают по типовой схеме характерной для микробиологических аэробных процессов. Обычно стерилизация осуществляется в 2 ступени: 1 ступень – термическая стерилизация за счет подъема температуры воздуха до 200-250 о С при его сжатии в компрессоре. 2 ступень - стерилизация в индивидуальных бакфильтрах, установленных на линии подачи стерильного воздуха в барботер каждого ферментатора и посевного аппарата.  Ферментация Осуществляется в ферментаторах вместимостью от 10 до 32 м3, снабженных барботажным устройством, трехъярусной турбинной мешалкой, рубашкой для охлаждения и внутренними теплообменниками для отвода избыточного тепла, выделяемого грибами в процессе своего роста. Выращивание культуры ведут при интенсивной аэрации и перемешивании. Температуру в культуральной жидкости поддерживают в пределах 28-300. Соотношение (-) мужской и (+) женской формы составляет 15:1. Пеногашение осуществляется механическим пеногасящим устройством. В процессе культивирования ведут постоянный контроль за ростом гриба и содержанием ß-каротина в культуральной жидкости путем отбора проб не реже, чем два раза в сутки. 199  Термолиз и фильтрация мицелия. По окончании процесса культивирования осуществляют тепловую обработку культуральной жидкости (термолиз). Для этого ее нагревают острым паром до температуры 35±50 С и выдерживают при этой температуре не менее 15 минут. Затем культуральную жидкость в горячем виде направляют на прессфильтры, где происходит отделение мицелия от нативного раствора. Мицелии промывают водой и тщательно отжимают сжатым азотом до минимального содержания влаги. Применение сжатого азота предотвращает процессы окисления ß- каротина кислородом воздуха.  Сушка и размол биомассы. Сушку биомассы осуществляют в вакуум – барабанной сушилке с ворошителем до содержания влаги не более 7%. Высушенную биомассу перемалывают в мельницах растирающего типа и просеивают через стандартное сито. Дальнейшая переработка сухой биомассы зависит от вида выпускаемой каротин-содержащей продукции. Номенклатура и формы выпуска каротин-содержащей продукции: 1. Кормовой препарат микробиологического каротина. Представляет собой высушенную, растертую и просеянную биомассу, расфасованную в полиэтиленовые мешки или барабаны. 2. Каротин в масле – это пищевое подсолнечное масло, содержащее ßкаротин (2 г/кг). Его фасуют в жестяные банки по 7 кг или в алюминиевые фляги по 50 кг и направляют на предприятия пищевой промышленности в качестве пищевой добавки в различные продукты питания. 3. Кристаллический ß-каротин. В основе получения кристаллического продукта используются процессы экстракции ß-каротина из биомассы продуцента. Раньше экстракцию осуществляли подсолнечным или другими растительными маслами и, после соответствующей обработки экстракта, кристаллический ßкаротин выделяли путем длительного процесса кристаллизации. При этом выход целевого продукта был невысок и, хотя маточные растворы использовались для получения другого продукта (каротина в масле), потери этого ценного витамина были велики. Современная технология производства кристаллического ß-каротина основана на использовании в качестве экстрагента хладона . Этот растворитель весьма избирательно и полно экстрагирует ß-каротин из сухой биомассы и затем легко удаляется из экстракта, образуя пересыщенные растворы ß-каротина в смеси липидов, из которых он кристаллизуется с минимальными потерями. Для удаления органических примесей используется обработка кубового остатка после отгонки хладона спиртом и, 200 чтобы избежать выделение примесей, кристаллизацию ß-каротина ведут при температуре 15±5 0С. Кристаллический ß-каротин представляет собой довольно крупные оранжево-красные с фиолетовым отливом кристаллы, температура плавления чистого продукта 181–182 0С. Готовый продукт фасуют в плотно закрытые стеклянные банки темного цвета, обернутые черной бумагой для защиты светочувствительного ß-каротин. Потребителем кристаллического ßкаротина является пищевая промышленность, где он применяется в тех же целях, что и каротин в масле, кроме того, этот продукт находит применение в медицинской промышленности для производства некоторых лечебнопрофилактических и витаминных лекарств. Витамин В12 (цианокобаламин) Цианокобаламин обладает высокой биологической активностью с широким спектром действия. В первую очередь он регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, является эффективным противоанемическим препаратом. Его применяют для лечения лучевой болезни, заболеваний печени, ДЦП, болезни Дауна и многих других заболеваниях. Для медицинских целей субстанцию витамина В12 получают в виде кристаллического темно-красного порошка, содержащего не менее 99% основного вещества. Из этой субстанции готовят различные лекарственные формы, такие как растворы для инъекций, таблетки. Важное значение витамин В12 имеет и для животноводства. Его недостаток тормозит рост животных, приводит к серьезным заболеваниям. Витамин В12 является