Физиология микроорганизмов

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Слайд 1. Химический состав бактерий Изучение химического состава микробов дает важные сведения для познания механизмов их жизнедеятельности и процессов обмена веществ. Несмотря на внешнюю простоту строения, химизм микробов представляется весьма сложным. Биохимические процессы, а, следовательно, и химический состав у различных бактерий неодинаковы. Даже у одного и того же вида характер обмена веществ и состав клетки будут меняться в зависимости от ее физиологического состояния и условий существования. Неорганические вещества. В клетках живых организмов встречается около 90 различных химических элементов, причем примерно 25 из них обнаружено практически во всех клетках, а общее содержание минеральных веществ в бактериях, выращенных на обычных питательных средах, колеблется от 2% до 14% от веса сухой клетки. По содержанию в живых системах все химические элементы подразделяются на три большие группы: макроэлементы, микроэлементы и ультрамикроэлементы. На долю макроэлементов в сумме приходится около 99%, на долю микроэлементов – менее 1%, а ультрамикроэлементов – менее 0,01% массы клеток. Обычно среди макроэлементов выделяют две большие группы. В первую группу входят кислород (65–75%), углерод (15–18%), водород (8– 10%) и азот (1,5–3%), в сумме составляющие около 98% от массы клеток. Их часто называют органогенными элементами. Эти четыре элемента входят в состав органических соединений; кроме того, из водорода и кислорода состоит вода, на долю которой приходится не менее 2/3 содержимого большинства клеток. Вторую группу макроэлементов представляют фосфор (0,2–1%), калий (0,15–0 4%), сера (0,15–0,2%), хлор (0,05–0,1%), кальций (0,04–2%), магний (0,02–0,03%), натрий (0,02–0,03%), железо (0,01–0,015%), в сумме составляющие около 1,9%. Функции макроэлементов многообразны: они входят в состав нуклеиновых кислот и ферментов (фосфор), влияют на осмотическое давление клетки (натрий), принимают участие в процессах дыхания (сера, железо), входят в состав некоторых аминокислот, витаминов (сера), являются катализаторами процесса синтеза (магний). К микроэлементам относятся марганец, медь, цинк, кобальт, никель, йод, фтор. Из ультрамикроэлементов можно назвать серебро, золото, бром, молибден, бор, мышьяк, селен и др. Следует, однако, помнить, что в 2 больших количествах многие микроэлементы и ультрамикроэлементы токсичны для организмов. Особое место среди неорганических соединений живых клеток занимает вода. Содержание воды в цитоплазме большинства видов бактерий колеблется от 75% (E.coli) до 85% (холерный вибрион). Наибольшая концентрация воды свойственна капсульным бактериям, наименьшее количество воды содержат споры (40-50%). По количеству вода является главной составной частью клетки; она находится в свободном состоянии или связана с другими составными частями клетки. Связанная вода – структурный элемент цитоплазмы и не может быть растворителем. Свободная вода служит дисперсной средой для коллоидов и растворителем для кристаллических веществ, источником водородных и гидроксильных ионов и участником химических реакций. Слайд 2. Органические вещества. Органическими называют сложные углеродсодержащие вещества, количество которых в живых клетках во много раз превосходит количество неорганических соединений. Если в начале XIX в. было известно около 80 органических веществ природного происхождения, то к началу XX в. их число составило уже 100000, а сейчас число органических соединений, выделенных из природного сырья или полученных синтетически, превышает несколько миллионов и постоянно увеличивается. Большинство органических веществ образовано небольшим количеством элементов. Практически во все эти вещества, помимо углерода, входит водород, многие из них содержат кислород и азот. В клетках живых организмов находятся низкомолекулярные органические вещества (аминокислоты, сахара, органические кислоты, нуклеотиды, липиды и т.д.) и высокомолекулярные, или биополимеры. Полимерами называют молекулы, состоящие из большого количества повторяющихся единиц – мономеров, соединенных друг с другом ковалентными связями и образующих длинную неразветвленную или разветвленную цепь. Полимер называют гомополимером, если входящие в его состав мономеры одинаковы (например, полисахариды – крахмал, гликоген, состоящие из молекул глюкозы), или гетерополимером, если он построен из нескольких различающихся мономеров (белки, построенные из 20 аминокислот, нуклеиновые кислоты, состоящие из 4 типов нуклеотидов). Белки. Белки – высокомолекулярные органические соединения, неразветвленные гетерополимеры, состоящие из остатков α-Lаминокислот, соединенных пептидной связью (-CO-NH-). В живых организмах встречается около 100 аминокислот. В бактериальной клетке присутствуют простые белки – протеины, состоящие только из 3 аминокислот, и сложные – протеиды, в состав которых входят, кроме аминокислот, углеводы (гликопротеиды), липиды (липопротеиды), нуклеотиды или нуклеиновые кислоты (нуклеопротеиды), а также металлопротеиды, фосфопротеиды и т.