Разработана методика синтеза флуоресцентно-меченой ДНК для сборки мононуклеосом с ДНК-линкерами длиной 40 пар нуклеотидов (п.н.). Метки Су3 и Су5 введены в линкеры на расстояниях соответственно 10 п.н. до первого и 15 п.н. после последнего нуклеотида нуклеосом-позиционирующей последовательности ДНК. В отсутствии линкерного гистона Н1.5 исследование методом флуоресцентной микроскопии одиночных комплексов выявило наличие двух равновероятных состояний нуклеосом, отличающихся конформацией ДНК-линкеров: открытой с эффективностью переноса энергии Е между метками, равной 0,06, и закрытой с Е = 0,37, где линкеры сближены. Связывание гистона Н1.5 с нуклеосомами происходит в наномолярном диапазоне концентраций, и скорость образования комплексов существенно выше, чем скорость их диссоциации. В комплексах происходит значительное сближение линкеров (Е = 0,73), а их конформация в области меток становится более единообразной. Разработанные нуклеосомные конструкты являются высокочувствительными флу...
Структура хроматина и доступность ДНК для белков зависят от структуры “линкерной” ДНК, расположенной на входе в нуклеосому и выходе из неё. Поскольку ДНК является отрицательно заряженным полимером, конформация линкерной ДНК, в свою очередь, зависит от ионного микроокружения. В настоящей работе методом флуоресцентной микроскопии одиночных комплексов исследовано влияние ионов Na+ и K+ на структуру линкерной ДНК мононуклеосом. Выявлено, что нуклеосомы находятся в одном из двух конформационных состояний, заселённость которых существенно меняется после замены ионов K+ на Na+. Эти изменения, вероятно, обусловлены различным взаимодействием Na+ и K+ с ДНК в областях входа ДНК в нуклеосому и выхода из неё. Катион-зависимые изменения конформации линкерной ДНК могут менять топологические барьеры в нуклеосоме, структуру полинуклеосомного хроматина и влиять на взаимодействия с различными белковыми факторами.