необходимым фактором полноценного питания животных, так, добавление витамина к кормам, повышает продуктивность сельскохозяйственных животных на 10 – 15%. Для животноводства отечественной промышленностью выпускается концентрат витамина В12 (КМБ12), который по эффективности почти не уступает кристаллическому препарату, но является более дешевым и доступным для широкого использования в сельском хозяйстве. Получение витамина В12 Этот витамин был открыт в 1948г. одновременно в США и Англии. Полный химический синтез витамина В12 осуществлен через 25 лет, после его открытия с участием большой группы исследователей нескольких лабораторий университетов и научных центров США, Англии, Франции, Японии. Этот синтез содержит 37 стадий и имеет чисто теоретическое значение. В крупных масштабах он не воспроизведен из-за сложности процесса и не может рассматриваться как вариант промышленного производства этого важного 201 препарата. Единственным способом получения витамина В12 в промышленном масштабе, является его микробиологический синтез. Продуцентами витамина В12 при его промышленном производстве служат актиномицеты, метанобразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. В 70-х годах ХХ века интерес ученых привлекли пропионовокислые бактерии. Выделено 14 видов этих бактерий, оказалось, что они активно продуцируют витамин В12, таким образом, в качестве основного продуцента витамина В12 для медицинских целей используют пропионовокислые бактерии, а для нужд животноводства применяют смешанную культуру, содержащую метан образующие бактерии. Для получения высокоочищенных препаратов витамина В12 пропионовокислые бактерии культивируют периодическим способом на средах содержащих глюкозу, казеиновый гидролизат, витамины, неорганические соли, хлорид кобальта. При культивировании бактерий используются высокоанаэробные условия, и автоматически поддерживается рН, что позволяет получить наиболее высокий выход – 58 мг/л. Из культуральной жидкости витамина В12 выделяют экстракцией органическими растворителями ионно-обменной хроматографией с последующим осаждении из фракций в виде труднорастворимых соединений. В процессе получения витамина В12 с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. Усовершенствование технологического процесса идет в направлении удешевления компонентов питательных сред и перехода с периодического культивирования на непрерывный процесс. В последние годы исследуется возможность получения витамина с использованием иммобилизированных клеток пропионовокислых бактерий. Для нужд животноводства сотрудниками института биохимии им. А.Н. Баха РАН разработана более простая и дешевая технология получения витамина В12, в создание которой большой вклад внесли работы В.Н. Букина, В.Я. Быховского. Типовой технологический процесс производства кормового концентрата витамина В12, принятый отечественной промышленностью, включает следующие основные стадии: 1. Метановое брожение 2. Стабилизация метановой бражки 3. Концентрирование бражки 4. Сушка кормового концентрата. 5. Фасовка и упаковка. 202 Метановое брожение осуществляется смешанной культурой анаэробных метанобразующих бактерий. Источником углерода в питательной среде служит ацетонобутиловая и спиртовая барда, которую предоставляют заводы, перерабатывающие зерно. Для оптимизации питательной среды в нее добавляют соединение кобальта, который входит в состав молекулы витамина В12 и субстраты для роста метанобразующих бактерий, что позволяет значительно повысить выход витамина. Первую стадию технологического процесса – метановое брожение проводят в ферментаторах емкостью до нескольких сотен кубометров. Ацетонобутиловая барда непрерывно подается в нижнюю часть ферментатора, а сверху отбирается созревшая бражка. Продолжительность брожения составляет обычно 2-2,5 суток. Брожение осуществляется в нестерильных условиях при температуре 56 0С. Процесс метанового брожения сопровождается выделением значительных количеств газов, в основном метана и СО2, что вызывает обильное пенообразование и следовательно, требует подачи пеногасителей. Далее метановая бражка из ферментаторов поступает в выпарные аппараты. Стабилизацию метановой бражки осуществляют путем добавления сульфита натрия и подкисления бражки соляной кислотой до рН 5-5,3. Концентрирование бражки Затем бражку сгущают в 4-х корпусных выпарных аппаратах до содержания сухих веществ 20% и передают на стадию сушки. Сушка кормового концентрата. Фасовка и упаковка. Сгущенную метановую бражку высушивают в распылительной сушилке до влажности 10 – 15% и смешивают с наполнителем. В качестве теплоносителя в распылительной сушилке используют топочные газы, полученные при сжигании газов, выделяющихся в процессе метанового брожения. Готовый кормовой препарат представляет коричневый мелкодисперсный порошок. Концентрат гигроскопичен, поэтому его герметически упаковывают в полиэтиленовые мешки на более 15 кг, чтобы исключить длительное хранение продукта после вскрытия упаковки. Процесс промышленного получения витамина В12 - пример безотходной и экологически чистой технологии. Сырьем для ее реализации служат массовые отходы, а конечный продукт – биогаз (65% - метана, 30% - диоксида углерода), используется как топливо и биомасса метановых бактерий служит источником биологически активных соединений активирующих, например, рост молочнокислых бактерий. 