д. Общее количество белка в бактериях составляет 50-75% сухого вещества. Важнейшие биологические свойства микробов определяются качествами синтезируемых клеткой белков. Аминокислотный состав у различных видов бактерий отличается как в качественном, так и в количественном отношении, характеризуясь значительной стабильностью у одного и того же вида. У микробов обнаружена уникальная аминокислота – диаминопимелиновая, которая присутствует в белках и полипептидах цитоплазмы, из нее состоит клеточная стенка бактерий. Белки выполняют самые разнообразные функции: структурную, транспортную, регуляторную, питательную. Двигательную функцию выполняют белки жгутиков. Расщепление белков и утилизация аминокислот в процессе обмена сопровождаются освобождением энергии – энергетическая функция. Однако наиболее важной следует признать каталитическую функцию белков-ферментов, которые принимают участие во всех химических реакциях живых организмов. Нуклеиновые кислоты. Бактерии содержат рибонуклеиновую кислоту (РНК) в среднем 10% от сухого веса, и дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) – 3-4%. РНК состоит из углевода рибозы, фосфорной кислоты и четырех азотистых оснований: аденина, гуанина, цитозина и урацила. В ДНК вместо урацила содержится тимин, а вместо рибозы – дезоксирибоза. Нуклеиновые кислоты бактерий и других микробов выполняют важнейшие биологические функции: ДНК является материальной основой наследственности, в ней закодирована вся наследственная информация микроба. РНК участвует в синтезе белков. Углеводы. Углеводами (сахарами, сахаридами) называют органические соединения с общей формулой (СН2О)n. Общее количество углеводов, входящее в состав микробной клетки, колеблется от 12 до 28%. Основная масса углеводов представляет собой сложные соединения – полисахариды, распадающиеся при гидролизе на простые сахара (целлюлоза, крахмал). Среди моносахаридов наибольшее значение имеют пентозы: рибоза и дезоксирибоза, гексозы: глюкоза, галактоза, а также дисахариды: фруктоза и лактоза. В микроорганизмах встречаются полисахариды, содержащие от 1 до 5% азота, чаще всего находящегося в виде аминопроизводных глюкозы и галактозы. 4 Липиды. Липиды микроорганизмов (жиры и жироподобные вещества) имеют разное строение и выполняющие разнообразные функции. Они входят в состав оболочки клетки, играют роль запасных питательных веществ, обуславливают токсические и антигенные свойства патогенных бактерий. Липиды найдены у всех бактерий, их количество у разных видов колеблется от 0,2 до 41%. В состав бактериальной клетки входят следующие липиды: Простые липиды - нейтральные жиры – сложные эфиры высших жирных кислот с глицерином. Липиды большинства бактерий содержат те же жирные кислоты, которые присутствуют в клетках растений и животных, а именно пальмитиновую, стеариновую, олеиновую и другие. Сложные липиды – фосфолипиды, составляющие основу биологических мембран, - эфиры глицерина и жирных кислот, связанные с остатком фосфорной кислоты. Соединяясь с белком, они образуют липопротеиды, входящие в состав клеточной оболочки и обуславливают ее проницаемость и поверхностный электрический заряд. Гликолипиды сильнополярные соединения за счет наличия в молекуле гидрофильных углеводных групп (остатков глюкозы, маннозы, галактозы и др). Слайд 3. Питание микробов Химические ингредиенты бактериальной клетки могут изменяться в зависимости от состава и качества питательной среды, возраста культуры и условий культивирования микроба. Микроорганизм может нормально функционировать лишь в том случае, если среда, в которой он находиться, содержит необходимые факторы, обеспечивающие его энгретические и синтетические потребности. Из питательного субстрата микроб берёт все необходимые элементы и в него возвращает отработанные продукты обмена. Питание микроорганизмов имеет свои особенности. Микроорганизмы не имеют специальных органов пищеварения, и поступление питательных веществ происходит через всю оболочку. Следовательно, эти вещества должны быть растворены в окружающей микроорганизм среде. Отношение поверхности к объему у микроорганизмов очень велико. Это способствует быстрому поглощению питательных веществ из окружающей среды. Имеют значение величина молекул питательных веществ, их заряд, рН среды, химическая природа вещества и др. Некоторые вещества (белки, жиры, полисахариды) предварительно расщепляются с помощью экзоферментов на более простые соединения, которые и диффундируют внутрь клетки. Таким образом, процесс пищеварения у бактерий осуществляется в известной степени вне клетки. Макро- и микроэлементы поглощаются в виде анионов 5 и катионов. Обычно вода движется в сторону большей, а соли – в сторону меньшей концентрации. Слайд 3. Поступление веществ в бактериальную клетку может происходить несколькими путями: 1) пассивной диффузией, которая обеспечивается проникновением веществ по градиенту их концентрации и происходит до тех пор, пока не наступит равновесие между содержанием вещества вне и внутри клетки. Этот процесс идёт с малой скоростью и не требует затрат энергии. Все незаряженные молекулы (вода, газы) поступают в клетку путём обычной (пассивной) диффузии; 2) облегчённой диффузией - перенос с помощью специальных мембранных белков – пермеаз, которые связываются с субстратом, «протаскивают» его через мембрану в неизменном виде и высвобождают на внутренней её стороне. Процесс не требует затрат энергии, т.к. не идёт против градиента концентрации. Однако скорость транспорта значительно увеличивается. 3) активным транспортом – направленным перемещением вещества против концентрационного градиента. Этот процесс катализируется пермеазами и является строго энергозависимыми. 4) транслокацией, при которой перенос химических групп сопровождается модификацией субстрата (например, фосфорилирование глюкозы). Слайд 4. Питательные потребности различных микробов неодинаковы. Бактерии характеризуются необычным разнообразием типов питания, который определяется на основании усвоения двух главных органогенов – углерода и азота, тогда как источником водорода и кислорода служит вода. По источнику углеродного питания выделяют: - автотрофы (лат. autos – сам, trophe – пища, т.е. сами себя питающие), получающие углерод из неорганических соединений (карбонатов) и углекислоты воздуха. Такими микроорганизмами являются нитрифицирующие бактерии, железобактерии, серобактерии и др. - гетеротрофы (лат. heteros – другой, т.е. питающийся за счёт других), в качестве источника углерода использующие органические соединения (аминокислоты, углеводы, многоатомные спирты и др.). Большинство гетеротрофных микроорганизмов живёт за счёт использования органических субстратов животного и растительного происхождения, они играют важную роль в уничтожении мёртвых органических остатков. Такие бактерии называют сапрофитами (греч. sapros – гнилой, phyton – растение). Они безвредны для человека. 6 Некоторые гетеротрофы живут на поверхности или внутри другого организма и питаются за счёт последнего. Их называют паразитами (греч. parasites – нахлебник). К паразитам относятся возбудители заболеваний человека, животных и растений. Наибольшая степень гетеротрофности присуща облигатным (обязательным) внутриклеточным паразитам. К ним относятся риккетсии, хламидии, вирусы. Паразиты составляют сравнительно небольшое количество видов микробов (0,1%), приспособившихся в ходе эволюции к этому образу жизни. Отдельные виды патогенных для человека бактерий могут существовать во внешней среде как сапрофиты и, наоборот, некоторые сапрофиты при неблагоприятных условиях могут вызывать у людей и животных заболевания. В зависимости от источника азота микроорганизмы подразделяют на аминоавтотрофы, которые способны синтезировать аминокислоты из неорганических соединений, и аминогетеротрофы, требующие получение аминокислот извне в готовом виде. К первой групп относятся азотфиксирующие почвенные и клубеньковые бактерии, способные усваивать свободный азот атмосферы. К аминогетеротрофам споотносятся все паразитарные виды и большинство сапрофитных. Они получают азот, расщепляя белки, аминокислоты, мочевину, пурины, пиримидины и другие соединения с выделением аммиака, который становится доступным для процессов биосинтеза. В зависимости от источника энергии, необходимой для осуществления биосинтеза, микробы делятся на две группы: хемосинтетические и фотосинтетические. Хемосинтетические микроорганизмы получают энергию в результате окисления неорганических субстанций (серы, аммония, нитрита). Фотосинтетические пурпурные, зеленые, серные бактерии используют лучистую энергию. Фотосинтез бактерий отличается от аналогичного процесса в растениях тем, что при этом не образуется молекулярный кислород. Кроме того, источником водорода у бактерий является не вода (как у растений), а H2S, H2, спирты, жирные кислоты и другие соединения. Слайд 5. Источники питания Источник питания – вещество, поставляющее необходимые для жизнедеятельности элементы. Источниками водорода могут быть H2S, NH3, H2 или органические соединения: глюкоза, молочная кислота, аминокислоты, углеводы, спирты, белки, жирные кислоты. 7 Источниками углерода являются СО2 и различные соединения углерода – наиболее легко усваиваются гексозы, многоатомные спирты, карбоновые кислоты. Источниками азота, необходимого для синтеза белков, нуклеиновых кислот, могут служить разнообразные органические и не органические соединения, содержащие азот(N2, NH3, NH4+, NO3, NO2-, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, амины). К источникам питания относят также неорганические элементы: фосфор, серу, калий, кальций, железо и микроэлементы: молибден, бор, фтор и др. Факторы роста микробов Для питания, роста и размножения некоторых микроорганизмов необходимы особые вещества, называемые «факторами роста». Если бактерии не могут эти вещества синтезировать, они должны их получать из среды в готовом виде. Отсутствие или дефицит фактора роста в среде приостанавливает рост или размножение микроорганизмов. Микроорганизмы, которые потеряли способность самостоятельно синтезировать необходимые органические соединения и нуждаются в факторах роста, называют