203 Микробиологическим способом получают и витамин Д2 (эргокальциферол) Исходным продуктом производства жирорастворимого витамина Д2 является эргостерин, который в основном получают из фитопланктона, бурых и зеленых водорослей, дрожжей (пекарские и пивные), плесневых грибов. Самое большое количество эргостерина продуцируется дрожжами. Для биосинтеза эргостерина дрожжами важно, чтобы среда содержала большой избыток углеводов и мало азота. Установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей (содержание эргостерина увеличивается в 2 – 3 раза). В ближайшие годы ожидается расширение набора витаминов, получаемых методами биотехнологии. Для решения проблемы промышленного получения витаминов требуется внедрение непищевого малодефицитного сырья, разработка специальных режимов культивирования всех продуцентов, перевод процессов на непрерывные технологии, использование перспективных химико-ферментативных способов синтеза витаминов. 204 Лекция 14 . Экологические проблемы биотехнологии. План лекции 1. Экологическая биотехнология. Понятие. 2. Основные загрязнители биосферы, их характеристика. 3. Сточные воды. Методы их очистки. 4. Применение биотехнологических процессов для решения проблем окружающей среды. Литература 1. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии.М., 2003. 2. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии.- М., 2004. Вопросы к лекции 1. Охарактеризуйте основные методы очистки сточных вод. 2. Дайте понятие и охарактеризуйте штаммы-деструкторы 3. Какие пути получения экологически чистой энергии? 205 Экологическая биотехнология – это новейший подход к охране и сохранению окружающей среды при совместном использовании достижений биохимии, микробиологии, генетической инженерии и химических технологий. Круг проблем, решаемых экобиотехнологией, чрезвычайно широк – от разработки и совершенствования методологии комплексного химикобиологического исследования экосистем вблизи источников техногенных воздействий до разработки технологий и рекомендаций по рекультивации почвы, биологической оценке воды и воздуха и биосинтезу препаратов, компенсирующих вредное влияние изменения окружающей среды на людей и животных. Помимо использования деятельности микроорганизмов в пищевой фармацевтической, химической промышленности и в генной инженерии появилась возможность их применения для переработки отходов жизнедеятельности человека. К 1990 г. было синтезировано более 6 млн. новых веществ. Уникальные по своим свойствам соединения и материалы, а также продукты, образующиеся в процессе их производства или естественные разрушения, в большинстве случаев являются абсолютно чуждыми для живой природы (т.е. ксенобиотики) и поэтому практически не вовлекаются в круговорот веществ и энергии. К наиболее значимым загрязнителям биосферы относятся нефтепродукты, ароматические и гетероциклические соединения, ПАВ, пестициды. Основными «поставщиками» их являются предприятия химической, нефте-лесо-коксохимических, фармацевтических, металлургических, лакокрасочных производств предприятий основного органического синтеза, парфюмерной промышленности, а также производство пластмасс, эпоксидных смол, синтетического каучука. Многие из созданных человеком химических веществ проявляют биологическую активность: обладают мутагенными, канцерогенными, тератогенными свойствами, нарушают структуру клетки. Некоторые ароматические соединения снижают противомикробную резистентность, вызывают образование опухолей и усиливают активность других канцерогенных соединений. Для большинства ксенобиотиков установлены предельно допустимые концентрации в окружающей среде, варьирующие от 0,0001 (анилин) до 5,0 мг/л (бензойная кислота). Однако эти ограничения, во-первых, носят достаточно произвольный характер, а во-вторых не всегда соблюдаются. В результате уровень загрязнения объектов окружающей среды в России остается чрезвычайно высоким и улучшения ситуации с промышленными выбросами вряд ли стоит ожидать. Некоторое 206 снижение интенсивности потока загрязнений, наблюдаемое в последнее время, связано с частичной или полной остановкой предприятий, правда, отнюдь не по экологическим, а по экономическим соображениям. Каковы же реальные экологические перспективы? Биоценозы обладают определенным потенциалом самоочищения. Однако, деструктивная активность экосистем невелика и надеяться на полную регенерацию в условиях постоянного притока токсикантов просто не приходится. Предотвратить экологическую катастрофу можно путем резкого сокращения поступления загрязнителей в окружающую среду с последующей интенсификацией естественных процессов самоочищения. Идеальным решением проблемы было бы воплощение в жизнь концепции безотходного производства, выдвинутой акад. Н.