ауксотрофами. Они часто возникают в результате мутаций. Микроорганизмы, удовлетворяющие свои потребности т за счёт основного источника питания и не нуждающиеся в факторах роста называются прототрофами. Факторы роста микробов, называемые также стимуляторами, являются соединениями, различными по своей химической природе. К ним относятся витамины (витамин В2 - рибофлавин, витамин В12, никотиновая, пантотеновая, фолиевая кислоты), некоторые аминокислоты (пролин), азотистые основания (урацил, аденин). В нуждаются молочнокислые бактерии и клостридии. Факторы роста могут быть ограничивающими и запрещающими. Ограничивающие – такие, в отсутствии которых микроорганизмы могут размножаться ограниченно. Запрещающие – вещества, в отсутствии которых размножение данного микроорганизма вообще не происходит. Слайд 6. Метаболизм микроорганизмов Совокупность всех химических превращений, происходящих в клетке, называется метаболизмом. Он включает в себя два взаимосвязанных процесса: анаболизм (или ассимиляция) и катаболизм (или диссимиляция). При анаболизме с помощью ферментов осуществляется процесс синтеза составных частей бактериальной клетки из различных органических и не органических соединений. Например, из аминокислот осуществляется синтез белка, из СО2 и других соединений углерода синтезируются углеводы. Для процессов синтеза при образовании сложных молекул 8 необходимы затраты энергии. В биосинтезе большое значение имеют процессы полимеризации и конденсации, т.е. образование крупных молекул из более простых соединений, например формирование клетчатки из молекул глюкозы. При катаболизме под влиянием ферментов происходит процесс расщепления или превращения сложных органических соединений до более простых. Белки могут распадаться до пептидов, аминокислот, аммиака и углекислоты, сложные углеводы – ди- и моносахаридов, сложные липиды – до образования жирных кислот. Процесс катаболизма сопровождается выделением энергии. Ферменты бактерий Все разнообразные и многочисленные процессы в клетке микроорганизмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов), которые являются биологическими катализаторами. Ферменты увеличивают скорость химических реакций в миллионы раз. Это вещества белковой природы с большой молекулярной массой. Некоторые из них относятся к протеинам, другие являются сложными белками (протеидами). Они построены из двух частей: белковой (апофермент) и небелковой (простетической группой, или кофермент). В состав кофермента могут входить витамины, атомы железа, нуклеотиды. Как катализаторы они обладают рядом уникальных свойств. Это, прежде всего, их необычайно высокая каталитическая активность: добавка незначительного количества фермента (10-7 - 10-9 моль) может ускорить катализируемую реакцию более чем 1010 раз. Другое важное свойство - избирательность действия. В ряде случаев ферменты обладают абсолютной специфичностью, катализируя превращение только одного вещества. Ферменты разделяют на шесть групп: 1. Оксидоредуктазы, катализирующие окислительновосстановительные реакции; 2. Трансферазы, катализирующие перенос амино-, фосфо- или метильных групп с одного соединения на другое; 3. Гидролазы, расщепляющие путем гидролиза различные соединения; 4. Лиазы, отщепляющие от субстратов негидролитическим путем различные группы (CO2, H2O, SH2); 5. Изомеразы, катализирующие внутримолекулярные перестройки в субстрате; 6. Лигазы (синтетаты), осуществляющие присоединение друг к другу молекул (образующие C-O, C-N, C-S – связи) 9 Наиболее высокой ферментальной активностью обладают сапрофиты, в меньшей степени это свойство выражено у патогенных бактерий. На основании определения ферментальной активности можно дифференцировать различные виды. У микроорганизмов различают экзоферменты, которые выделяются во внешнюю среду и играют важную роль в подготовке питательных веществ и их поступлении в клетку, повреждают ткани хозяев, выполняют защитную функцию. Например, гидролазы обеспечивают гидролиз полисахаридов, белков, липидов, а фермент пенициллиназа инактивирует антибиотик пенициллин, защищая бактерии от гибели. Эндоферменты прочно связаны с микробной клеткой, они катализируют внутриклеточные процессы обмена веществ. Кроме того различают конституционные ферменты, которые постоянно находятся в клетке независимо от условий ее существования. К ним относятся основные ферменты клеточного обмена (липазы, протеиназы, корбогидразы, и т.д.). Индуктивные (адаптивные) ферменты синтезируются только в присутствии соответствующего субстрата (щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пенециллиназа). Индуктивные ферменты у бактерий являются преобладающими, т.к. именно они играют основную роль в процессах адаптации к меняющимся условиям окружающей среды. Слайд 7. Дыхание микроорганизмов Для синтеза построения микробной клетки и для процессов жизнедеятельности, кроме питательных веществ, требуется энергия. Эта потребность микробов удовлетворяется за счет дыхания, точнее биологического окисления. Окисление веществ может происходить разными путями: - прямым, когда к веществу при помощи ферментов оксидаз присоединяется кислород. В этом случае происходит непосредственное окисление атмосферным кислородом неорганического субстрата – молекулярного водорода, окиси углерода или серы. Прямое окисление регистрируется у многих сапрофитов; - непрямым – отнятием от субстрата двух атомов водорода или двух электронов, т.