Н. Семеновым, или, по крайней мере, внедрение систем оборотного водопользования. Однако, переход современной индустрии в безотходную полностью замкнутую – процесс достаточно длительный, сложный и дорогостоящий. Существует 2 пути рекультивации (восстановления) природных объектов: за счет активации собственной микрофлоры и с помощью высокоактивных штаммов – деструкторов. Разработано довольно много способов предотвращения попадания токсикантов в биосферу. Одной из важнейших проблем экологической биотехнологии является очистка сточных вод (СВ). Потребность в воде в связи с ростом городов, бурным развитием промышленности, интенсификацией сельского хозяйства огромна. Ежегодный расход воды на земном шаре по всем видам водоснабжения составляет 3300-3500 км3, при этом в сельском хозяйстве - 70% всего водопотребления. Для производств химической, целлюлозно-бумажной, энергетической промышленности, черной и цветной металлургии и бытовых нужд населения требуется также значительное количество воды. Большая часть этой воды после ее использования возвращается в реки и озера в виде СВ. На современном этапе выделяются следующие направления рационального расхода водных ресурсов: более полное использование и расширение воспроизводства ресурсов пресных вод; разработка новых биотехнологических процессов, позволяющих предотвратить загрязнение водоемов. Загрязнение поверхностных и подземных вод можно подразделить на несколько типов: механическое, относящееся в основном к поверхностным видам загрязнений; химическое, обусловленное присутствием в воде 207 органических и неорганических веществ; биологическое, связанное с наличием в воде разнообразных патогенных микроорганизмов, грибов и мелких водорослей; радиоактивное и тепловое. Основные источники загрязнения и засорения водоемов - недостаточно очищенные СВ промышленных и коммунальных предприятий, крупных животноводческих комплексов, отходы производства при разработке рудных ископаемых (воды шахт, рудников); сбросы водного и железнодорожного транспорта; пестициды и т.д. Загрязняющие вещества, попадая в природные водоемы, качественно изменяют их состав. СВ содовых, сульфатных, азотно-туковых заводов, обогатительных фабрик свинцовых, цинковых, никелевых руд, содержащие кислоты, щелочи, ионы тяжелых металлов, меняют физические свойства воды (появление неприятных запахом, привкусов и т.д.) . Нефть и нефтепродукты – основные загрязнители внутренних водоемов, вод и морей Мирового океана – создают разные формы загрязнения: плавающую на воде нефтяную пленку, осевшие на дно водоемов тяжелые фракции. Вода приобретает токсические свойства и представляет собой угрозу для всего живого: 12 г нефти делают непригодной для употребления 1 т воды. Вредным загрязнителем промышленных вод являемся фенол, содержащийся в сточных водах многих нефтехимических предприятий. Вследствие окислительных процессов уменьшается содержание в воле кислорода, ухудшаются ее органические показатели. На жизнь населения водоемов пагубно влияют СВ целлюлознобумажной промышленности. Окисление древесной массы сопровождается поглощением значительного количества кислорода, что приводит к гибели икры, мальков и взрослых рыб. СВ, имеющие повышенную радиоактивность (100 кюри на 1 л и более), подлежат захоронению в подземные бессточные бассейны и специальные резервуары. В значительной степени загрязняют водоемы моющие синтетические средства, широко используемые в быту, промышленности и сельском хозяйстве и парализующие жизнедеятельность бактерий. Пестициды, попадая в водоемы, накапливаются в планктоне, рыбе и по цепочке питания попадают в организм человека, действуя отрицательно как на отдельные органы, так и на организм в целом. СВ, содержащие отходы кожевенной промышленности, сахарных и пивоваренных заводов, предприятий мясомолочной, консервной и кондитерской промышленности, служат причиной органических загрязнений водоемов. Нагретые сточные воды тепловых электростанций вызывают тепловое загрязнение, которое резко изменяет термический режим, отрицательно влияет на флору и фауну водоемов. Возникают благоприятные 208 условия для массового развития в водохранилищах сине-зеленых водорослей (так называемое «цветение воды»). Среди существующих методов очистки СВ различают механические, химические, физико-химические и биологические методы. Применение того или иного метода в каждом конкретном случае определяется характером и степенью вредности примесей. 1. Механические методы. Сущность этих методов состоит в том, что из СВ путем отстаивания, центрифугирования, просеивания и фильтрации удаляют механические примеси. Грубодисперсные частицы в зависимости от размеров улавливаются решетками, ситами, песколовками, нефтеловушками и т.д. Механическая очистка позволяет выделять из бытовых сточных вод до 60-75% нерастворимых примесей, а из промышленных – до 95%, многие из которых как ценные примеси используются в производстве. 2. Химические методы. Хлорирование в настоящее время является самым распространенным среди химических методов способом обеззараживания воды. Реагент сравнительно недорог, активен, обладает широким спектром антимикробного действия, легко дозируется и контролируется. Используется, в основном, сжиженный хлор, сохраняемый в баллонах под давлением. Хлор убивает микроорганизмы и вступает в реакцию с аммиаком. Оставшийся в избытке хлор растворяется в воде, защищая тем самым воду от любого нового источника загрязнения. В последнее время появились многочисленные данные, которые свидетельствуют, что хлорирование питьевой воды и сточных вод приводит к образованию хлорорганических соединений, в т.ч. хлораминов. Хлорорганика вызывает высокие уровни мутагенной активности и токсичности, канцерогенные эффекты. Это усугубляется тем, что образующиеся хлорорганические соединения обладают высокой стойкостью. В связи с вышеизложенным, потребление хлора в Европе, США, Японии сокращается. Воду обрабатывают озонированием, ультрафиолетовым облучением и т.д. Однако, несмотря на многочисленные недостатки хлора и его соединений, отказ от них полностью в ближайшее время невозможен, поскольку ни один метод, кроме серебрения воды, не обладает необходимым последействием. 3. Физико-химические методы используют для удаления тонкодисперсных и растворенных неорганических примесей, а также разрушения органических и плохо окисляемых веществ. В арсенал этих методов входит электролиз, окисление, сорбция, экстракция, ионообменная хроматография, ультразвук, высокое давление, озонирование и др. 4. Биохимическая очистка основана на способности микроорганизмов использовать для питания находящиеся в сточных водах вещества (кислоты, 209 спирты, белки, углеводы и т.д.), являющиеся для них источником энергии. В процессе питания микроорганизмов происходит прирост их массы. В сообщество микроорганизмов (биоценоз) входит множество различных бактерий, простейших и ряд более высокоорганизованных микроорганизмов (микроводорослей, грибов, дрожжей и др.). Основная роль в сообществе принадлежит бактериям, число которых составляет 106-1014 клеток на 1 г сухой биологической массы. Число родов бактерий может достигать 5-10, а видов несколько десятков и даже сотен. Масса микроорганизмов создает так называемый активный ил с концентрацией до 2-5 г/л СВ (в искусственных сооружениях типа аэротенков). Захват примесей микроорганизмами осуществляется различными путями. Основные из них - связывание примесей поверхностью клеток (адсорбция, в данном случае биосорбция), внутриклеточное накопление, внеклеточное осаждение (биокоагуляция) и комплексообразование. Для увеличения емкости биосорбентов на них воздействуют щелочными или органическими растворами, ультразвуком и т.п., причем сорбционная активность мертвых клеток микроорганизмов, как правило, выше, чем живых. Известны два вида процессов с участием микроорганизмов: окислительные (аэробные) в присутствии кислорода, наиболее распространенные в очистке сточных вод; восстановительные (анаэробные) в отсутствие кислорода. Оптимальными для процессов являются: температура 20-300С, рН среды 5-9 (предпочтительнее 6,5.7,5); наличие кроме основных (углерода, азота, кислорода, водорода) других биогенных элементов клетки (марганца, меди, цинка, железа, кальция, натрия, калия и пр.). Биохимическая очистка СВ осуществляется в естественных и искусственных условиях. В первом случае используют почвы, проточные и замкнутые водоемы (реки, озера, лагуны биологические; после орошения пруды), во втором – специально построенные очистные сооружения (биофильтры, аэротенки, метантенки, биосерберы, биоконтакторы). Из специально построенных очистных сооружений рассмотрим аэротенки и биофильтры. Аэротенки – огромные резервуары из железобетона, в которых очистка происходит с помощью активного ила из бактерий и микроскопических животных, которые бурно развиваются в этих сооружениях, чему способствуют органические вещества сточных вод и избыток кислорода, поступающего с потоком подавляемого воздуха. Бактерии, склеивающиеся в хлопья, выделяют в среду ферменты, разрушающие органические загрязнения. Ил с хлопьями оседает, отделяясь от очищенной воды. Инфузории, жгутиковые, амебы, 210 коловратки и другие мельчайшие животные, пожирая бактерии, не слипшиеся в хлопья, омолаживают бактериальную массу ила. Следует отметить, что уже через несколько минут после контакта ила со сточной водой обычно концентрация в ней органических веществ снижается более, чем наполовину. В целом, содержание органического вещества в стоках в результате прохождения через аэротенки сокращается на 90%. Биофильтры – находят широкое применение при очистке как бытовых, так и производственных сточных вод. Биофильтр представляет собой резервуар, который заполняется загрузочным материалом (гравий, керамзит, шлак). Сточная вода подается выше поверхности загрузочного материала, равномерно под ней распределяется через загрузочный материал, на поверхности которого образуется биологическая пленка (биоценоз), аналогичный «активному илу» в аэротенке. При эксплуатации сооружений биологической очистки следует тщательно соблюдать технологический регламент их работы, не допускать перегрузок и особенно залповых поступлений токсических компонентов, значительных отклонений от активной реакции среды, т.