е. в процессе дегидрирования. Отнятый от окисляемого субстрата-донора водород переносится на другое вещество, акцептор, которое при этом восстанавливается. Таким образом, биологическое окисление – это реакции окислительно-восстановительного порядка. Процесс переноса водорода и электронов сопровождается высвобождением энергии, которая утилизируется клеткой и аккумулируется преимущественно в виде аденозинтрифорсфорной кислоты (АТФ). 10 Ферменты, отщепляющие от субстрата атомы водорода, называются дегидрогеназами. Одни микроорганизмы, так же как и животные и высшие растения, для дыхания и получения энергии нуждаются в свободном доступе кислорода. Эти микроорганизмы называются аэробами, а процесс дыхания – аэробным. Некоторые аэробы (возбудитель туберкулеза, менингита) не могут жить и размножаться без молекулярного не менее 20% кислорода, они называются облигатными аэробами. Некоторые бактерии хорошо развиваются при широком доступе кислорода (холерный вибрион, возбудитель туберкулеза), ихназывают аэрофилы. Другие аэробы нуждаются в значительно меньшем количестве кислорода (например, возбудитель бруцеллеза) и называются микроаэрофилами. Микроорганизмы, получающие энергию без доступа кислорода путем расщепления питательных веществ, называются анаэробами. Существуют облигатные анаэробы – микробы, не переносящие доступа воздуха, содержащего кислород (возбудители ботулизма, столбняка, газовой гангрены) и факультативные анаэробы, способные извлекать энергию из субстратов аэробным и анаэробным путями биологического окисления (большинство сапрофитных и патогенных микробов). Однако границы между этими микроорганизмами не являются абсолютными. Но независимо от того, к какому типу относятся те или иные микроорганизмы, сущность энергетического метаболизма одна – получение энергии, образующейся в процессе биологического окисления (дегидрирования) как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Поэтому понятие «биологическое окисление» более точно и правильно отражает процесс дыхания у микробов. Дыхание с участием кислорода – частный случай биологического окисления. При аэробном дегидрировании акцептором водорода является кислород, конечными продуктами - вода, углекислота, происходит освобождение всей энергии, заключенной в субстрате. При анаэробном расщеплении микробы используют другие конечные акцепторы водорода, например азот, серу или углерод с образованием NH3, H2S, CH4. В анаэробных условиях происходит неполное окисление субстрата и значительная часть энергии сохраняется в конечном продукте. Факультативные анаэробы имеют два набора ферментных систем, поэтому они могут расти в аэробных условиях. Облигатные аэробы обладают ферментами, обеспечивающими использование свободного кислорода в качестве конечного акцептора водорода. 11 При дыхании окислительные процессы сопровождаются освобождением большого количества энергии. Так, например, при окислении 1 грамм-моля глюкозы освобождается 688,5 ккал. C6H12O6 + 6O2 = 6CO2 + 6H2O + 688,5 ккал При анаэробном дегидрировании органических веществ также происходит выделение энергии, но в значительно меньшем количестве. Так, при сбраживании 1 грамм-моля глюкозы до этилового спирта в анаэробных условиях образуется 31,2 ккал энергии. C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2 + 31,2 ккал Из этого следует, что аэробный тип окисления в энергетическом отношении выгодно отличается от анаэробного. Тем не менее, анаэробы широко распространены в природе и производят огромную работу. Они преимущественно сбраживают безазотистые органические соединения с образованием разнообразных продуктов – молочной, масляной, уксусной, пропионовой кислот, этилового, бутилового спиртов, ацетона и т.д. Продукты жизнедеятельности микробов В процессе жизнедеятельности микроорганизмы образуют различные вещества. Некоторые из них являются необходимыми для роста и размножения – это первичные метаболиты. К ним относятся низкомолекулярные соединения (с молекулярной массой менее 1500 дальтон), например, аминокислоты, органические кислоты, моносахара, нуклеотиды и др. Первичные метаболиты являются строительными блоками макромолекул, участвуют в синтезе ферментов и других важнейших для клетки сложных органических соединений. Они синтезируются микроорганизмами в экспоненциальной фазе роста популяции. Наряду с реакциями первичного обмена, существуют значительное число метаболических путей, приводящих к образованию соединений, свойственных лишь определенным, иногда очень немногим, группам микроорганизмов. Эти реакции объединяются термином вторичный метаболизм, а их продукты называются вторичными метаболитами. Они относятся к разнообразным классам органических веществ – пептидам, эпоксидам, терпеноидам, кумаринам, изопреноидам, гиббереллинам и т.