к. эти нарушения могут губительно сказаться на жизнедеятельности микроорганизмов и вывести биологические окислители из строя. Обезараживание СВ, прошедших стадию биологической очистки, проводят газообразным хлором или при помощи озона, а также электромагнитного импульса. Сброс СВ в черте населенного пункта допускается в исключительных случаях на основании разрешений, выдаваемых органами по охране ОПС и согласованных с органами государственного санитарного надзора. При очистке СВ применяют и метановое сбраживание, которое осуществляется в реакторах-метантенках в основном двух типов: в реакторах без фиксации биомассы и в реакторах с прикрепленной биомассой. В качестве подложки, к которой прикрепляется биомасса, используют мелкий песок, окись алюминия и другие носители. В последнее время анаэробное метановое брожение применяют и для детоксикации стоков. Анаэробные бактерии помимо деградации углеводов, липидов, белков нуклеиновых кислот способны разрушать и многие отходы нефтехимической промышленности, например, бензойную кислоту 4С6Н5СООН 15СН4 + 13СО2 В настоящее время разработана биотехнология детоксикации стоков производства бензальдегида, предусматривающая использование ассоциации штаммов псевдомонад в проточно аэрируемом биореакторе. Эта система полностью очищала образцы реальных СВ от бензальдегида (250 мг/л), бензилового спирта (200 мг/л), толуола и дихлортолуола (до 100 мг/л). 211 Нитрофенолы – одни из самых опасных загрязнителей биосферы, механизм токсического действия которых основан на нарушении процессов клеточного дыхания. Поступая в окружающую среду, они длительное время сохраняются в природных объектах. Были выделены 13 штаммов бактерий, которые могли утилизировать нитрофенолы в качестве единственных источников углерода и азота. Известен ряд публикаций о применении биореактора с микроорганизмами, иммобилизованными на оригинальном волокнистом носителе «ВИЯ», который очищал СВ производства древесноволокнистых плит от фенола, формальдегида и нефтепродуктов. Для разложения фенола в стоках также применялись дрожжи и грибы. Анилин – чрезвычайно токсическое вещество ПДК = 0,0001 мг/л – входит в состав сточных вод различных производств. Известны способы микробной очистки промышленных стоков от этого токсиканта. СВ производства полиазоцианатов, содержащие анилин, полностью очищались от токсикантов с помощью культур псевдомонад, иммобилизованных на волокнистых носителях. Подводя итог по всем перечисленным методам очистки СВ, можно прийти к заключению, что самый рациональный вариант очистки – это применение на первых этапах физико-химических и химических методов, в результате чего концентрация токсических веществ снизится до физиологических в доступных для селекционированных микроорганизмов концентраций. На втором этапе – подача стоков на локальные очистные сооружения, содержащие ассоциации высокоактивных микробных культур и лишь после этого – сброс слаботоксичных сточных вод на биологические очистные сооружения. Применение биотехнологических процессов для решения проблем окружающей среды Получение экологически чистой энергии. Биогаз Органические отходы (навоз, остатки ботвы, сорняки, опилки и многие другие) могут стать источником дешевой и возобновляемой энергии. Для этого необходимо получить так называемый биогаз. Еще в 1776 г. Вольта обнаружил, что в болотном газе содержится метан. Но только значительно позже была определена роль анаэробных микроорганизмов в этом процессе. С 1901 г. успешно применяют анаэробное сбраживание осадка избыточного ее активного ила, образующегося при работе установок биологической очистки сточных вод. Биогаз – это смесь из 65% метана, 30% углекислого газа, 1% сероводорода и незначительных примесей азота, кислорода, водорода и угарного газа. Энергия, заключенная в 28 м3 биогаза эквивалентна энергии: 21 л 212 нефти, 18,5 л дизельного топлива. Биогаз получают способом, который называется метановым сбраживанием или биометаногенез – сложный микробиологический процесс, в котором органическое вещество разлагается до диоксида углерода и метана в анаэробных условиях. Микробиологическому анаэробному разложению поддаются практически все соединения природного происхождения, а также значительная часть ксенобиотиков органической природы. Этот процесс осуществляется в результате жизнедеятельности двух групп микроорганизмов, которые действуют в два