д. Активный синтез вторичных метаболитов осуществляется в конце экспоненциальной - начале стационарной фазы роста микробной популяции. К наиболее известным вторичным метаболитам можно отнести антибиотики – вещества биологического происхождения, способные даже в низких концентрациях подавлять рост микроорганизмов. Продукция 12 антибиотиков выработалась в процессе эволюции у некоторых групп микроорганизмов (бактерий, микроскопических грибов, актиномицет) в борьбе за существование вида. Толчком к выяснению материальной основы антогонистических взаимоотношений в микробных популяциях послужило наблюдение Флеминга, обнаружившего в 1928 г., что колония грибов рода Penicillium подавляла рост стафилококков. Выделяемое этим грибом вещество, которое проникло в питательный агар посредством диффузии, получило название пенициллина. С тех пор было выделено множество веществ с антибиотической активностью. Различают вещества, подавляющие рост микробов (бактериостатические) и убивающие их (бактерицидные). Антибиотики широко используются в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и научных исследованиях. Некоторые микроорганизмы продуцируют вещества, относящиеся к витаминам. Например, рибофлавин (витамин В2) синтезируют актиномицеты, плесневые грибы и клостридии, витамин В12 метаногенные, пропионовые бактерии и псевдомонады, а дрожжи являются продуцентами предшественников витаминов группы Д (эргостерина и холестерина). Многие микробы вырабатывают различные пигменты. Одни из них прочно связаны с клеткой, другие поступают во внешнюю среду. Цвет пигментов довольно разнообразен: красный, розовый, зеленый, желтый, золотистый, фиолетовый и т.д. Образование пигментов происходит только в определенных условиях питательной среды, рН, температуры, при свободном доступе кислорода или на свету. Пигменты играют важную роль в жизнедеятельности микробов, они являются акцепторами водорода, участвуют в реакциях синтеза, предохраняют микробов от губительного действия ультрафиолета. Некоторые микроорганизмы вырабатывают летучие ароматические вещества, например, уксусно-этиловый и уксусно-амиловый эфиры, которые придают ароматические свойства вину, пиву, молочнокислым продуктам, сену, почве и так далее. Некоторые микроорганизмы обладают способностью к свечению. Эта энергия освобождается у них при окислительных процессах. Свечение чешуи, рыб, грибов, гниющих деревьев обусловливаются особой группой микробов, называемых фотобактериями. Особое значение имеют ядовитые продукты (токсины), вырабатываемые микробами, которые вызывают отравление макроорганизмов. Рост и размножение микробов 13 Живые организмы отличаются от неживой природы главным образом тем, что растут и размножаются. Различают рост клеток и рост популяции. Рост клеток – это процесс увеличения размеров, объёма, массы каждой отдельной особи. Рост начинается после деления клетки, которая быстро достигает стадии зрелости, а затем приступает к размножению или переходит в стадию покоя. Рост популяции – увеличение количества живого вещества (биомассы), обусловленное увеличением массы и количества клеток в единице объёма питательной среды. Под размножением микроорганизмов понимают процесс самовоспроизведения, обеспечивающий сохранение вида. Способы размножения у микробов разнообразны: почкование, спорообразование, половой процесс, но у большинства бактерий – бинарное деление, т.е. бесполое деление с образованием двух дочерних клеток. Рост зависит, прежде всего, от температуры и рН среды, доступности питательных веществ и концентрации ионов. Рост бактериальной клетки не безграничен. Достигнув определенной величины, она перестает расти и переходит к бесполому размножению. Наиболее часто у бактерий происходит равновеликое бинарное деление, т. е. образование двух одинаковых по размеру дочерних клеток, имеющих генетическую информацию материнской особи. У большинства грамположительных бактерий деление происходит путем синтеза поперечной перегородки, идущей от периферии к центру. Клетки большинства грамотрицательных бактерий делятся путем перетяжки (от центра к периферии). У самых быстрорастущих бактерий деление происходит через каждые 20 минут (кишечная палочка, холерный вибрион). Клетки, возникающие из материнской, представляют уже новое поколение (новую генерацию). Процесс деления повторяется через приблизительно равные промежутки времени (от нескольких минут до нескольких суток), что является индивидуальной генетической характеристикой микробного вида. Интервал между делениями называется временем генерации. При времени генерации 20 минут из одной бактериальной клетки через 36 часов можно при благоприятных условиях получить микробную массу около 400 тонн, а через 48 часов ее потомство весило бы 2,2·1031 г, что приблизительно в 4 тысячи раз больше веса Земли. Однако, как в естественных, так и в искусственных условиях размножение бактерий ограничено действием ряда факторов. Сущесвует и другой тип бинарного деления – неравновеликое, или почкование, характерное для дрожжей и дрожжеподобных грибов. При почковании материнская клетка дает начало дочерней клетке: на одном из полюсов материнской клетки образуется маленький вырост (почка), 14 увеличивающийся в процессе роста. Постепенно почка достигает размеров материнской клетки, после чего отделяется. При благоприятных условиях этот процесс длится около двух часов. Почкующиеся клетки обычно образуют не одну, а несколько почек. Для нитевидных форм микроорганизмов (актиномицет, микоплазм) характерно размножение фрагментацией. При этом происходит разделение особи на две или несколько частей, каждая из которых растет и образует новую особь. Размножение путём спорообразования присуще плесневым грибам, дрожжам и стрептомицетам. Образование спор у дрожжей может происходить бесполым и половым путями. При бесполом образовании спор ядро клетки делится на столько частей. Каждое новое ядро окружается цитоплазмой и покрывается оболочкой. Образованию спор половым путем предшествует слияние (копуляция) клеток. Споры дрожжей несколько более устойчивы к вредным воздействиям, чем вегетативные дрожжевые клетки, но менее стойки по сравнению с бактериальными спорами. Размножение бактерий происходит по определенным закономерностям. Ещё в 1942 году ученый из Пастеровского института Жак Моно графически изобразил размножение бактерий при помощи «кривой роста», показывающей изменение численности микробов за определенное время. Динамика развития популяции бактерий представлена на рисунке. lg C IV V VI III II I Время Кривая роста микроорганизмов при периодическом культивировании: I – лаг-фаза; II – фаза ускорения роста; III – фаза экспоненциального роста; IV – фаза замедления роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания культуры При посеве бактерий на свежую питательную среду они приспосабливаются к новым условиям и первое время не размножаются; этот период называют лаг-фазой (I) (lag – запаздывание). Длительность 15 этого периода составляет в среднем 4-6 ч и определяется следующими условиями:  возрастом культуры (у молодых культур короче);  биологическими особенностями микробов;  полноценностью питательной среды;  температурой, рН, аэрацией и т.п. На протяжении лаг-фазы и фазы ускорения роста (II) происходит выработка соответствующих ферментов и значительное увеличение количества РНК. Затем следует фаза быстрого размножения (III) с логарифмической зависимостью числа клеток от времени выращивания, что выражается экспоненциальной кривой. В связи с этим описанная часть кривой роста называется логарифмической фазой, или лог-фазой (экспоненциальной фазой). В этой фазе клетки делятся с максимальной постоянной скоростью, обладают наибольшей биохимической и биологической активностью. Скорость размножения клеток во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от используемой питательной среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин, у многих почвенных видов она достигает 60-150 мин, а у микроорганизмов рода Nitrobacter – даже 5-10 ч. В течение экспоненциальной фазы прирост биомассы в единицу времени пропорционален концентрации клеток (С) dC ── = µC dt Коэффициент пропорциональности µ соответствует удельной скорости роста. Это уравнение, записанное в интегральной форме, раскрывает смысл обозначения «экспоненциальная фаза роста»: ln C – ln C0= µ(t – t0). Разность между логарифмами концентрации клеток (С и С0) в два различных момента времени (t и t0) пропорциональна прошедшему интервалу времени. В экспоненциальной фазе синтезируются биотехнологически ценные продукты (ферменты, витамины, нуклеотиды) – это так называемые первичные метаболиты бактериальной клетки. На лог-фазу бактерий, подобно предыдущим, оказывают влияние ряд факторов: вид бактерий, характер питательной среды, условия выращивания (температура, рН, аэрация). Постепенно, однако, питательные вещества из раствора исчезают, а среда обогащается продуктами выделения бактерий, тормозящими процесс размножения (IV – фаза замедления роста), после чего бактерии вступают в стационарную фазу (V), в которой 16 наступает равновесие между количеством клеток, находящихся в состоянии покоя, погибающих, и активных, вновь образующихся. В конце логарифмической и начале стационарной фазы роста синтезируются так называемые вторичные метаболиты бактериальной клетки – антибиотики, токсины, пигменты и т.д. Клетки в стационарной фазе роста меньше по размеру (чем в лог-фазе), они более устойчивы к физическим воздействиям (нагревание, охлаждение, облучение) и химическим агентам. Количество жизнеспособных бактерий, находящихся в популяции в стационарной фазе, обозначают как максимальную концентрацию и выражают символом М-концентрация. Эта величина – максимальная концентрация жизнеспособных клеток в единице объема питательной среды. М-концентрация для питательных сред одного и того же состава стабильна. Если в питательную среду поместить микробы в количестве, равном М-концентрации для данного вида, то развитие бактерий не наблюдается. Если же количество засеянных в среду бактерий превышает М-концентрацию, то наблюдается гибель клеток до тех пор, пока их количество не достигнет