этапа. Вначале в работу включаются кислотообразующие бактерии, расщепляющие сложные органические вещества (белки, жиры и углеводы, содержащиеся в отходах) до более простых. Вследствие их деятельности образуются так называемые первичные продукты брожения – жирные кислоты, спирты, водород, оксид углерода и ряд других веществ, она служит источником питания для другой группы микробов – метанобразующих бактерий, вступающих в работу на второй стадии. Бактерии из этой группы превращают продукты, которые образовались в ходе 1 этапа, в метан, диоксид углерода и небольшое количество других соединений. Для получения биогаза можно использовать отходы сельского хозяйства, испорченные продукты, стоки крахмал-перерабатывающих предприятий, жидкие отходы сахарных заводов, бытовые отходы, сточные воды городов и спиртовых заводов. Процесс ведется при температуре 30-60 °С и рН 6-8. Этот способ получения биогаза широко применяют в Индии, Китае, Японии. Ныне в мире эксплуатируется более 8 млн. установок для получения биогаза, в т.ч. промышленных. Биосорбция тяжелых металлов из стоков. Обычная очистка стоков удаляет из них в основном органические загрязнения. Если же в стоках содержатся тяжелые металлы, такие, как медь, никель, хром, свинец и другие, то требуются дополнительные методы очистки, например биотехнологические. Имеются определенные виды микроорганизмов, которые способны сорбировать металлы, растворенные в жидкости. Концентрация металлов при этом возрастает настолько, что после тепловой обработки биосорбент можно рассматривать как сырье для получения цветных металлов. Биокомпостирование твердых отходов. Аналогом аэробной очистки стоков является аэробное биокомпостирование твердых отходов. Твердые отходы смешиваются с микроорганизмами, разлагающими вредные загрязнения и балластным материалом типа торфа, который обеспечивает доступ кислорода к микроорганизмам. Это позволяет превратить отходы в удобрение или просто 213 использовать их в качестве подсыпки для дорог, в строительстве и в других случаях. Биологическая очистка газовых выбросов. Многие выбросы в атмосферу содержат вредные или дурно пахнущие примеси. Для их очистки применяют биофильтры, заполненные насадкой, на которой закреплены специальные микроорганизмы. Вредные примеси сорбируются на насадке и затем потребляются и обезвреживаются микроорганизмами. Биодеградация нефтяных загрязнений на почве и воде. При аварийных разливах нефти используют биотехнологические способы восстановления загрязненных территорий, которые обрабатывают специально выращенными нефтеокисляющими микроорганизмами, внося различные добавки для их азотистого и фосфорного питания, что позволяет утилизировать углеводороды нефти, превращая их в биомассу микроорганизмов и диоксид углерода. Биодеградация химических пестицидов и инсектицидов. Для борьбы с сорняками и вредителями растений часто используют химические пестициды и инсектициды. Они действуют жестко и в короткое время ликвидируют сорняки и вредителей на обработанном участке. Однако в дальнейшем возникают проблемы: пестициды создают химическую опасность, сохраняясь на растениях или попадая в поверхностные природные воды. Чтобы этого не было, разработаны биопрепараты из специфических микроорганизмов или ферментов, позволяющих ускорить деградацию пестицидов. Обессеривание нефти и каменного угля. Имеются микроорганизмы, способные переводить серу из сульфидов и меркаптанов в элементную серу. На основе использования таких микроорганизмов разрабатывают технологии обессеривания угля и нефти. В результате и топливо электростанций, и моторное топливо автомобилей становится более экологичным – дает меньше выбросов диоксида серы в атмосферу. Обогащение воздуха кислородом. Хотя диоксид углерода – продукт дыхания многих живых существ – считается безвредным, все же в повышенных концентрациях он оказывает неблагоприятное воздействие на животный мир и человека. Работа многих промышленных предприятий, тепловых электростанций приводит к постепенному повышению его концентрации в атмосфере. Следствием этого может стать глобальное потепление на Земле, связанное с так называемым «парниковым эффектом». Это влечет за собой многие весьма неприятные последствия для обитателей Земли. В компактной форме эти проблемы возникают при организации систем жизнеобеспечения на космических кораблях, подводных лодках и вообще в 214 замкнутых пространствах обитания людей. Для поглощения выдыхаемого диоксида углерода и восполнения убыли кислорода на таких объектах предлагалось культивирование микроводорослей (или цианобактерий) хлорелла, которые под действием солнечного света. Биоразлагаемые полимеры. Без большого преувеличения можно сказать, что XX век – это век пластмасс. Вещи из полиэтилена, полипропилена и других пластмасс в буквальном смысле слова окружают нас повсюду. Особенно много пластиковой упаковки, которую после использования чаше всего просто выбрасывают. И здесь ее, в принципе