величины, равной М-концентрации. Таким образом, М-концентрацию следует расценивать как показатель, характерный для данного вида бактерий в определенных условиях их существования, изменение которых приводит к изменению величины Мконцентрации. Следующая фаза – фаза отмирания (гибели) (VI). Клетки перестают делиться, гибнут и распадаются. Количество живых клеток резко уменьшается. Их гибель является результатом действия ряда факторов, одним из которых, имеющим важное значение, является исчерпание запасов энергии в клетке. Скорость отмирания бактерий широко варьирует в зависимости от условий и особенностей организма. Оставшиеся живые микробы находятся в состоянии покоя. Основные принципы выращивания микробов Выращивание (культивирование) микроорганизмов необходимо для получения биомассы или различных метаболитов (продуктов обмена веществ) микробной клетки. Выращивание микробов в лабораторных условиях производят на искусственных питательных средах, в культурах тканей и в организме экспериментальных животных. Культуральные признаки микроорганизмов определяют по характеру роста на питательных средах. Эти признаки имеют важное диагностическое значение и являются постоянными для каждого вида микроорганизмов. На плотных питательных средах микробы образуют различные по форме и величине колонии, которые представляют собой видимые 17 скопления особей одного вида микроорганизмов, образующиеся в результате размножения из одной или нескольких клеток. Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавленными, поверхность их – гладкой (S-формы), шероховатой (R-формы), исчерченной, бугристой, края – ровными, зазубренными, волокнистыми, бахромчатыми. Форма колоний разнообразна: круглая, розеткообразная, звездчатая, древовидная. По величине колонии бывают крупные (4-5 мм в диаметре), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (менее 1 мм). Колонии отличаются по консистенции, плотности, цвету. Они бывают прозрачными и не прозрачными, окрашенными и бесцветными, влажными, сухими и слизистыми. В жидких питательных средах микробы растут с образованием диффузной мути, пленки, осадка, видимых невооруженным глазом. Иногда наблюдается пристеночный рост бактерий. В лабораторных условиях бактерии выращивают в пробирках, чашках Петри, во флаконах, бактериологических матрицах. В производственных условиях выращивания (культивирования) микроорганизмов осуществляют по специально разработанной технологии. При оценке эффективности роста обычно измеряют биомассу или число микробных клеток. Прямой способ измерения клеточной массы – это определение веса сухого вещества клеток, содержащихся в определенном объеме культуры, путем отделения их от среды, высушивания и последующего взвешивания. Однако с помощью обычных весов трудно точно определить массу менее 1 мг, а такое количество сухого вещества может содержать до 5 млрд. бактерий. Более удобным методом определения массы одноклеточных микроорганизмов является оптический метод – измерение количества света, рассеянного суспензией клеток. Он основан на том, что рассеяние света мелкими частицами в определённых пределах пропорционально их концентрации, и доля пропущенного света служит мерой оптической плотности суспензии. Измерения проводят с помощью спектрофотометра или фотоэлектроколориметра. Эти приборы показывают единицы оптической плотности, которая представляет собой логарифм отношения интенсивности света, падающего на суспензию, к интенсивности пропущенного света. Нижний предел чувствительности данного метода около 10 млн. клеток в 1 мл. Для определения числа клеток можно использовать микроскопический метод на специальных предметных стёклах – счётных камерах, прямой подсчет клеток с помощью электронного счетчика Коултера и др. Однако чаще подсчет общего количества клеток в суспензии проводят с 18 помощью бактериального стандарта мутности, а также методом Коха высевом микроорганизмов на плотную питательную среду в чашки Петри. Стандарт мутности представляет собой взвешенные в дистиллированной воде частицы стекла диаметром от 0,5 до 3,5 мкм. Взвесь этого стекла при взбалтывании осадка соответствует определенной концентрации клеток. Стандарт состоит из запаянных пробирок-эталонов, эквивалентных по степени мутности 5 и 10 международным единицам мутности (5×108 и 109 кл/мл соответственно). Взвесь помещают в стандартную пробирку и, разбавляя культуру измеренными количествами физиологического раствора, доводят мутность в исследуемой пробирке до эталонной и производят расчёт исходной концентрации микробных клеток. Число жизнеспособных бактерий можно подсчитать после высева их на плотную питательную среду, т.к. живые клетки в процессе роста образуют отдельные колонии, видимые невооруженным глазом. Приготовив разведения бактериальной взвеси и засеяв их на среды, можно определить число живых клеток в исходной суспензии путем подсчёта числа выросших колоний и умножения этой цифры на коэффициент разведения. Этот метод является наиболее чувствительным, т.к. он дает возможность зарегистрировать даже единичную жизнеспособную клетку в суспензии.