ценное, свойство – устойчивость к разложению влагой, светом, холодом и теплом, почвенными микроорганизмами – играет отрицательную роль. Земной шар буквально переполнен использованной пластмассовой упаковкой. Поэтому в некоторых странах, заботящихся об экологии (США, Германии, Англии), уже действуют ограничения на использование пластмассовой упаковки. Взамен предлагается упаковка на основе полигидроксибутирата или полилактата или специальным образом обработанного крахмала в смеси с целлюлозой, полученные методами биотехнологии. Выброшенные пакеты или флаконы из таких материалов при взаимодействии с почвенными микроорганизмами превращаются в воду, диоксид углерода и биомассу этих самых микроорганизмов, предохраняя планету от отходов. Стиральные порошки с ферментами. Сейчас уже не новость это достижение биотехнологии, хотя появилось оно чуть больше 30 .чет назад. Ферменты для таких порошков (протеазы) производятся биотехнологическими методами. Вермикультивирование. Многие отходы сельскохозяйственного производства и пищевой промышленности могут перерабатываться не только с помощью микроорганизмов (биокомпостирование или метановое брожение), но и с помощью низших организмов – червей. Среди них есть очень эффективные виды – калифорнийские красные черви, которые «перемалывают» землю с разными органическими отходами в прекрасное удобрение. Биотехнология и энергетика Потребности энергии в мире в год составляют цифру порядка 3 1020 Дж. Все запасы нефти, природного газа, угля и урана оценивают как 2,5 1022 Дж. Между тем с солнечной энергией каждый год на поверхность Земли поступает 3 1024 Дж энергии. Таким образом, достаточно было бы, чтобы 0,1% поверхности Земли собирали солнечную энергию и утилизировали ее с коэффициентом полезного действия около 10%. Тогда можно было бы удовлетворить псе потребности в энергии. 215 Однако солнечная энергия поступает неравномерно по времени и по поверхности Земли. Именно растения путем фотосинтеза запасают энергию в форме различных органических веществ, ее можно хранить и перемещать во времени и пространстве. Недостатком является малая эффективность запасания энергии растениями ( 1 - 2 % ), высокое содержание в них влаги и сезонный характер аккумуляции энергии. Наряду с прямым сжиганием древесины, соломы, навоза и других отходов животноводства, биотехнология позволяет получать более удобные для использования виды энергии различными способами. Рассмотрим эти способы. Получение водорода биофотолизом воды. Водород с точки зрения экологии – идеальное топливо, имеющее высокую теплотворную способность (12,8 кДж/м3) и сгорающее без образования каких-либо вредных примесей. Однако получение водорода электролизом или химическим путем неэкономично. Существуют фототрофные бактерии, способные выделять водород под действием света. Некоторые ферменты, наряду с водородом, образуют и кислород, т.е. происходит биофотолиз воды. Примером является система, включающая хлоропласты или хлорофилл и фермент гидрогеназу. Хотя это направление пока еще не дало практических результатов, оно является весьма перспективным в развитии биоэнергетики. Биосинтез углеводородов микроорганизмами. Один из углеводородов — метан мы уже рассматривали при получении биогаза. Более интересно получение жидких и твердых углеводородов с помощью микроводорослей. Например, микроводоросль Botriococcus braunii (имеющая разновидности зеленого и красного цвета) под действием света накапливает до 75% углеводородов от сухой массы клеток. В США есть ферма, где на площади водоемов 52 тыс. га выращивают микроводоросли, дающие около 4800 м 3 жидких углеводородов в сутки. Есть и другие виды микроорганизмов такого же типа. Например, в Израиле показана возможность культивирования микроводорослей Dunaliela bardause в пресных и соленых водах (вплоть до воды Мертвого моря) с получением глицерина в количестве до 85% от сухой массы клеток. Клеточные остатки после выделения глицерина могут быть использованы как корм, содержащий к тому же биологически активный провитамин бета-каротин. Моторное топливо. Важной задачей является получение моторного топлива для автомобилей и других двигателей внутреннего сгорания. Для этих целей идеальным был бы водород как абсолютно экологически чистое топливо. Однако на современном уровне развития техники он и дорог, и небезопасен в обращении. 216 Альтернативой жидким углеводородам может стать, например, этанол. Если не ставить целью получать «кристально чистый» спирт, то оказывается, что технический спирт вполне может служить заменой жидким углеводородам — либо безводный спирт (почти 100%-й), либо в смеси с бензином, где спирт составляет около 10% (такая смесь называется газохол). При этом важно обеспечить экономичное производство спирта. В Бразилии для этой цели используют сахарный тростник, в США крахмалосодержашие продукты, в основном кукурузу и маниок. В России разрабатывается технология биоконверсии в этанол древесины. 217